Name: Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer hoe je met pHluorin-gelabelde receptoren en TIRF-microscopie de subcellulaire lokalisatie en het transport van membraaneiwitten in muizenneuroblastoomcellen kunt monitoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817 en National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. Cel Cultuur en Transfectie <ol><li> Handhaaf muis neuroblastoma 2a (N2a) cellen in de groei media. <ol><li> Maak 500 ml N2a groeimedia van 200 ml Dulbecco&#39;s Eagle medium (DMEM) met een hoge glucose, 250 ml verminderd serum media, 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml penicilline / streptomycine (100x). </li><li> Handhaaf cellen in een T75 fles bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. </li><li> Gesplitste cellen 1:15 indien nodig, of ongeveer 80-90% confluentie. Dit is typisch 2-3 keer per week. </li></ol></li><li> Coat 35 mm glazen bodem schotel met poly-D-lysine. <ol><li> In een laminaire stroming bioveiligheid kast, voeg 200 pl 0,1 ug / ml poly-D-lysine op glas bodemgebied steriele 35 mm schaal. </li><li> Plaats schotel in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur. </li><li> Spoel zorgvuldig gerecht met DDH 2 O 3-4 keer. </li><li> Sta gerechten volledig drogen langer dan 1 uur. </li><li> sterilize gerechten met UV-licht in de bioveiligheid kast indien nodig. </li></ol></li><li> Plate N2a cellen voor TIRFM beeldvorming. <ol><li> Verwijder groeimedia uit hechtende cellen. </li><li> Los cellen uit de kolf door het incuberen met 1 ml 1 x trypsine (+ EDTA) gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. </li><li> Inactiveer trypsine door toevoeging van 9 ml kweekmedium. Meng media, trypsine en vrijstaande cellen met behulp van een pipet. </li><li> Visueel tellen cellen met een hemocytometer en bereken het juiste volume 90.000 cellen aan elke poly-D-lysine beklede glazen onderste schaal. Deze dichtheid is vereist voor efficiënte transfectie en eencellige TIRF imaging. </li><li> Voeg 2 ml groei media om elk gerecht met glazen bodem met 90.000 cellen. </li><li> Incubeer de schotel bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 16-24 uur. </li></ol></li><li> n2a transfectie <ol><li> Het verkrijgen van een plasmide construct dat een fluorofoor september opgenomenin het extracellulaire gebied van het eiwit van belang. Standaard kloneringstechnieken zoals PCR-amplificatie 5 kan worden gebruikt om het construct te genereren. OPMERKING: september moet worden opgenomen in het extracellulaire gebied van het membraaneiwit zodat deze zich bevindt binnen het lumen van het endoplasmatisch reticulum of handel blaasjes en wordt blootgesteld aan extracellulaire oplossing als op het plasmamembraan. September is vergelijkbaar in grootte met GFP en soortgelijke kloneringstrategieën kunnen worden gebruikt. </li><li> Vervang de groeimedia op geplateerde cellen met 1,5 ml gereduceerd serum medium (bijvoorbeeld, Opti-MEM), ongeveer 30 minuten voor de toevoeging van het transfectiereagens. OPMERKING: drugs geïnduceerde veranderingen in receotiren kan een geschikte concentratie geneesmiddel op het moment van transfectie toegevoegd. </li><li> Voeg 500 ng elke gewenste plasmide construeren 250 ul gereduceerd serum medium (tube 1). </li><li> Voeg 2 ul van het transfectiereagens een afzonderlijke buis containing 250 pl verminderde serum media. Incubeer buis 2 bij kamertemperatuur gedurende 5 min. De verhouding van transfectiereagens tot DNA plasmide moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit van interesse tot expressie. </li><li> Combineer pijpen 1 en 2 aan een oplossing die 500 ui transfectiereagens en plasmide mix maken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 min. </li><li> Voeg 500 ul transfectie mix pre-geplateerde cellen voor een totaal volume van 2 ml per schaal. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 24 uur. </li><li> Na 24 uur werd het transfectiemengsel verwijderd en spoel de cellen met kweekmedium en voeg vervolgens 2 ml groeimedium aan elk gerecht. OPMERKING: Indien een geneesmiddel op het moment van transfectie toegevoegd, kan weer worden aangevuld in deze stap. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 24 uur. </li><li> Afbeelding cellen 48 uur na transfectie. </li></ol></li></ol> 2. Live-cell imaging van Total Inexterne Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) <ol><li> Imaging opgericht <ol><li> Voer beeldvorming met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop opstelling met een scannend platform zoals weergegeven in figuur 1. Dit vraagt ​​een aanpassing van 488 nm DPSS laserbron, een stappenmotor 488 nm bundelpositie en een hoge numerieke apertuur (NA 1,49) 60x of 100x olie-immersie objectief passen. </li><li> Passeer de laserstraal door de juiste excitatie-filter (bandpass 488/10 nm). Lijn de gepolariseerde laserstraal door een single mode glasvezel aangesloten op een draagraket gemonteerd op een stappenmotor. In epifluorescentie modus wordt de excitatiebundel gecentreerd in het midden van de rug apertuur van het objektief. </li><li> TIRF te bereiken, gebruiken de stappenmotor om de gefocusseerde laserbundel over de rug apertuur van de objectieflens vertalen totdat de kritische hoek bereikt en balk niet langer overgebracht door het monster en in plaats daarvan volledig gereflecteerd door het glas-cell interface. </li><li> Maak foto&#39;s met behulp van een EMCCD (512 x 512 pixels) bediend met imaging software (bijv Metamorph) met de juiste emissie-filter gemonteerd in de emissie-pad (525/50 nm). </li></ol></li><li> Bereid de imaging-oplossing <ol><li> Bereid 200 ml extracellulaire oplossing (ECS) door mengen van 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES en 10 mM glucose in DDH 2 O. Voorraadoplossingen van NaCl, KCl, MgCl2, en CaCl2 kan worden voorbereid en gecombineerd met verse HEPES en glucose op de dag van beeldvorming. </li><li> Breng de pH van een oplossing die 100 ml ECS tot pH 7,4. Stel de resterende 100 ml ECS tot een pH van 5,4. Spoel de getransfecteerde cellen met 2 ml ECS (pH 7,4). </li><li> Voeg 2 ml ECS (pH 7,4) aan de getransfecteerde cellen voor de beeldvorming. </li></ol></li><li> Live cell imaging in TIRF <ol><li> Zet het gehele systeem, including 488 nm laser, camera, vertaling podium en imaging programma. De focus van de epifluorescentie balk en stel de macht om ongeveer 1 mW bij de 60X objectief. </li><li> olie toe te voegen aan de doelstelling en plaats een gerecht van getransfecteerde cellen op de vertaling podium. Zet de schotel vast met fase mounts waardoor het apparaat niet bewegen ten opzichte van de fase, zodat de cellen meerdere malen kunnen worden afgebeeld. </li><li> In epifluorescentie-modus, de focus van de microscoop en zoek de fluorescerende, getransfecteerde cellen. Cellen zullen blijven richten tussen verschillende nadruk vliegtuigen. Lokaliseren single, geïsoleerde cellen door te gaan met TIRF. </li><li> In de imaging-programma, stelt u de belichtingstijd tot 200 msec en optimaliseren van de fluorescentie-intensiteit door de EM gewin. </li><li> Overgang de laserbundel in TIRF door het vertalen van de bundel over het doel stapsgewijs met behulp van de stappenmotor. Als de kritische hoek nadert, zal de bundel zichtbaar vertalen over de rand van de schaal totdat deze convergeert bij The punt van de totale interne reflectie op het monster vlak. </li><li> Controleer of de cellen zijn in TIRF modus door het aanpassen van de scherpstelling knop. In TIRF, kan slechts één vlak van cellen worden gericht (dat wil zeggen ongeveer 150 nm van glas interface), het produceren van een zeer gedefinieerd beeld met een hoge resolutie van het plasmamembraan. </li></ol></li><li> Imaging september tot subcellulaire lokalisatie te bepalen <ol><li> Lokaliseren gezonde, getransfecteerde, enkele cellen in het beeldvlak. </li><li> Het verwerven van een gerichte beeld van de cel bij een pH van 7,4. September gemerkte receptoren op het plasmamembraan en endoplasmatisch reticulum zichtbaar zijn. </li><li> Snel blokkeren de laserbundel bereiken het monster fotobleken te voorkomen. </li><li> Onthoud het podium posities die overeenkomen met elke cel met behulp van microscoop imaging software geschikt voor het opnemen van meerdere xy locaties. </li><li> Herhaal stappen 2.4.1-2.4.4 20-30 cellen per schaal tijdens het gebruik van de software om de positie van elke cel opnemen. </li><li> After alle celbeelden bij pH 7,4 worden verzameld, handmatig pH 7,4 ECS oplossing wordt met een pipet verwijderd. Raak de schotel niet aanraken omdat dit de opgeslagen podium posities kon bewegen. </li><li> Voeg voorzichtig 2 ml van pH 5,4 ECS aan het gerecht en wacht 10 min. Gedurende deze tijd, bespaart eerder verworven beelden. </li><li> Onder de identieke reeks voorwaarden gebruikt om beelden te verzamelen bij een pH van 7,4, bewegen het podium om elke opgeslagen positie en het verwerven van een beeld van dezelfde cel bij een pH van 5,4. De cellen moeten er minder zin omdat alle gedetecteerde fluorescentie is afkomstig van endoplasmatisch reticulum beperkt september gelabeld receptoren. Sla de pH 5,4 cel beelden. </li></ol></li><li> Imaging enkele blaasje inbrengen gebeurtenissen in levende cellen <ol><li> Vervang kweekmedia van getransfecteerde cellen met 2 ml pH 7,4 ECS, of Leibovitz L-15 medium. De pH van Leibovitz L-15 medium CO 2 onafhankelijke, waarbij beeldvorming plaatsvindt gedurende een langere tijd indien nodig. </li><li> Place de schotel van getransfecteerde cellen op het stadium van de microscoop. Beveiligen en de focus van een enkele cel in TIRF volgende stap 2.3. </li><li> Indien uitgerust, zet de automatische scherpstelling, zodat de focus niet over de periode van de beeldvorming doet drijven. </li><li> Neem een ​​reeks van 1000 frames, continu het vastleggen van beelden met een frame rate van 200 msec. Uitbarstingen van fluorescentie wordt getoond in deze tijd, overeenkomend met lage pH handel vesicles fuseren met de plasmamembraan, waardoor de SEP de extracellulaire pH 7,4. </li><li> Zoek een ander enkele cel en herhaal de bovenstaande stap. Reset autofocus indien nodig. </li></ol></li></ol> 3. Beeldanalyse en gegevensverwerking <ol><li> Het analyseren van september fluorescentie subcellulaire lokalisatie te bepalen <ol><li> Open de cel beelden met behulp van een beeldanalyse-software zoals Metamorph of ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Trek de achtergrond van zowel pH 5,4 en pH 7,4 beelden met behulp van de rollende bal setting.</li><li> Gebruik een intensiteit van drempelwaarden om fluorescentie te kwantificeren van een enkele cel. Selecteer handmatig een regio van belang rond de cel in beeld de pH 7,4. </li><li> Meet de cel gebied, gemiddelde intensiteit, en geïntegreerde dichtheid met behulp van een plugin in ImageJ of met behulp van de ingebouwde functie &quot;Measure&quot; onder de tab Analyseren. </li><li> Herhaal stappen 3.1.1-3.1.3 voor dezelfde cel bij pH 5,4, nauwkeurig instellen van de intensiteit van drempelwaarden en omgeving plaats op dezelfde manier. </li><li> Nadat de geïntegreerde dichtheid wordt verkregen celbeelden bij zowel pH 7,4 en 5,4 Bereken het plasmamembraan geïntegreerde dichtheid door het aftrekken van de pH waarde van 5,4 7,4 pH waarde. Het verschil komt overeen met het relatieve aantal receptoren op het plasmamembraan binnen de TIRF excitatiegebied. </li><li> Als maat voor handel Bereken het relatieve percentage september gemerkte receptoren op het plasmamembraan opzichte van de resterende receptoren toegankelijk in de TIRF excitativolume wordt door het plasmamembraan integratie dichtheid van de totale geïntegreerde dichtheid bij pH 7,4, vermenigvuldigd met 100. </li></ol></li><li> Het analyseren van enkele blaasje inbrengen evenementen <ol><li> Open de reeks van 1000 tiff beelden met behulp van beeldanalyse-software. Trek de achtergrond van alle frames met behulp van de rollende bal setting. </li><li> Pas de kleurbalans van de opname intense gebieden die overeenkomen met insertie gebeurtenissen vesikel maximaliseren. Handmatig tellen van de uitbarstingen van fluorescentie die langer dan 3 frames (&gt; 600 msec). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li>
<li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li>
<li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease--a+stereological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li>
<li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+%CE%B17+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+%CE%B2-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+%CE%B14%2A+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li>
<li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nicotine+metabolite%2C+cotinine%2C+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cyst.+Fibros%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li>
<li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8764371">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li>
<li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li>
<li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li>
<li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14%CE%B22+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity%3A+pharmacology%2C+stoichiometry%2C+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-3768-4">Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies</a>. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).</li>
<li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X08006079">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pH+of+the+secretory+pathway%3A+measurement%2C+determinants%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

De pH gevoeligheid van september maakt receptoren die zich op de plasmamembraan te onderscheiden van intracellulaire receptoren in het endoplasmatisch reticulum, en kan worden gebruikt om het inbrengen gebeurtenissen lossen receptor-dragende vesicles 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Diverse technie...

Veranderingen in receptorexpressie, distributie en montage zijn verbonden met een groot aantal ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, cystische fibrose, en drugsverslaving 1, 2, 3, 4, 5. Bijvoorbeeld nicotine en andere nicotine liganden beïnvloeden de handel in nicotinische acetylcholinereceptoren (nAChRs) hetgeen leidt tot veranderingen in de handel, expressie en opregulatie 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Nicotine verhoogt het totale aantal verzamelde nAChRs in een cel verhoogt handel naar de plasmamembraan, eend verandert de assemblage van subeenheden om een ​​hoge gevoeligheid versie van bepaalde subtypen bevorderen. Het oplossen van verschillende veranderingen in de handel, assemblage, en de expressie van receptoren in een ziektemodel biedt cruciale mechanistische details die essentieel zijn voor drug targets te definiëren zijn. Een ideale aanpak zou snel onderscheiden intracellulaire receptoren en die gelokaliseerd op het plasmamembraan. Deze Vooral in gevallen waarin een meerderheid van een bepaald eiwit intracellulair bevindt, zoals bij nAChRs. Aangezien het merendeel van de nAChRs worden gelokaliseerd in het endoplasmatisch reticulum, traditionele metingen missen de spatiotemporele resolutie die nodig zijn om de lokalisatie en de handel veranderingen langs de secretieroute lokaliseren. Receptor mensenhandel en expressie studies van nAChRs zijn voornamelijk uitgevoerd met behulp van radioligand binding 11, biotinylering assays 12, western blotting 13 of immunoprecipitatie techniq<html> UES 12. Deze zijn afhankelijk van de bindingsspecificiteit van een reporter molecuul of fixatie van cellen missen het vermogen om gelijktijdig onderscheiden plasmamembraan inwoner intracellulaire receptoren. Daarom zijn studies van ionkanaal assemblage en blaasjes dynamiek grotendeels vertrouwd op low-throughput elektrofysiologische technieken 14. Superieure ruimtelijke en temporele resolutie is mogelijk met de vooruitgang in fluorescentie microscopie. Genetisch gecodeerde reporter moleculen, zoals groen fluorescent eiwit (GFP) en varianten, niet-specifieke binding te elimineren problemen en gevoeligheid 15 verhogen. Een pH-gevoelige variant van GFP, bekend als superecliptic pHluorin (SEP), kan worden gebruikt om de pH inherente verschillen tussen compartimenten in een cel benutten om te bepalen lokalisatie 5, 7, 8,ref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. september fluoresceert bij een pH hoger dan 6, maar blijft in de uit-toestand bij lagere pH. Daarom receptoren gelabeld met SEP de luminale zijde worden wanneer in het endoplasmatisch reticulum onderhavige gedetecteerd ( ER) of bij het inbrengen in het plasmamembraan (PM), maar niet als beperkt tot een handel blaasje. Manipulatie van de extracellulaire pH in contact met receptoren op het plasmamembraan verandert bijgevolg de fluorescentie en daardoor detectie van deze receptoren. Als dezelfde cel achtereenvolgens afgebeeld op zowel neutrale extracellulaire pH en vervolgens een pH lager dan 6, wordt het verschil tussen de beelden toegeschreven aan receptoren op het plasmamembraan. Dit maakt een gelijktijdige meting van intracellulair (perifere ER) en plasmamembraan resident receptoren 5, 7, 8 </sup&gt;, 9. Single blaasje inbrengen gebeurtenissen kunnen ook worden opgelost wanneer de extracellulaire pH-neutraal is. Zodra een lage pH handel vesicle gen met de plasmamembraan is de luminale zijde van het blaasje blootgesteld aan de extracellulaire neutrale oplossing, waardoor een transitie gedetecteerd als een uitbarsting van fluorescentie 7, 18, 19, 20. September maakt de meting van receptoren gelokaliseerd in het plasmamembraan en perifere endoplasmatisch reticulum, en een middel voor transport van receptoren tussen deze subcellulaire gebieden 5, 7, 18 te meten. Een hogere resolutie in het plasmamembraan te bereiken is een receptor met september genetisch gecodeerde afgebeeld door totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM). Deze methode is vooralhandig als de meeste receptoren gelokaliseerd intracellulaire gebieden, aangezien TIRFM verhoogt de zichtbaarheid van het plasmamembraan. TIRFM maakt het ook mogelijk de resolutie van mensenhandel dynamica van enkele blaasjes dragen september-gelabelde receptoren bij het inbrengen in de PM. Totale interne reflectie optreedt bij het scheidingsvlak van materialen met verschillende brekingsindices, zoals tussen een cel en een glazen afdekplaat slip 21, 22. September fluoresceert bij bestraling met 488 nm excitatie, die is gericht op totale interne reflectie aan het grensvlak van het glas en cel oplossing. Dit levert een uitdovende golf dat ongeveer 150 nm doordringt in de steekproef, alleen spannend fluoroforen binnen dit volume. Slechts september bevattende receptoren in een neutrale pH omgeving binnen dit bereik excitatie gedetecteerd, overeenkomend met die die op het plasmamembraan of perifere endoplasmatisch reticulum. Aangezien detectie is beperkt to excitatie door de uitdovende golf, achtergrondfluorescentie van het intracellulaire gebied wordt gereduceerd en de signaal-ruisverhouding toeneemt 21, 22. Bovendien, omdat de straling niet het grootste deel van de cel doordringen, photodamage geminimaliseerd die beeldvorming van levende cellen in de loop van de tijd mogelijk maakt. Hierdoor TIRFM gekoppeld genetisch gecodeerde september levert de hoge resolutie en gevoeligheid vereist om subcellulaire lokalisatie en handel dynamica van membraanreceptoren te meten langs de secretieroute.

<table><tbody><tr><td>Reagens/Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks met Filterdop, Steriel, Greiner Bio One, 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glazen bodem Petri schotels, steriele</td><td>Cell E&amp;G</td><td>GBD00002-200</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>vwr</td><td>215017510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium&lrm; (DMEM), Hoge Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-965-084&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Verminderd Serum Medium</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>31-985-088</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Runderserum, Gecertificeerd, US Oorsprong, Standaard (Sterieel-Gefilterd)&nbsp;</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1x), zonder fenol rood</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine Oplossing</td><td>VWR</td><td>45000-652</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, zonder fenol rood</td><td>Gibco / Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td>Voorzichtig mengen; Niet mengen</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Objectief Immersie Olie&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Type F</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>60X, 1.49 NA olie-immersie objectief</td><td>Olympus</td><td>APON 60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde stage</td><td>Prior</td><td>IXPROXY</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde actuator (steppermotor)</td><td>Thorlabs</td><td>ZST213</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph (of ander beeldvormingsprogramma)</td><td>Metamorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser</td><td>Market Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single mode glasvezel</td><td>Thorlabs</td><td>SM450</td><td></td></tr><tr><td>Spiegels</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E01</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488 nm LP</td><td>Semrock</td><td>Di02-R488-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter, 488 nm</td><td>Semrock</td><td>LL01-488-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter, 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik makend van phluorin-gelabeld receptoren monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Inzicht membraaneiwit mensenhandel, assemblage en expressie vereist een aanpak die onderscheid maakt tussen degenen die woonachtig zijn in de intracellulaire organellen en die gelokaliseerd op het plasmamembraan. Traditionele fluorescentie metingen niet de mogelijkheid om membraaneiwitten die in verschillende organellen onderscheiden. Cutting edge methodologieën overstijgen traditionele methoden door het koppelen van pH-gevoelige fluoroforen met een totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM). TIRF verlichting wekt het monster tot circa 150 nm van het glas-monsterscheidingsvlak dus afneemt achtergrond, waardoor de signaal-ruisverhouding en verbeteren resolutie. De excitatie volume TIRFM omvat het plasmamembraan omgeving organellen zoals de perifere ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is een pH-gevoelige versie van GFP. Genetisch codeert september in het extracellulaire domein van een membraaneiwit plaats positioneert het fluorofoor opde luminale zijde van het ER en het extracellulaire gebied van de cel. September fluorescerend als de pH hoger dan 6, maar blijft in de uit-toestand bij lagere pH-waarden. Daarom receptoren gelabeld met september fluoresceren wanneer geïntegreerd in het endoplasmatisch reticulum (ER) of bij het inbrengen in het plasmamembraan (PM) maar niet als beperkt tot een handel blaasje of andere organellen zoals het Golgi. De extracellulaire pH kan worden ingesteld op de fluorescentie van receptoren dicteren op het plasmamembraan. Het verschil in fluorescentie tussen TIRF beelden bij neutrale en zure pH voor extracellulaire dezelfde cel overeen met een relatieve aantal receptoren op het plasmamembraan. Dit maakt een gelijktijdige meting van intracellulaire en plasmamembraan resident receptoren. Single blaasje inbrengen gebeurtenissen kunnen ook worden gemeten wanneer de extracellulaire pH-neutraal, wat overeenkomt met een lage pH mensenhandel blaasje fuseren met het plasmamembraan en de overgang naar een fluorescerende toestand. dit versatile techniek kan worden benut om de lokalisatie, expressie, en de handel van membraaneiwitten te bestuderen.

September opname in een receptor maakt directe detectie van die receptor in een levende cel. Gekoppeld aan TIRFM, dit maakt de evaluatie van de relatieve expressieniveaus van de plasmamembraan en de verdeling van receptoren in de subcellulaire locaties in de regio TIRF excitatie. Single blaasje mensenhandel gebeurtenissen kunnen ook worden opgelost. Relatieve expressieniveaus SEP-gemerkte receptoren op plasmamembraan <p class...

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Het algemene doel van deze fluorescentiebeeldgevingsmethode is het monitoren van veranderingen in het transport van membraaneiwitten en de intracellulaire distributie. Deze methode biedt inzicht in veranderingen in eiwittransport, zoals het effect van genetische mutaties of farmacologische middelen op de snelheid van vesikeltransport en de eiwitexpressie op het celoppervlak. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat metingen snel, met een hoge resolutie en in realtime kunnen worden uitgevoerd, zonder het monster te vernietigen.48 uur vóór de beeldvorming worden muis neuroblastoom 2A-cellen getransfecteerd met een plasmideconstruct dat SEP bevat, een pH-gevoelige fluorofoor die is ingebouwd in het extracellulaire gebied van het eiwit van belang. Wanneer de getransfecteerde cellen klaar zijn voor beeldvorming met totale interne reflectie fluorescentie- of TIRF-microscopie, worden twee milliliter extracellulaire oplossing (ECS) met een pH van 7,4 aan de cellen toegevoegd. Plaats een schaal met cellen op de translatiepodia en gebruik klemmen om de schaal op zijn plaats te fixeren.Stel in epifluorescentie-modus de microscoop scherp en lokaliseer de fluorescent gemodificeerde c

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

We beschrijven hier het gebruik van een pH-gevoelige groene fluorescerende eiwitvariant, pHluorine, om de spatio-temporele dynamiek van axongeleidingsreceptoren aan het celoppervlak te bestuderen. De pHluorine-gelabelde receptor wordt zowel in celkweek als in vivouitgedrukt met behulp van elektroporatie van het kuikenembryo.

Gebruik van pHluorine om de dynamiek van Axon Guidance Receptoren in celcultuur en in het kuikenembryo te beoordelen

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Leer hoe je met pHluorin-gelabelde receptoren en TIRF-microscopie de subcellulaire lokalisatie en het transport van membraaneiwitten in muizenneuroblastoomcellen kunt monitoren.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Meer video's verkennen