Precisie-cut Mouse Lung Slices Live Pulmonary visualiseren van dendritische cellen

Het algemene doel van deze methode is om precisie-gesneden longplakjes, of PCLS, te gebruiken om de lokalisatie en het transport van verschillende typen immuuncellen in de long te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals de lokalisatie en migratiepatronen van immuuncellen in de long. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere interacties kunnen worden gevisualiseerd in levend ex vivo weefsel dat de driedimensionale architectuur van de long behoudt.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de lokalisatie en het transport van immuuncellen tijdens ontsteking, kan ze ook worden gebruikt om de contractie van luchtweg- en glad spierweefsel te visualiseren. Om het longweefsel te oogsten, gebruikt u eerst een schaar om de huid en het peritoneum open te maken vanaf het midden van de buik tot aan de kaak van een muis van zes tot 12 weken oud, en schuift u de darmen naar de zijkant van de buikholte. Knip de vena cava inferior door om het bloed uit de longen af te voeren en gebruik de scherpe punt van de schaar om het diafragma door te prikken, zodat de borstkas kan uitzetten.

Gebruik vervolgens een pincet om de speekselklieren en andere weefsels handmatig van de trachea weg te trekken, en gebruik een fijne pincet om een incisie in de trachea te maken aan de anterieure zijde van de dikste kraakbeenband, net groot genoeg om een 20 gauge naald door te laten dringen. Schuif nu een 1,5 inch 20 gauge naald op een stuk polyethyleenslang en snijd de slang onder een hoek van ongeveer 45 graden af. Bevestig de naald aan een spuit van één milliliter en trek 0,8 milliliters 40 °C 2% agarose met laag smeltpunt op in de spuit.

Wanneer alle agarose is geladen, steekt u het schuine uiteinde van de slang in de incisie en injecteert u de agarose langzaam in de longen. Plak de spuit, zonder de naald of de spuit te bewegen, op de polystyreenbasis om de naald in de trachea te fixeren, en plaats het dier gedurende ten minste 10 minuten in een opslag bij 4 °C. Zodra de agarose is gestold, gebruikt u een schaar om de longen voorzichtig uit te snijden en plaatst u deze in een schaal van drie centimeter met ijskoud PBS.

Draai vervolgens de lob voor het snijden van het weefsel zodanig dat het binnenste gedeelte van de long dat met de trachea verbonden is, naar beneden wijst. Om het longweefsel te snijden, brengt u eerst een kleine druppel All Purpose No Run gel superglue aan op een metalen spuitzuiger en verspreidt u de lijm in een cirkelvormige beweging. Wanneer alle lijm is aangebracht, gebruikt u een pincet om de uitgesneden lob onmiddellijk maar voorzichtig met de trachea-zijde naar beneden vast te pakken en dept u de lob op een tissue om het overtollige vloeistof te verwijderen.

Plaats de gedroogde lob voorzichtig bovenop de zuiger en trim eventueel overtollig weefsel dat buiten de rand van de zuiger steekt. Beweeg de zuiger naar beneden zodat de wanden van de metalen spuit omhoog en over het weefsel bewegen, waardoor een putje ontstaat met de long op de bodem van de spuitschacht dat niet dieper is dan enkele centimeters. Plak tape rond de onderkant van de spuit om de zuiger op zijn plaats te houden.

Giet vervolgens voorzichtig 2% low melt agarose van 40 °C in de spuit zodat de bovenkant van de lob net bedekt is, en omring de metalen spuit met een ijskoud koelblok. Plaats na één tot twee minuten de spuit met het specimen in de automatische slicer en richt het nieuwe mes uit. Vul daarna het bufferreservoir met ijskoud PBS.

Lijn de stappenmotoraandrijving uit met de monsterspuit en verwijder de tape. Zet de schakelaar in de positie voor snel voorwaarts bewegen, totdat de stappenmotoraandrijving de achterkant van de zuiger net raakt. Stel de weefseldikte, continue enkele snede, oscillatie en snelheidsinstellingen in op de slicer.

Druk vervolgens op start en gebruik een dunne spatel om elk PCLS op te vangen zodra het in het buffertankje valt, waarbij de plakjes in afzonderlijke putjes van een 24-wells plaat met ijskoud PBS worden geplaatst. Voor statische PCLS-beeldvorming worden de longmonsters die het anatomische gebied van belang bevatten overgebracht naar afzonderlijke petrischalen van drie centimeter met één milliliter van het gewenste antilichaamcocktail. Na 30 tot 60 minuten op ijs, onder wiebelende beweging en beschermd tegen licht, worden de plakjes twee keer gespoeld met één milliliter ijskoud PBS.

Voeg vervolgens 50 µL PBS toe aan één nieuwe ronde glazen schaaltje van drie centimeter per monster, en breng de coupes snel over naar elke druppel, waarbij de weefselstukjes voorzichtig worden gemanipuleerd zodat ze plat liggen. Aspireer daarna de PBS met een pipet en breng een druppel montage medium op kamertemperatuur aan op het objectglas, gevolgd door een glazen dekglas. Om het weefsel te beeldvormen, plaatst u de schaal op de tafel van een confocale microscoop onder een 20x objectief en gebruikt u de tile-tool om de randen van het weefsel te lokaliseren en te markeren in de convex hull-instelling om de tijd van de tile-scan te verkorten.

Stel vervolgens het z-stack-bereik in, waarbij u erop let dat de ingestelde bereiken passend zijn voor meerdere gebieden van de slice, in het bijzonder langs de randen. Voor live-cell imaging spoelt u de slices na 30 minuten incubatie in het betreffende antilichaamcocktail twee keer af met 1 mL koude Leibovitz 10. Voeg vervolgens 50 µL verse Leibovitz 10 toe aan één slot van een chambered cover glass per monster, gevolgd door de onmiddellijke overdracht van elke PCLS naar het medium, waarbij u de weefsels voorzichtig manipuleert tot ze plat liggen.

Gebruik vervolgens een pipet om het medium uit elke kamer te aspireren en veranker elke PCLS met een platina gewicht. Pipetteer voorzichtig vers bereide, ijskoude extracellulaire matrix op elke PCLS, waarbij u erop let dat de gel bovenop de longplakjes wordt geplaatst en dat de plakjes niet bovenop de gel blijven drijven. Na vijf minuten bij 37 °C brengt u het objectglas over naar een voorverwarmde confocale microscoopkamer, ingesteld op 37 °C onder een 20x objectief.

Stel vervolgens de z-stack en tegelbereiken in op basis van het gewenste interval tussen de frames, waarbij de tegeltool wordt gebruikt om het interessegebied in het weefsel aan te geven en de instelling voor het gecentreerde raster om het monster in het gezichtsveld te centreren. Conventionele dendritische cellen met een hoge expressie van CD11b lokaliseren zich in het longparenchym, terwijl CD103-positieve conventionele dendritische cellen zich voornamelijk rond de luchtwegen en in het subpleurale gebied bevinden. Co-kleuring voor CD88 en CD172a maakt het mogelijk om CD172a-negatieve, CD88-positieve alveolaire macrofagen te onderscheiden van CD172a-positieve, CD88-positieve interstitiële macrofagen, waarbij deze laatste bij voorkeur in het parenchym gelokaliseerd zijn en niet in het subepitheliale gebied.

Co-labeling voor CD90.2, een bekende T-celmarker, en het fluorescente eiwit TdTomato, een transgen onder transcriptionele controle van een master-transcriptiefactor die noodzakelijk is voor lymfangiogenese, vergemakkelijkt de identificatie van lymfatische structuren in de long. CD103-positieve conventionele dendritische cellen worden aangetroffen in verschillende anatomische gebieden, waaronder het CD324-expresserend luchtwegepitheel, de lymfevaten en het subpleuraal gebied. Celbeweging en cel-celinteracties kunnen worden geregistreerd met behulp van live-cell imaging, zoals zojuist gedemonstreerd.

In het representatieve experiment kan bijvoorbeeld 16 uur na orale toediening van ova-LPS duidelijk worden waargenomen dat CD103-positieve dendritische cellen gedurende een periode van vier uur interageren met adoptief overgedragen ova-specifieke T-cellen. Zodra men vaardig is geworden, kunnen de weefselpreparatie en de snijtechnieken in twee en een halve uur worden voltooid indien deze correct worden uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een goede agarose-inflatie van de longen moet worden bereikt en dat de delicate longcoupes vervolgens zo vlak mogelijk moeten worden gehouden voor beeldvorming.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het behandelen van PCLS met acetylcholine of methacholine, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over calciumsignalering en luchtwegcontractiliteit onder verschillende ziektecondities te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u precisie-gesneden longplakjes genereert voor het visualiseren van de lokalisatie, het transport en de interacties van immuuncellen in de long.