Name: Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer hoe je hoog moleculair gewicht genomisch DNA isoleert van echte meeldauw voor long-read sequencing. Deze methode maakt hoogwaardige extractie mogelijk van moeilijk te bewerken pathogenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol werd ontwikkeld ter ondersteuning van een Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). Het werk werd onder meer ondersteund door de Philomathia Foundation, de National Science Foundation (#0929226) en het Energy Biosciences Institute voor S. Somerville; en door Swiss National Science Foundation (#310030_163260) voor B. Keller. We willen onze collega's bedanken, M. Figureroa en M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) en S. Xiao (University of Maryland) voor hun genereuze adviezen en voor het vrijwillig delen van hun protocollen terwijl we het hier beschreven protocol ontwikkelden.

1. Bereiding van schimmelmateriaal <ol><li> Het kweken van echte meeldauw <ol><li> Planten groeien in groeikamers de volgende omstandigheden: 22 ° C dagtemperatuur 20 ° C nachttemperatuur, 80% relatieve vochtigheid, 14-h daglengte en een lichtintensiteit van 125 uE / m 2 / s (geleverd door fluorescentielampen ). </li><li> Infect komkommerplanten (Cucumis sativa variëteit Bush Champion) met Golovinomyces cichoracearum stam UCSC1 beschreven 18, 29. </li></ol></li><li> Oogsten echte meeldauw Conidia <ol><li> Oogst conidia uit geïnfecteerde planten op 7-10 dagen na inoculatie met een kleine vacuüm met een in-lijn filter (11 pm) waarop de conidia ophopen. Licht aandrukt, voert het vacuüm mondstuk langs het oppervlak van het blad aan de conidia verzamelen. OPMERKING: De gemiddelde opbrengst van G. cichoracearum 20 mg conidia van een zwaar InfeCTED komkommerblad van circa 130 cm2 in oppervlak. </li><li> Borstel ongeveer 150 mg van de conidiën (ongeveer 375 pl volume of conidia 7-8 geïnfecteerde komkommerbladeren) van het filter op een vel schoon papier. Vanaf hier overbrengen conidia in 2 ml cryovials met twee 5/32 inch diameter vooraf gekoelde (in vloeibare stikstof) stalen maalkogels. Onmiddellijk buizen terug naar vloeibare stikstof. WINKEL buisjes bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Breaking Open Conidia door Ball Frezen <ol><li> Flash-bevriezen aluminiumplaten van kogelmolen in vloeibare stikstof. Load cryovials in kogelmolenstof rack. Schud de cryoflesjes met conidia en stalen ballen in de kogelmolen gedurende 30 seconden bij 30 cycli / s (bij kamertemperatuur). Onmiddellijk cryovials opnieuw invriezen in vloeibare stikstof. OPMERKING: Aanvankelijk toegang tot een deel van conidia met microscopie bij 100X vergroting voor efficiëntie van de celwand breuk tijdens het slijpen. Indien nodig, slijpen voor een extra 1 - 2 rondes van 30 en 30 cycli / s, but houden het aantal ronden tot een minimum. Routine beoordeling van conidiale breuk met behulp van microscopie in dit stadium niet nodig is zodra optimale omstandigheden zijn vastgesteld. </li></ol></li></ol> 2. Genomic DNA Purification <ol><li> conidia Lysis <ol><li> Werken snel ontdooien conidia voorkomen, verwijder de stalen kogels van cryovials met een magneet. Voeg 700 ul 65 ° C lysisbuffer (tabel 1) en vortex 5-10 s tot een slurry gevormd. </li><li> Voeg 300 ul voorverwarmde (65 ° C) 5% (v / v) sarcosyl en voorzichtig omkeren te mengen (1 inversie per 3S) vijfmaal. Incubeer buizen gedurende 30 minuten bij 65 ° C; keren voorzichtig 3 keer met 10, 20 en 30 minuten. Met behulp van een brede boring pipetpunt, dragen volledige oplossing op nieuwe 2 ml microcentrifugebuis. In alle volgende stappen meng door voorzichtig en langzaam omkeren en het DNA-bevattende oplossingen over te dragen met brede boring pipetpunten. </li></ol></li><li> DNA Extraction I <ol><li> Voeg 1 volume van chloorvorm: isoamylalcohol (24: / v 1 v) om de lyse-oplossing en voorzichtig omkeren vijfmaal mengen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voorzichtig inverteren tot vijf keer mengen tegen halverwege en opnieuw aan het einde van de incubatie. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 14.000 x g. Gebruik brede boring pipetpunt voorzichtig Breng de waterige nieuwe 2 ml microcentrifugebuis; voorkomen waaronder materiaal uit de interface. </li></ol></li><li> DNA Neerslag I <ol><li> Voeg 1 volume kamertemperatuur 100% isopropanol (bij benadering 750 pi) en voorzichtig omkeren zes keer mengen. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 14.000 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant af en gooi. </li><li> Voeg 450 ul voorgekoelde (-20 ° C) 70% ethanol. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 14.000 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant af en gooi. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 seconden, verwijder het supernatant met fijne pipetpunt en weggooien. Lucht-droog de pellet gedurende 15 min eent kamertemperatuur. Drogen niet langer dan 15 min. </li><li> Resuspendeer de pellet in 300 ui TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur, pH 8,0). Incubeer overnacht bij 4 ° C. Veeg voorzichtig om het resterende materiaal dat niet in oplossing gingen mengen. </li></ol></li><li> RNA verontreinigingen te verwijderen, wordt 10 ul RNase A (10 mg / ml). Voorzichtig omkeren tot drie keer mengen. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 seconden. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> II DNA Extraction <ol><li> Voeg 300 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1 v / v) en voorzichtig omkeren vijfmaal mengen. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur voorzichtig inverteren tot vijf keer mengen tegen halverwege en opnieuw aan het einde van de incubatieperiode. Centrifugeer 15 minuten bij kamertemperatuur bij 14.000 x g. Met behulp van een brede boring pipetpunt, breng de supernatant nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. </li></ol></li><li> DNA Neerslag II <ol><li> Voeg 0,01 volume 3 M natriumacetaat pH 5,2 (approximately3 pl) voorzichtig omkeren vijfmaal mengen. Voeg 2,5 volumes voorgekoelde (-20 ° C) 100% ethanol (ongeveer 750 ui). Voorzichtig omkeren tot vijf keer te mengen. Incubeer overnacht bij -20 ° C </li><li> Centrifugeer 30 minuten bij 4 ° C bij 14.000 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant af en gooi. </li><li> Voeg 450 ul voorgekoelde (-20 ° C) 70% ethanol. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C bij 14.000 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant af en gooi. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 seconden. Verwijder voorzichtig het supernatant met fijne pipet tip en gooi. </li><li> Lucht-droog de pellet gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 27,5 ul TE. Incubeer overnacht bij 4 ° C. Veeg voorzichtig om het resterende materiaal dat niet in oplossing gingen mengen. </li><li> Aliquot 2,5 ul in 22,5 pl TE (eindvolume 25 pl) voor kwaliteitscontroles (zie hieronder). WINKEL DNA monsters bij 4 ° C tot indiening van sequencing. Voor langdurige opslag, opslag samplesbij -80 ° C en het minimaliseren van vries-dooi cycli te scheren voorkomen. LET OP: Wees voorzichtig bij het pipetteren bij deze stap als het hoge gewicht genomische DNA molecuul kan moeilijk zijn om goed te pipet, en het is belangrijk om ervoor te zorgen dat &quot;QC Aliquot&quot; is een nauwkeurige weergave van genoom-DNA-monster. </li></ol></li></ol> 3. Quality Control <ol><li> sample Purity <ol><li> Gebruik een TE leeg beoordeelt het monster zuiverheid van het DNA door het laden van 1 pl van de QC Aliquot een klein volume spectrofotometer. Record A260 / A280 en A260 / A230 lezingen. Zuiver DNA zal een A260 / A280-verhouding van ongeveer 1,8 en A260 / A230-verhouding tussen 1,8 en 2,2 hebben. </li></ol></li><li> Kwantificering van genomisch DNA <ol><li> Voeren kwantificering van QC monster onder toepassing van een commerciële dubbelstrengs DNA kwantificatie assay kit volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> DNA Quality Assessment I <ol><li> Load ongeveer 60 ng genomisch DNA enDNA ladder op een 0,7% agarosegel in 1 x TAE (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA, pH 8,0). Draaien gelapparaat bij 70 V gedurende 40-45 min tot genomisch DNA banden 2 cm van de bron en bandopsplitsing in de ladder blijkt. Deze voorwaarden moeten mogelijk worden aangepast op basis van beschikbare gelelektroforese inrichting. </li></ol></li><li> DNA Quality Assessment II <ol><li> Load ongeveer 60 ng genomisch DNA en een hoogmoleculair DNA-ladder molecuulgewicht (geschikt voor pulsed-field gelelektroforese) op een 1% agarosegel in 0,5 x TBE (44,5 mM Tris, 44,5 mM boorzuur, 1 mM EDTA, pH 8,3) en uitgevoerd in 0,5 x TBE loopbuffer gebruikmaking van een 5-80 kbp golfvorm pulsed-field gelelektroforese protocol voor 16 uur. </li></ol></li><li> Evaluatie van bacteriële, schimmel, en Plant Contaminanten <ol><li> Uitvoeren van polymerase kettingreactie (PCR) om de juiste interne getranscribeerde afstandhouder (ITS) gebieden van de ribosomale genen onder gebruikmaking van primers en amplificatie condities lijst amplificerened in tabel 2. Belasting 10 pi van het verkregen reactiemengsel op een gel. OPMERKING: Een band die het echte meeldauw ITS regio moet worden versterkt met de schimmel ITS primers. DNA van deze amplicon en elke amplicon gegenereerd met bacteriële of plantaardige primers worden gesequenced om de oorsprong van de verontreiniging te bepalen. Alleen echte meeldauw ITS sequenties moeten worden gevonden in de schimmel amplicon. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , 4th, Academic Press. (1969).</li>
<li>Braun, U., Cook, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBraun%2C+U+%22Taxonomic+manual+of+the+Erysiphales+%28Powdery+Mildews%29%22">Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews)</a>. , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).</li>
<li>Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+Blumeria+graminis+indicate+dynamic+changes+to+primary+metabolism+during+development+of+an+obligate+biotrophic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen.</a> Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).</li>
<li>Glawe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+powdery+mildews%3A+A+review+of+the+world%27s+most+familiar+%28yet+poorly+known%29+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).</li>
<li>Fabro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profiling+Arabidopsis+at+the+stage+of+Golovinomyces+cichoracearum+haustorium+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).</li>
<li>Hückelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).</li>
<li>Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+a+specialized+plant-fungal+interface+during+host+cell+internalization+of+Golovinomyces+orontii+haustoria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria.</a> Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).</li>
<li>Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+Arabidopsis+cells+at+the+powdery+mildew+infection+site+reveals+site-specific+processes+and+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators.</a> Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).</li>
<li>Spanu, P. D., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powdery+mildew+genomes+in+the+crosshairs%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Powdery mildew genomes in the crosshairs.</a> New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).</li>
<li>Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Podosphaera+xanthii+by+electroporation+of+conidia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia.</a> BMC Microbiol. 15 (20), (2015).</li>
<li>Hacquard, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHacquard%2C+S+%22Advances+in+Botanical+Research%22">Advances in Botanical Research</a>. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).</li>
<li>Spanu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+expansion+and+gene+loss+in+powdery+mildew+fungi+reveal+tradeoffs+in+extreme+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism.</a> Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).</li>
<li>Wicker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+powdery+mildew+genome+shows+the+unique+evolution+of+an+obligate+biotroph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph.</a> Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).</li>
<li>Jones, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+genomic+structural+variation+in+the+grape+powdery+mildew+pathogen%2C+Erysiphe+necator%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator.</a> BMC Genomics. 15, 1081(2014).</li>
<li>Thomma, B. P. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+seven+reasons+to+close+fragmented+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies.</a> Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).</li>
<li>Parlange, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+invasion+of+transposable+elements+accounts+for+the+large+size+of+the+Blumeria+graminis+f.sp.+tritici+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome.</a> Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Faino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+real-time+sequencing+combined+with+optical+mapping+yields+completely+finished+fungal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome.</a> mBio. 6, (2015).</li>
<li>Adam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Erysiphe+cichoracearum+and+E.+cruciferarum+and+a+survey+of+360+Arabidopsis+thaliana+accessions+for+resistance+to+these+two+powdery+mildew+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens.</a> Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).</li>
<li>Bourras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+avirulence+loci+and+allele-specific+effector+recognition+control+the+PM3+race-specific+resistance+of+wheat+to+powdery+mildew%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew.</a> Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).</li>
<li>Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf</a> (2016).</li>
<li>Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf</a> (2014).</li>
<li>Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plant+genotyping+II%3A+SNP+technology%22">Plant genotyping II: SNP technology</a>. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).</li>
<li>Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+a+simple+method+for+extracting+next-generation+sequencing+quality+genomic+DNA+from+recalcitrant+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species.</a> Plant Methods. 10 (21), (2014).</li>
<li>Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+inexpensive+method+for+removing+polysaccharides+from+plant+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA.</a> Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).</li>
<li>Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+CTAB+and+TRIzol+protocols+improve+RNA+extraction+from+chemically+complex+Embryophyta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta.</a> Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).</li>
<li>Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+method+for+high+quality+co-extraction+of+genomic+DNA+and+total+RNA+from+low+biomass+Ectocarpus+siliculosus%2C+the+model+brown+alga%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga.</a> PLoS One. 9 (5), e96470(2014).</li>
<li>Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+powdery+mildew+disease+resistance+in+the+Arabidopsis+thaliana+accession+Kashmir-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1.</a> Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).</li>
<li>User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. 
 <a target="_blank" href="http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf">http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om zuivere, hoogmoleculair genomisch DNA te verkrijgen uit de obligate biotrofe meeldauw schimmels, een gemodificeerde versie van eerder beschreven werkwijzen ontwikkeld 30. De gemiddelde opbrengst met deze geoptimaliseerde protocol 7 ug DNA per 150 mg conidia, een verdubbeling van de opbrengst verkregen met een vooraf protocol. Ook de gemiddelde grootte steeg van ongeveer 20 kbp tot meer dan 48,5 kbp. Dit protocol werd geoptimaliseerd in cucumber- G. cichoracearum systeem. Om de beste k...

<html> Poedermeeldauw een groep obligate biotrofe schimmelplantenpathogenen die, wanneer samengenomen, zijn de belangrijkste oorzaak van plantenziekten wereldwijd 1. Er zijn meer dan 900 beschreven soorten van echte meeldauw, die taxonomisch zijn gegroepeerd in vijf stammen binnen de familie Erisyphaceae 2. Als gevolg van zowel het economisch belang en de intieme relatie die zij ontwikkelen met hun gastheren, hebben echte meeldauw ziektes onderwerp van onderzoek voor&gt; 100 jaar. Na infectie, echte meeldauw ontlokken drastische veranderingen in de celstructuur, het metabolisme en moleculaire biologie van hun gastheren, om deze ziekteverwekker ten goede komen. Echter, de studie van echte meeldauw is een bijzondere uitdaging als gevolg van hun obligate lifestyle, en de groei van de schimmel in zuivere cultuur is nog niet beschreven 3, 4, 5,&quot;xref&quot;&gt; 6, 7, 8. Betrouwbare, stabiele genetische transformatie van poederige meeldauw is ook nog niet voltooid hoewel transiënte transformatie gemeld bij sommige soorten 9, 10. De sequentiebepaling en assemblage van meeldauw genomen is moeilijk gebleken vanwege een aantal kenmerken van het genoom zelf. Echte meeldauw genomen zijn groot (120-180 Mbp) ten opzichte van andere schimmels genomen, en bestaan uit 60-90% gelijkmatig repetitieve elementen 11. Deze elementen omvatten niet-lange terminale herhalingen, alsook uncategorized repetitieve elementen. Twee formae speciales van een echte meeldauw soorten, Blumeria graminis f. sp. hordei en f. sp. tritici (BGH en Bgt respectievelijk) alsmede de druif echte meeldauw Erysiphe necator, LEVn gesequenced en voorstellen genomen voor verscheidene andere zijn afgerond 12, 13, 14. Het repetitieve aard van de genomen samenstel heeft bemoeilijkt en de voltooide BGH genoom geassembleerd tot 6989 supercontigs een L50 2 Mb 12. Ondanks de grote genoom, het poedervormige meeldauw blijken een klein aantal eiwitten coderende genen, met 5.845 en 6.540 genen voorspeld BGH en Bgt resp. De sequentie poederige meeldauw blijken ook ten minste 99 kern genen die essentieel andere schimmels, die in overeenstemming met de afhankelijkheid van de schimmels op de waardplant te overleven 11, 12, 13, 14 ontbreekt. Repetitieve sequenties nabij telomeren, centromeren, ribosomaal RNEen gen arrays en gebieden verrijkt transponeerbare elementen zijn slecht samengesteld uit korte gelezen sequencing strategieën en vaak ondervertegenwoordigd in genoom samenstellen 15. Dergelijke gebieden worden verondersteld verantwoordelijk voor veel van de spleten die zich in genoomsequenties zijn, en dit geldt voor het poedervormige meeldauw hun omvangrijke uitbreiding van repetitieve elementen 16. Sterk plastic genoomgebieden worden vaak in dergelijke herhalende gebieden 3. Ze dienen als een plaats van chromosoomherschikkingen vaak coderen voor genen onder sterk selectieve druk, zoals de genen die coderen effector eiwitten en de genen die coderen voor enzymen van secundair metabolisme. Vooruitgang in single-molecule lange lezen sequencing technologieën een mogelijke oplossing voor het rangschikken in herhaalde gebieden van genomen 15. B.v. Faino et al. (2015) gevonden dat het opnemen van de lange sequentie gelezen technologieën en optische mapping konden ze een gat-loze genoomsequentie te produceren voor twee stammen van de schimmel plantenpathogeen Verticillium dahlia, verdrievoudigde het percentage herhalende DNA sequenties in het genoom, waardoor het aantal gen annotaties (en vermindering van het aantal partiële of ontbrekende gen annotaties ) en onthullende genoomomleggingen 17. Om deze lange-lezen sequencing technologie, hoge concentraties van hoge kwaliteit genoom DNA, in dienst nemen met minimale afmetingen&gt; 20 kbp, nodig zijn. Hier beschrijven we onze methoden voor conidial collectie, zuivering van hoog moleculair gewicht DNA van conidia en onze kwaliteitscontrole assessments met behulp van de echte meeldauw soorten Golovinomyces cichoracearum geteeld op komkommer 18. Dit protocol is gebaseerd op een protocol ontwikkeld in het laboratorium groep B. Keller (Universiteit van Zürich, Zürich Switzerland) 13, 19en bevat diverse modificaties die leidden tot verhoogde DNA opbrengsten en een groter deel van DNA&gt; 48,5 kbp in grootte. Het protocol bevat ook kwaliteitscontrole stappen basis van aanbevelingen van het Amerikaanse ministerie van Energie Joint Genome Institute 20, 21, 22. De functie van elk reagens in de lysisbuffer, en de reden voor elke zuiveringsstap, worden beschreven in Henry (2008) 23. Beschikbare gepubliceerde protocollen voor isolatie van hoogmoleculair genomisch DNA van planten en micro weefsels werden geraadpleegd bij het ontwerpen van dit protocol 24, 25, 26, 27, 28.

<table><tbody><tr><td>MM400 kogelmolen</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>Of gelijkwaardige kogelmolen</td></tr><tr><td>2 mL buisjes voor kogelmolen</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>5/32" roestvrijstalen molenbollen</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Microprocessorgestuurd 280 Series Waterbad Vooringesteld op 65 &deg;C&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Of gelijkwaardig waterbad</td></tr><tr><td>Microprocessorgestuurd 280 Series Waterbad Vooringesteld op 37 &deg;C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Of gelijkwaardig waterbad</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R gekoelde microcentrifuge</td><td>Krakeler Scientific&nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>Of gelijkwaardige microcentrifuge</td></tr><tr><td>Chlorform:IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0549</td><td>Gevaarlijk bij huidcontact of inademing. Draag nitrilhandschoenen, beschermende bril, laboratoriumjas en werk in chemische kap</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>Gevaarlijk bij huidcontact of inademing. Draag nitrilhandschoenen, beschermende bril, laboratoriumjas en werk in chemische kap</td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34923</td><td>Voor gebruik koelen tot -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnase, Dnase-vrij (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Kaliummetabisulfiet</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>Natriumlaurylsacrosinaat</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Etheen-diaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell Futura veiligheidsbril S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>Of gelijkwaardige veiligheidsbril</td></tr><tr><td>High Five COBALT nitrilhandschoenen, GROOT</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>Of gelijkwaardige handschoenen</td></tr><tr><td>GelRed Nucleïnezuur Gel Stain 10.000x in water</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>Gevaarlijk bij huidcontact. Draag nitrilhandschoenen en beschermende bril</td></tr><tr><td>Agarose Ultrapure Bioreagent</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF DNA maatstaven</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>Of gelijkwaardig pulse-field gel apparaat</td></tr><tr><td>Whatman kwalitatief filterpapier, Klasse 1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>Of gelijkwaardige groeikamer</td></tr><tr><td>Percival Groeikamer</td><td>Percival</td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>Of gelijkwaardige spectrofotometer</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer (Tris-acetaat-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>Verdun 1/50 met water voor gebruik (tot 1x)</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-boraat-EDTA, 10x oplossing (elektroforese)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>Verdun 1/10 met water voor gebruik (tot 1x)</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td>Vloeibare stikstof (-196 &deg;C) is een bevriezingsgevaar. Het zal ook snel uitzetten bij opwarming en mag niet in een goed gesloten container worden bewaard</td></tr></tbody></table>

zuivering van hoog molecuulgewicht genomic dna van echte meeldauw voor long-read sequencing

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

De echte meeldauw schimmels zijn een groep van economisch belangrijke schimmelplantenpathogenen. Er is relatief weinig bekend over de moleculaire biologie en de genetica van deze ziekteverwekkers, voor een deel te wijten aan een gebrek aan goed ontwikkelde genetische en genomische hulpbronnen. Deze organismen hebben grote, herhalende genomen, die genoom en assemblage onbetaalbaar moeilijk hebben gemaakt. We beschrijven hier werkwijzen voor het verzamelen, extraheren, zuivering en kwaliteitscontrole evaluatie van hoogmoleculair genomisch DNA molecuul van een echte meeldauw soorten, Golovinomyces cichoracearum. De beschreven protocol bevat mechanisch afbreken van sporen, gevolgd door een geoptimaliseerde fenol / chloroform genomisch DNA extractie. Een typische opbrengst was 7 ug DNA per 150 mg conidia. Het genomische DNA dat geïsoleerd is middels deze werkwijze zijn geschikt voor het lezen sequencing (bijv:&gt; 48,5 kbp). Kwaliteitscontrolemaatregelen de grootte, opbrengst en zuiverheid van het genomische DNA waarborgen ookbeschreven in deze werkwijze. Sequentiebepaling van het genomische DNA van de hier beschreven kwaliteit zal zorgen voor de montage en vergelijking van meerdere meeldauw genomen, wat op zijn beurt zal leiden tot een beter begrip en een betere controle van de agrarische ziekteverwekker.

Een representatief voorbeeld van 60 ng gezuiverd genomisch DNA uit G. cichoracearum over agarose gel met gelelektroforese en gebruiken gepulseerd veld gelelektroforese worden getoond in Figuren 1 en 2 respectievelijk. Genomisch DNA preparaten die, marginaal passeren passeren en niet kwaliteitscontrole worden weergegeven. Genomisch DNA preparaten die kwaliteitscontrole volledig passen ideaal voor sequentiebepaling met behulp van ...

Hier wordt een methode beschreven voor de extractie, zuivering en kwaliteitscontrole van genomisch DNA van de obligate biotrofe schimmelpathogeen, echte meeldauw, voor gebruik in genoomsequencing met lange reads.

Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Het algemene doel van dit protocol is het isoleren van genomisch DNA met een hoog moleculair gewicht uit haploïde conidiën van meeldauw voor long-read genoomsequencing. Deze methode kan sleutelvragen in het veld van de biologie van plantpathogene schimmels beantwoorden, zoals de structuur en samenstelling van genomen die moeilijk te bestuderen zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de extractie mogelijk maakt van genomisch DNA van hoge kwaliteit uit een pathogeen waarmee moeilijk te werken is.Om het experiment te starten, worden de stalen kogels snel met een magneet uit de cryovials met conidia verwijderd. Voeg 700 µL lysisbuffer van 65 °C toe en vortex de oplossing gedurende vijf tot 10 seconden. Na vijf tot 10 seconden is er een slurry gevormd.Voeg 300 µL toe van op 65 °C voorverwarmd 5% volume/volume sarkosyl en keer de buis voorzichtig vijf keer om. Incubeer de buizen 30 minuten bij 65 °C. Draag met een wide-bore pipetpunt de gehele oplossing over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 2 mL.Voeg één volume chloroform-isoamylalcohol toe aan de lysiselectie en keer de buis voorzichtig vijf keer om om te mengen. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij

purification-high-molecular-weight-genomic-dna-from-powdery-mildew

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.

Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

De cystic fibrosis luchtwegen als voorbeeld, het manuscript presenteert een uitgebreide workflow omvattende een combinatie van metagenomic en metatranscriptomic benaderingen van de microbiële en virale gemeenschappen in dieren door monsters te karakteriseren.

Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples

Dit artikel presenteert een gevoelige methode genaamd Circle-Seq voor het zuiveren van extrachromosomale circulaire DNA (eccDNA). De methode omvat zuivering in een kolom, verwijdering van resterend lineair chromosomaal DNA, rolling-circle-amplificatie en high-throughput sequencing. Circle-Seq is toepasbaar voor het screenen op genoomschaal van eukaryotische eccDNA en het bestuderen van genoomonstabiliteit en copy-numbervariaties.

Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen

De vergelijking en optimalisatie van twee organellaire DNA-verrijkingsmethoden worden voorgesteld: traditionele differentiële centrifugatie en fractionering van het totale gDNA op basis van methyleringsstatus. We beoordelen de resulterende DNA-hoeveelheid en kwaliteit, tonen de prestaties aan bij korte-leesvolgorde-sequencing, en bespreken het potentieel voor gebruik bij langlezen single-molecule sequencing.

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Nanopore technologie voor sequencing biomoleculen heeft brede toepassingen in de biowetenschappen, met inbegrip van de identificatie van ziekteverwekkers, voedsel veiligheid controle genomic analyse, metagenomic milieumonitoring en karakterisering van bacteriële resistentie tegen antibiotica. In dit artikel wordt de procedure voor het rangschikken van het DNA van de bodem van het metagenomic voor soorten identificatie met behulp van de technologie van het rangschikken nanopore aangetoond.

Nanopore DNA rangschikkend voor Metagenomic bodemanalyse

Eencellige sequencing blijkt genotypische heterogeniteit in biologische systemen, maar de huidige technologieën ontbreken de doorvoer die nodig zijn voor de diepe profilering van communautaire samenstelling en functie. Hier beschrijven we een microfluidic workflow voor het rangschikken &gt; 50.000 eencellige genomen uit verschillende cel populaties.

Een met-throughput Microfluidic Platform voor eencellige genoom Sequencing

Het doel van dit protocol is met een combinatie van rekenkundige en onderzoek van de Bank te vinden van nieuwe sequenties die niet gemakkelijk kunnen worden gescheiden van een mede zuiverende sequentie, die slechts gedeeltelijk bekend kan zijn.

Nieuwe reeks ontdekking door subtractieve Genomics

Lange-lezen sequenties vergemakkelijken aanzienlijk de assemblage van complexe genomen en karakterisering van structurele variatie. Beschrijven we een methode voor het genereren van ultra lange reeksen door sequentiebepaling nanopore gebaseerde platformen. De benadering neemt een geoptimaliseerde DNA-extractie, gevolgd door de gewijzigde bibliotheek preparaten voor het genereren van honderden kilobase leest met gematigde dekking van menselijke cellen.

Ultra lange lezen Sequencing voor hele Genomic DNA-analyse

Hier presenteren we een protocol om de genoombrede verdeling van histonmodificaties te analyseren, die nieuwe doelgenen in de pathogenese van M. oryzae en andere filamenteuze schimmels kunnen identificeren.

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie 

Leer hoe je hoog moleculair gewicht genomisch DNA isoleert van echte meeldauw voor long-read sequencing. Deze methode maakt hoogwaardige extractie mogelijk van moeilijk te bewerken pathogenen.

Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

Meer video's verkennen