Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening
15 april 2017
Hier tonen we de generering van humane gemanipuleerde hartweefsel van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een methode om contractiekracht en voorbeeldige verandering van contractie patroon geanalyseerd door hERG kanaal remmer E-4031. Deze werkwijze vertoont een hoge mate van robuustheid en geschiktheid voor cardiale geneesmiddelscreening.
Het algemene doel van deze techniek is om driedimensionale geëngendeerd hartweefsel te genereren dat kan worden gebruikt als een in vitro contractieanalyseplatform voor medicijnscreening en ziektemodellering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het cardiale veld over ziektemodellering, veiligheidsfarmacologie en de effecten van genvarianten of geneesmiddelen op de contractiele kracht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de contractiele kracht kan worden gemeten in geëngendeerd hartweefsel van verschillende soorten onder steriele omstandigheden, gedurende langere perioden.
Wetenschappers die nieuw zijn met deze methode, kunnen worstelen met een gebrek aan cellulaire kwaliteit. Of gebrek aan een in het medium. Het is belangrijk om de zelfvoorbereiding te optimaliseren en cycli te vermijden. Het demonstreren van deze procedure zal Anika Benzin en Umber Saleem zijn.
Voor het begin van de procedure, voeg 1,6 milliliter warme twee procent agarose toe aan de eerste hulpwells van een 24-well plate. Plaats onmiddellijk polytetrafluorethyleen in de ruimtes in de agarose. Na ongeveer 10 minuten op kamertemperatuur wordt de agarose ondoorzichtig, wat zijn verdichting aangeeft.
Verwijder de ruimtes en plaats PDMS-rekken in de gietschalen zodat paar rekposten in elke agarose mal reiken. Wanneer alle rekken zijn geplaatst, suspenderen we de cardiomyocyten in medium bij een minimale concentratie van 1,5 keer 10 tot de zeven cellen per milliliter en vers bereide reconstitutiemix met fibrinogeen 10 tot 15 keer met de serologische pipet tot het fibrinogeenclot is opgelost. Controleer de reconstitutiemix in de pipet op homogeniteit.
Vervolgens voor elk geëngendeerd hartweefsel, of EHT, meng 100 microliters van de reconstitutiemix met drie microliters trombine in een 200 microliter buis. En verdeel onmiddellijk 100 microliters van deze EHT trombinemix in de agarose slots. Gebruik een nieuwe filtertip voor elke EHT.
Zodra alle slots zijn gevuld met reconstitutiemix, sluit u het deksel van de celkweekschaal en incubeer de preparaten gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en zeven procent koolstofdioxide. Aan het einde van de incubatie, plaats de plaat in een steriele kap en bedek elke well met 200 tot 500 microliters medium. Schud de plaat voorzichtig en breng de EHT's terug naar de incubator.
Na 10 minuten, breng de rekken voorzichtig over naar een nieuwe 24-well plate met 1,5 milliliter EHT medium per well en plaats de plaat in een celkweekincubator onder de juiste kweekcondities. Voer de EHT's elke maandag, woensdag en vrijdag, door de PDMS rekken over te brengen naar een tweede plaat met vers medium. Zeven tot 10 dagen na het gieten, zouden de EHT's spontane contracties moeten vertonen die de posten van de PDMS rekken verplaatsen.
Om de contracties van de EHT's te analyseren, zet op de dag van het experiment het verwarmingsapparaat in het EHT-analyse-instrument twee uur voor de meting aan. Onmiddellijk voor de analyse, zet het gas en de elektronische bevoorrading van het assysteem aan. Voor een baseline opname, plaats de EHT plaat in het EHT-analyse-instrument en start de contractieanalysesoftware volgens de instructies van de fabrikant.
Gebruik de handleiding van de software om een nieuwe run te starten, klik op het protocoltab om de relevante studiegegevens in te voeren. Open het setuptab en kies de wells voor analyse. Vanwege tijdsbeperkingen wordt dit alleen gedemonstreerd voor twee EHT's in deze video.
Klik vervolgens op het camerabeeldtab en start de camera livemodus met automatische figuurdetectiemodus. Pas de camerapositie aan met de xyz-coördinaten voor elke geselecteerde well in de 24-well dish, zorg ervoor dat elke EHT in het midden van het venster staat en in focus is. Zorg ervoor dat de blauwe kruisen aan de boven- en onderkant van de EHT's staan en bewegen om de contracties van de EHT's te matchen.
En druk op de knop oké om de ingestelde posities van elke well op te slaan. Klik nu op het parameterstab om de criteria te definiëren waarmee de software een contractiepiek identificeert, markeer de pieken met groene vierkantjes. Sla alle ingevoerde instellingen op door op de knop parameters op alle wells te drukken.
Klik vervolgens op het automatische tab en de startknop om de baseline EHT contracties op te nemen en om de spontane baseline contractiliteit voor elke EHT te berekenen. De live contractieanalyse wordt weergegeven in het realtimetab. Zorg ervoor dat de blauwe kruisen alleen verticaal bewegen om de contracties van de EHT's te matchen.
Om de effecten van een specifiek medicijn van belang op de contracties te analyseren, breng eerst een 24-well plate gevuld met eiwitvrije schildklieroplossing over onder een steriele kap en plaats koolstofelektroden in de wells. Breng de EHT's in hun PDMS rekken bovenop de elektroden en breng de EHT's terug naar de incubator. Na ongeveer een half uur, plaats de EHT's in de interlock van het EHT-analyse-instrument en neem de spontane baseline contractiliteit op voor 20 seconden per EHT.
Verbind vervolgens de koolstofelektroden met de pacingkabel en begin met elektrisch stimuleren van de EHT's. Neem de paced baseline op voor 10 seconden per EHT, zorg ervoor dat alle EHT's goed worden gepaced. Het pacingsignaal wordt nu gemarkeerd door blauwe verticale lijnen, opgenomen in de contractiegrafiek voorafgaand aan elke piek.
Na de baseline opname, breng de elektroden en de PDMS rekken over naar een nieuwe 24-well plate met de eerste drugconcentratie en breng de EHT's onmiddellijk terug naar de interlock van het EHT-analyse-instrument voor een 20 minuten incubatie. Verbind de pacingkabels opnieuw, pas de figuurherkenning aan en neem de EHT contracties op als reactie op de eerste drugconcentratie. Nadat alle drugconcentraties zijn getest, sla alle resulterende PDF-opnamen op en controleer elke opname op figuurherkenning en de juiste positionering van de contractiepiekvierkanten en artefacten.
Voor offline analyse, klik op selecteer run voor de betreffende run uit de runsdatabase en in het parameterstab, wijzig de parameter voor de contractieanalyse. Klik vervolgens in het offlinetab op offline analyse om de video's opnieuw te analyseren. Om de figuurherkenning aan te passen en een nieuw videobestand op te nemen.</
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert de generatie van driedimensionaal engineered hartweefsel uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) voor in vitro contractieanalyse. De methode maakt het mogelijk om de contractiekracht en de impact van farmacologische agentia, zoals de hERG-kanaalinhibitor E-4031, op contractiepatronen te beoordelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Cardiale weefseltechnologie
- Farmacologie
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- Gemodificeerde hartweefsels kunnen hartziekten modelleren.
- In vitro-platforms zijn essentieel voor drugscreening en veiligheidsfarmacologie.
- Het begrijpen van de contractiekracht is cruciaal voor het evalueren van de hartfunctie.
- Uitdagingen omvatten het behoud van de cellulaire kwaliteit en het optimaliseren van de kweekcondities.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een robuuste methode voor het genereren van gemanipuleerd hartweefsel.
- Het analyseren van de effecten van geneesmiddelen op de cardiale contractie.
- Het bieden van een platform voor het bestuderen van genvarianten en hun impact op de hartfunctie.
Gebruikte methoden
- Generatie van gemanipuleerd hartweefsel uit hiPSC-afgeleide cardiomyocyten.
- Meting van de contractiekracht onder steriele omstandigheden.
- Beoordeling van contractiepatronen in reactie op farmacologische agentia.
- Optimalisatie van de kweekcondities voor de cellulaire kwaliteit.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van functioneel gemanipuleerd hartweefsel.
- Aantoonbare verandering van contractiepatronen met E-4031.
- De robuustheid van de methode ondersteunt het gebruik ervan bij drugscreening.
- Potentieel voor langetermijnstudies naar de hartfunctie.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor cardiovasculair onderzoek.
- Het maakt de studie naar drugseffecten op hartweefsel in vitro mogelijk.
- Toekomstige toepassingen omvatten ziektemodellering en veiligheidsfarmacologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Geautomatiseerde contractieanalyse van menselijk ontwikkeld hartweefsel biedt een schaalbaar, gestandaardiseerd platform voor vroege screening van de veiligheid van cardiale geneesmiddelen, waardoor een kwantitatieve beoordeling van de contractiekracht en het risico op geneesmiddelgeïnduceerde aritmie mogelijk wordt. Deze benadering ondersteunt mechanische risicoreductie door menselijke cardiale reacties op farmacologische agentia, zoals hERG-remmers, te repliceren, wat het vertrouwen in de targetvalidatie verhoogt. De methode verbetert de voorspellende waarde bij de identificatie van lead-verbindingen door stamcel-afgeleide modellen te koppelen aan functionele readouts die relevant zijn voor klinische veiligheidsuitkomsten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk via kracht-genererende menselijke hartweefselmodellen die de ziektespecifieke contractiele fysiologie weerspiegelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door drugseffecten op contractiekinetiek en relaxatietijden in een menselijk afgeleid systeem te detecteren.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve gegevens over T2-verlenging en slagirregulariteit om targets met verbeterde cardiale veiligheidsprofielen te prioriteren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gestandaardiseerde, steriele 3D-weefsels in een 24-wells formaat dat compatibel is met geautomatiseerde imaging- en contractieanalyse-workflows.
- Kwantitatieve output: Meet kracht op basis van verkorting via PDMS-postdeflectie, wat dosis-responsbeoordeling van verbindingen zoals E-4031 mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Maakt de generatie van honderden engineered heart tissues per week mogelijk, uitsluitend beperkt door de beschikbaarheid van cardiomyocyten, ter ondersteuning van medium-throughput screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Gebruikt menselijke cardiomyocyten om contractiedynamiek te modelleren, waardoor de translationele aansluiting bij de menselijke hartfunctie wordt verbeterd.
- Mechanische continuïteit: Legt auxotone contracties en relaxatieparameters vast die de elektromechanische koppeling weerspiegelen, wat bijdraagt aan preklinische risicobeoordelingen.
- Ondersteuning bij besluitvorming: Maakt reproductie van door geneesmiddelen geïnduceerde contractieveranderingen mogelijk, wat ten grondslag ligt aan go/no-go-beslissingen tijdens lead-optimalisatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische veiligheidsbeoordeling, en biedt functionele validatie van moleculaire targets in een menselijke weefselcontext.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten op genvarianten en drugeffecten door real-time contractiele kracht in gemanipuleerd menselijk hartweefsel te meten.
- Screening: Levert reproduceerbare, geautomatiseerde contractie-uitlezingen die assay-standaardisatie en compound-screening onder gecontroleerde omstandigheden ondersteunen.
- Analytics: Genereert kwantificeerbare parameters, waaronder contractieamplitude, slagfrequentie en T2-relaxatietijd, voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van menselijke weefsels om in vitro bevindingen te koppelen aan klinische veiligheidsverwachtingen, in het bijzonder voor ionkanaal-liabilities.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor cardiale veiligheidsscreening dat kan worden toegepast op meerdere projecten en targetklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in de cardiale respons op geneesmiddelen te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid en standaardisatie door middel van geautomatiseerde figuurherkenning en gecontroleerde omgevingscondities.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door cardiotoxische verbindingen vroegtijdig te identificeren, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verlaagd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling via kwantitatieve veiligheidssignalen afgeleid van menselijke hartweefselmodellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in cardiac tissue engineering, steriele celcultuur en het hanteren van cardiomyocyten.
- is afhankelijk van imaging-hardware met XYZ-asbesturing en geautomatiseerde software voor figuurherkenning voor de detectie van contracties.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor de generatie van weefsel, blootstelling aan geneesmiddelen en analyseprotocollen voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar verschillende celbronnen of genetische modellen, terwijl de integriteit en functie van het weefsel behouden blijven.
- Beperkt door de beschikbaarheid en rijpingsstatus van cardiomyocyten, wat de contractiele prestaties en de consistentie van de assay beïnvloedt.
