Name: Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer geautomatiseerde contractieanalyse van menselijk engineered hartweefsel voor cardiale drugveiligheidsscreening. Deze methode meet contractiekracht en farmacologische effecten in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar Alessandra Moretti en Dennis Schade voor hun vriendelijke bijdrage van het materiaal. Wij erkennen de grote steun van de iPS en EHT werkgroep bij de afdeling Experimentele Farmacologie en Toxicologie van het UKE. Het werk van de auteurs wordt ondersteund door subsidies van de DZHK (German Center for Cardiovascular Research) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Duitse Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), British National Center for the Replacement Verfijning en Vermindering van Dieren in Onderzoek (NC3Rs BARST-IT verlenen 35.911-259.146), de British Heart Foundation RM / 13/30157, de European Research Council (Advanced Grant IndivuHeart), de Duitse Hartstichting en de Freie und Hansestadt Hamburg.

<ol><li>Laverty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+we+improve+our+understanding+of+cardiovascular+safety+liabilities+to+develop+safer+medicines%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?</a> Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).</li>
<li>Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services
Food and Drug Administration. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf">http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf</a> (2005).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Burridge, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3A+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Mannhardt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Engineered+Heart+Tissue%3A+Analysis+of+Contractile+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force.</a> Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).</li>
<li>Eder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+proarrhythmic+drugs+on+relaxation+time+and+beating+pattern+in+rat+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Bas+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue.</a> Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).</li>
<li>Stöhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+abnormalities+and+altered+drug+response+in+engineered+heart+tissue+from+Mybpc3-targeted+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).</li>
<li>Schaaf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Engineered+Heart+Tissue+as+a+Versatile+Tool+in+Basic+Research+and+Preclinical+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology.</a> PLoS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Hansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-assisted%2C+line-independent+maintenance+of+human+pluripotent+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions.</a> PloS One. 7 (7), e41958(2012).</li>
<li>Lanier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+inhibition+correlates+with+human+embryonic+stem+cell+cardiomyogenesis%3A+A+structure-activity+relationship+study+based+on+inhibitors+for+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response.</a> J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).</li>
<li>Hirt, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+afterload+induces+pathological+cardiac+hypertrophy%3A+a+new+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bas+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model.</a> Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).</li>
<li>Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Tyrosine+Kinase+Inhibitor-Mediated+Decline+in+Contractile+Force+in+Rat+Engineered+Heart+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue.</a> PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).</li>
<li>Friedrich, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+FHL1+as+a+novel+disease+gene+for+isolated+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).</li>
<li>Crocini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+ANKRD1+mutations+associated+with+hypertrophic+cardiomyopathy+on+contraction+parameters+of+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Bas+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue.</a> Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).</li>
<li>Fiedler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Long+Noncoding+RNA-Based+Strategies+to+Modulate+Tissue+Vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization.</a> J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).</li>
<li>van Meer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+absorption+by+PDMS+in+the+context+of+drug+response+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophysl+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays.</a> Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).</li>
<li>Godier-Furnémont, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+force-frequency+response+in+engineered+heart+muscle+by+electromechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation.</a> Biomaterials. 60, 82-91 (2015).</li>
<li>Eng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+beating+rate+adaptation+in+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nat Commun. 7, 10312(2016).</li>
<li>Huebsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+iPS-Cell-Derived+Cardiac+Muscles+for+Physiologically+Relevant+Drug+Response+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses.</a> Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).</li>
<li>Masumoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).</li>
<li>Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Non-myocyte+Cells+Show+Enhanced+Pharmacological+Function+Suggestive+of+Contractile+Maturity+in+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocyte+Microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues.</a> Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durg-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>EHT Technologies GmbH. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
</ol>

IM, TE en AH zijn mede-oprichters van EHT Technologies GmbH, Duitsland.

Engineered hartweefsel biedt een waardevolle optie om de gereedschapskist van het cardiovasculair onderzoek. EHTs in 24 putjes zijn waardevol gebleken voor ziektemodel 8, 14, drugveiligheid screenen 7, 8, 10, 11, 15, of basische cardiovasculair onderzoek 16, <sup cla...

Cardiale bijwerkingen zoals de door drugs veroorzaakte lange QT-syndroom hebben geleid tot de markt nemen van de afgelopen jaren. Statistieken tonen aan dat ongeveer 45% van alle opnames zijn te wijten aan ongewenste effecten op het cardiovasculaire systeem 1. Dit medicijn niet na de dure ontwikkelingsproces en goedkeuring is het worst-case scenario voor farmaceutische bedrijven. Onderzoek en ontwikkeling afdelingen daarom richten op het opsporen van dergelijke ongewenste cardiovasculaire effecten vroeg op. Voor economische en ethische bezwaren, de inspanningen om dierproeven te verminderen en te vervangen door nieuwe in vitro screeningstesten zijn gaande. Een set van gevestigde assays zijn opgenomen in de Verenigde Staten Food and Drug Administration (FDA) en het European Medicines Agency (EMA) richtsnoeren voor preklinische evaluatie van pro-aritmische effecten van geneesmiddelen 2. De technologie van herprogrammering somatische cellen, gevolgd door differentiatie vanhumane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) versterkt dit onderzoeksgebied 3. Het biedt nu de mogelijkheid om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen op de menselijke hartspiercellen in vitro screenen en voorkomt problemen met de inter-species verschillen. Recente cardiale differentiatie protocollen 4, 5 bieden onbeperkt aanbod van hartspiercellen zonder ethische zorg. Echter, het meten van de contractiele kracht, de belangrijkste en best gekarakteriseerd in vivo parameter van hartspiercellen, is niet goed vastgesteld. Dit hangt samen met de relatieve onrijpheid 6 van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) in vergelijking met de volwassen cardiomyocyten. Een mogelijke verbetering te construeren 3-dimensionele hartweefsel van enkelvoudige cellen 7 (engineered hartweefsel EHT). De EHT protocol is gebaseerd op het inbedden één murine of humane hartspiercellen 8 </sup&gt;, 9, 10 in fibrine hydrogel tussen twee flexibele polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten 11 24 putjes. Binnen een paar dagen de hartspiercellen spontaan beginnen te contracteren als enkele cellen en beginnen te cellulaire netwerken te vormen. Na 7-10 dagen, macroscopische contracties van het gehele weefsel zichtbaar. Tijdens dit proces wordt de extracellulaire matrix wordt verbouwd, hetgeen leidt tot een vermindering van diameter en lengte. De verkorting van de EHT resultaten bij het buigen van de PDMS plaatsen zelfs tijdens rust, het onderwerpen van hartspiercellen in de ontwikkelingslanden EHT om continue belasting. EHTs blijven auxotonic spiercontracties te voeren over een aantal weken. Menselijke EHTs tonen respons op fysiologische en farmacologische stimulering vermelding van hun geschiktheid voor drug screening en ziektemodel 7. In dit manuscript presenteren we een robuust en eenvoudig protocol voor de Generatiop menselijke EHT en contractiliteit geautomatiseerde analyse van concentratie afhankelijke veranderingen van de contractie patroon in aanwezigheid van hERG kanaal remmers.

<table><tbody><tr><td>EHT analysis instrument</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>Software is inbegrepen</td></tr><tr><td>EHT PDMS rack</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT PTFE spacer</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>EHT electrode</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT pacing adapter/cable</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>24-well-plate</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>6 well-cell culture plate</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>15 mL falcon tube, graduated&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Sarstedt</td><td>831,830</td><td></td></tr><tr><td>Spinner flask</td><td>Integra</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>70101</td><td>Stel roertoerental op 40 tpm in</td></tr><tr><td>T175 cell culture flask&nbsp;</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>831,812,002</td><td></td></tr><tr><td>V-shaped sedimentation rack&nbsp;</td><td>Custom made at UKE Hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>10&times; DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin-A&nbsp;</td><td>R&amp;D systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS insulin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R&amp;D systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II&nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNase II, type V (from bovine spleen)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen (bovine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Voor coating: 1:200 verdunning</td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca2+/Mg2+&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Life technologies</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Human serum albumin&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, human</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipidmix&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Voor EHT reconstitutiemix.</td></tr><tr><td>N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o MgCl2/CaCl2</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Sodium selenite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Custom made at UKE hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>iCell cardiomyocytes kit</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Pluricyte cardiomyocyte kit</td><td>Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit</td><td>Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Cellartis cardiomyocytes</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>Y10075</td><td></td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde contractie analyse van human engineered hartweefsel voor cardiac drug safety screening

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Hartweefsel techniek beschreven technieken driedimensionale kracht opwekkende gemanipuleerde weefsels vormen. Voor de uitvoering van deze procedures in fundamenteel onderzoek en preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen, is het belangrijk om protocollen voor automatisch genereren en analyses te ontwikkelen onder gestandaardiseerde omstandigheden. Hier presenteren we een techniek om Engineered hartweefsel (EHT) van cardiomyocyten van verschillende species (rat, muis, mens) te genereren. De techniek berust op de montage van een fibrine-gel die gedissocieerd cardiomyocyten tussen elastische polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten in een 24 putjes format. Driedimensionale, kracht opwekkende EHTs vormen binnen twee weken na het gieten. Deze procedure maakt het mogelijk om het genereren van enkele honderden EHTs per week en is technisch alleen beperkt door de beschikbaarheid van hartspiercellen (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluatie van auxotonic spiercontracties wordt uitgevoerd in een gewijzigde incubatiekamer met een mechanical interlock 24-wells platen en een camera bovenop deze kamer. Een software bestuurt een camera bewogen op een XYZ-assenstelsel elke EHT. EHT contracties gedetecteerd worden door een geautomatiseerd figuur algoritme en kracht berekend op basis van verkorting van de EHT en elastische neiging en geometrie van de PDMS posten. Deze procedure maakt het mogelijk voor automatische analyse van grote aantallen EHT onder gestandaardiseerde en steriele omstandigheden. De betrouwbare detectie van effecten van geneesmiddelen op cardiomyociet samentrekking is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van het hart van geneesmiddelen en veiligheid farmacologie. We demonstreren het voorbeeld van het hERG kanaal remmer E-4031, dat het menselijke EHT systeem repliceert drug reacties op contractie kinetiek van het menselijk hart, wat aangeeft dat een veelbelovend voor cardiale drugveiligheid screening.

Cardiale differentiatie en Bereiding van EHT IPSC werden uitgebreid op verkorte groeifactor basaalmembraanmatrix, gedissocieerd met EDTA en embryoid lichamen (EB&#39;s), gevormd in spinner kolven overnacht. Na mesodermale inductie gedurende drie dagen werd cardiale differentiatie gestart met het Wnt-remmer. Na ~ 17 dagen differentiatieprotocol, sloegen EBS gedissocieerd tot afzonderlijke cellen met collagenase type II (fi...

Hier tonen we de generering van humane gemanipuleerde hartweefsel van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een methode om contractiekracht en voorbeeldige verandering van contractie patroon geanalyseerd door hERG kanaal remmer E-4031. Deze werkwijze vertoont een hoge mate van robuustheid en geschiktheid voor cardiale geneesmiddelscreening.

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Het algemene doel van deze techniek is het genereren van driedimensionaal gemanipuleerd hartweefsel dat kan worden gebruikt als een in vitro contractie-analyseplatform voor drugscreening en ziekte modellering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het cardiologische veld over ziekte modellering, veiligheidsfarmacologie en de effecten van genvarianten of geneesmiddelen op de contractiele kracht. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de contractiele kracht in gemanipuleerd hartweefsel van verschillende soorten kan worden gemeten onder steriele omstandigheden gedurende langere perioden.Wetenschappers die nieuw zijn met deze methode kunnen hinder ondervinden van een gebrek aan cellulaire kwaliteit, of een tekort aan een component in het medium. Het is belangrijk om de eigen voorbereiding te optimaliseren en cycli van de procedure te vermijden. Anika Benzin en Umber Saleem zullen deze procedure demonstreren.Voordat u met de procedure begint, voegt u 1,6 milliliters warme twee procent agarose toe aan de buitenste putjes van een 24-wells plaat. Plaats onmiddellijk polytetrafluoretheleen-afstandhouders in de agarose. Na ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur wordt de agarose ondoorzichtig, wat duidt op de stolling ervan.Verwijder de spacers en plaats de PDMS-rekken in de gietvormen, zodat paren rekpalen in elke agarosemal reiken. Wanneer alle rekken zijn geplaatst, suspenderen we de cardiomyocyten in medium met een minimale concentratie van 1,5 x 10⁷ cellen per milliliter en vers bereid reconstitutiemengsel met fibrinogeen 10 tot 15 keer met de serologische pipet totdat het fibrinogeenstollingssel is opgelost. Controleer het reconstitutiemengsel in de pipet op homogeniteit.Meng vervolgens voor elk engineered heart tissue, of EHT, 100 µL reconstitutiemix met 3 µL trombine in een buisje van 200 µL. Verdeel onmiddellijk 100 µL van dit EHT-trombinemengsel over de agarose-slots. Gebruik voor elke EHT een nieuwe filtertip.Zodra alle slots zijn gevuld met het reconstitutiemengsel, wordt het deksel van de celkweekschaal gesloten en worden de preparaten twee uur geïncubeerd bij 37 °C en 7% koolstofdioxide. Na afloop van de incubatie wordt de plaat in een steriele zuurkast geplaatst en wordt elke put bedekt met 200 tot 500 µL medium. Schud de plaat voorzichtig en plaats de EHT's terug in de incubator.Breng de racks na 10 minuten voorzichtig over naar een nieuwe 24-wells plaat die per well 1,5 milliliters EHT-medium bevat en plaats de plaat in een celkweekincubator onder de juiste kweekcondities. Voed de EHT's elke maandag, woensdag en vrijdag door de PDMS-racks over te brengen naar een tweede plaat met vers medium. Zeven tot 10 dagen na het gieten zouden de EHT's spontane contracties moeten vertonen die de posts van de PDMS-racks doen uitwijken.Om de contracties van de EHT te analyseren, dient u op de dag van het experiment het verwarmingsapparaat in het EHT-analyse-instrument twee uur voor de meting in te schakelen. Zet vlak voor de analyse de gas- en elektronische voorzieningen van het assysteem aan. Plaats voor een basislijnmeting de EHT-plaat in het EHT-analyse-instrument en start de software voor contractieanalyse volgens de instructies van de fabrikant.Volg de instructies in de softwarehandleiding om een nieuwe run te starten en klik op het tabblad protocol om de relevante studie-informatie in te voeren. Open het tabblad set up en selecteer de wells voor analyse. Vanwege tijdgebrek wordt dit in deze video slechts gedemonstreerd voor twee EHT's.Klik vervolgens op het tabblad camerabeeld en start de live-modus van de camera met de automatische figuurdetectiemodus. Pas de camerapositie aan met de xyz-coördinaten voor elke geselecteerde put in de 24-puts plaat, waarbij u erop let dat elke EHT in het midden van het venster en in focus staat. Zorg ervoor dat de blauwe kruisen zich aan de boven- en onderkant van de EHT's bevinden en meebewegen met de contracties van de EHT's.Druk vervolgens op de knop 'position okay' om de ingestelde posities van elke put op te slaan. Klik nu op het tabblad 'parameters' om de criteria te definiëren waarmee de software een contractiepiek identificeert, waarbij de pieken worden gemarkeerd met groene vierkantjes. Sla alle ingevoerde instellingen op door op de knop 'use parameters on all wells' te drukken.Klik vervolgens op het tabblad 'automatic' en op de startknop om de baseline EHT-contracties op te nemen en de spontane baseline contractiliteit voor elke EHT te berekenen. De live contractieanalyse wordt weergegeven in het tabblad 'real time'. Controleer of de blauwe kruizen alleen verticaal bewegen om overeen te komen met de contracties van de EHT's.Om de effecten van een specifiek geneesmiddel van belang op de contracties te analyseren, brengt u eerst een 24-well plaat gevuld met eiwitvrije schildklieroplossing over naar een steriele zuurkast en plaatst u koolstofelektroden in de wells. Plaats de EHT's in hun PDMS-rekken bovenop de elektroden en breng de EHT's terug naar de incubator. Plaats de EHT's na ongeveer een half uur in de sluis van het EHT-analyse-instrument en registreer de spontane baseline-contractiliteit gedurende 20 seconden per EHT.Sluit vervolgens de koolstofelektroden aan op de pacingkabel en begin met het elektrisch stimuleren van de EHT's. Registreer de gepacede baseline gedurende 10 seconden per EHT, waarbij u erop let dat alle EHT's correct gepaced worden. Het pacingsignaal wordt nu aangegeven door blauwe verticale lijnen, die in de contractiegrafiek vóór elke piek zijn opgenomen.Na de baseline-opname worden de elektroden en de PDMS-rekken overgebracht naar een nieuwe 24-wells plaat met de eerste drugconcentratie, waarna de EHT's onmiddellijk worden teruggeplaatst in de interlock van het EHT-analyse-instrument voor een incubatie van 20 minuten. Sluit de pacing-kabels opnieuw aan, pas de figuurherkenning aan en registreer de EHT-contracties als reactie op de eerste drugconcentratie. Nadat alle drugconcentraties zijn getest, worden alle resulterende PDF-opnamen opgeslagen en wordt elke opname gecontroleerd op de figuurherkenning en de juiste positionering van de contractiepiek-vierkanten en artefacten.Klik voor offline analyse in de runs-database op select run voor de betreffende run en wijzig in het tabblad parameter de parameter voor de contractieanalyse. Kies vervolgens in het tabblad offline voor offline analysis om de video's opnieuw te analyseren. Om de figuurherkenning aan te passen en een nieuw videobestand op te nemen.Pas de figuurerkenning in het tabblad 'real time' aan en selecteer 'sample review'. De EHT zal nu worden geanalyseerd volgens de nieuwe posities. De analyse van elke EHT is gebaseerd op figuurerkenning aan de boven- en onderkant van het weefsel.De gefilmde EHT-contracties worden vervolgens automatisch geanalyseerd door het softwarealgoritme van het EHT-analyse-instrument en de pieken worden bepaald volgens de relevante vooraf gedefinieerde criteria. De langetermijnmeting van de EHT-contractieanalyse laat zien dat er tot 20 uur geen duidelijke tijdsafhankelijke veranderingen zijn in de contractiekracht, slagfrequentie, T1-contractie- of T2-relaxatietijden. Dit duidt op een hoge mate van stabiliteit van de constructen.Inderdaad, de resultaten voor elke EHT-signaal zijn reproduceerbaar met een lage variabiliteit. Blootstelling aan een hERG-kanaalblokker resulteert echter in een significante verlenging van de T2-relaxatietijd, beginnend bij de concentratie, en een onregelmatig slagpatroon bij hogere concentraties.Zodra de methode onder de knie is, kunnen er binnen 30 minuten 24 EHT's worden gegenereerd, mits de preparatie correct wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van ziekte Modellering om het effect van genvarianten in vitro te onderzoeken. De veelzijdigheid van dit model maakt het mogelijk om dit te combineren met menselijke geïnduceerde stamcellen of genoomredigeringstechnologie.Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals histologie of RNA- en proteïneanalyse, worden gebruikt om verdere vragen over gentranscriptie en -expressie te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe EHT's gegoten en geanalyseerd kunnen worden. Mocht u vragen hebben over deze procedure, aarzel dan niet om direct contact met ons op te nemen.

automated-contraction-analysis-human-engineered-heart-tissue-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Spontaan verdragsluitende syncytia van cardiomyocytes afgeleid van mens-geïnduceerde pluripotente zijn stamcellen nuttige modellen van menselijke cardiale fysiologie en farmacologie. Hier presenteren we een high-throughput screening systeem voor het kwantificeren van de effecten van exogene verbindingen op het verslaan van de frequentie, met behulp van een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof en een temperatuurgevoelig imaging multi goed afleesapparaat.

Contracties van mens-iPSC-afgeleide Cardiomyocyte Syncytia gemeten met een Ca-gevoelige fluorescente kleurstof in temperatuurgevoelig 384-Wells-platen

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

De analyse van veranderingen in contractiele functie en cellulaire integriteit van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten is van immens belang voor de ontwikkeling van niet-klinische geneesmiddelen. Een hybride 96-well celanalysesysteem behandelt beide parameters op een real-time en fysiologische manier voor betrouwbare, voor de mens relevante resultaten, die nodig zijn voor een veilige overgang naar klinische stadia.

Hybride celanalysesysteem om structurele en contractiele veranderingen van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te beoordelen voor preklinische cardiale risico-evaluatie

Driedimensionale hartweefsels die bio-engineered zijn met behulp van van stamcellen afgeleide cardiomyocyten zijn naar voren gekomen als veelbelovende modellen voor het bestuderen van gezond en ziek menselijk myocardium in vitro , terwijl ze de belangrijkste aspecten van de inheemse cardiale niche recapituleren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het vervaardigen en analyseren van gemanipuleerde hartweefsels met een hoog gehalte die zijn gegenereerd uit door de mens geïnduceerde...

Ontwerp van een bioreactor om de data-acquisitie en modeldoorvoer van gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren

Dit protocol beschrijft hoe contractiliteit in volwassen menselijke primaire cardiomyocyten van donorharten kan worden gemeten met het MyoBLAZER-systeem, een betrouwbaar platform voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in contractiliteit tijdens preklinische ontwikkeling.

Meting van hartcontractiliteit in geïsoleerde volwassen menselijke primaire cardiomyocyten

Dit protocol biedt methoden voor het genereren van 3D-gemanipuleerde hart- en skeletspierweefsels en beschrijft het gebruik ervan in preklinische screeningsmodaliteiten voor geneesmiddelen. De beschreven methoden maken gebruik van een magnetisch detectiesysteem om de gelijktijdige beoordeling van 24 weefsels parallel te vergemakkelijken.

Preklinische geneesmiddelentests in schaalbare 3D-gemanipuleerde spierweefsels

Hier demonstreren we een niet-invasieve contractiliteitsevaluatiemethode voor cardiale medische hulpmiddelen met behulp van 2D-door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM) monolagen, verguld op een flexibel substraat, gekoppeld aan videogebaseerde microscopie. Deze tool zal nuttig zijn voor de in vitro evaluatie van de contractiele eigenschappen van cardiale elektrofysiologische apparaten.

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Er wordt een reproduceerbare methode gepresenteerd om 3D-myocardiale weefsels te genereren die smelt-elektrospinnende schrijf- (MEW), polycaprolacton (PCL)-steigers en fibrinehydrogels combineren met hiPSC-afgeleide cardiomyocyten en fibroblasten. Deze techniek biedt nauwkeurige controle over de steigerarchitectuur en kan worden toegepast bij preklinische geneesmiddelentests en modellering van hartaandoeningen.

3D generatie van menselijk myocardweefsel met behulp van smeltelektrospinning schrijven van polycaprolactonsteigers en hiPSC-afgeleide hartcellen

Leer geautomatiseerde contractieanalyse van menselijk engineered hartweefsel voor cardiale drugveiligheidsscreening. Deze methode meet contractiekracht en farmacologische effecten in vitro.

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

Meer video's verkennen