Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper
9 april 2017
Dit handschrift maakt gebruik van de Fiji-gebaseerde open-source softwarepakket VirusMapper single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie microscopie afbeeldingen om nauwkeurige modellen van de nanoschaal structuur te genereren.
Het algemene doel van deze procedure is het produceren van hoogprecisie moleculaire modellen van virussen of macromoleculaire complexen door enkeldeeltjeanalyse toe te passen op superresolutiebeelden van structuren met fluorescent gelabelde componenten. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van virologie, inclusief de eiwitarchitectuur van complexe virussen, en hoe deze verandert tijdens het verloop van een infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het verzamelen van meerdere beelden van dezelfde structuur het mogelijk wordt om een hogeprecisie kaart van zijn componenten te genereren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur van virussen, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals andere pathogenen en macromoleculaire complexen binnen zoogdiercellen. Eerst, beeld de monster af met superresolutie fluorescentiemicroscopie. Verkrijg beelden van verschillende gezichtsvelden die honderden tot duizenden goed gescheiden deeltjes bevatten zonder ongewenste fluorescente structuren.
Zodra de beelden zijn verkregen en verwerkt, importeer en concateneer de beelden in een stack met geïntercaleerde kanalen. Converteer indien nodig de geconcateneerde afbeelding van een hyper-stack naar een stack. Selecteer vervolgens "Virale structuren extraheren" in het VirusMapper sub-menu en stel de bestandspad in voor de geëxtraheerde deeltjes.
Vul het aantal gefluorescerende kanalen in dat is afgebeeld. Stel het referentiekanaal in op het fluorescentiekanaal waarin de deeltjes het meest consistente uiterlijk hebben. Als die deeltjes een centraal maximum missen, pas dan vooraf detectie Gaussiaanse vervaging toe om het verschijnen van een te induceren.
Schat vervolgens de diameter in pixels van de grootste deeltjes. Stel de ROI-radius in op iets meer dan de helft van die waarde. Schat het aantal ROI's dat per frame nodig is.
Gebruik aanvankelijk niet meer dan honderd ROI's. Stel de maximale ROI-overlap in op basis van de deeltjesscheiding. Bekijk de ROI's voor dat frame.
Pas de straal, het aantal ROI's en de maximale overlap aan zodat elk deeltje in het frame is omsloten door een enkele ROI. Zorg ervoor dat de ROI's minstens een paar pixels breder zijn dan de grootste deeltjes. Klik vervolgens op OK"om de segmentatie uit te voeren.
Sluit het monstersbeeld in de ROI-manager na extractie. Hernoem de geëxtraheerde deeltjessets niet. Selecteer "Zaadjes genereren" en open de map met de geëxtraheerde deeltjesgegevens.
Stel het referentiekanaal in en selecteer alle kanalen waarvoor een zaadje moet worden gegenereerd. Draai indien nodig om eerdere modellen te matchen, de zaden met negentig graden. Voor kanalen waarin de deeltjes een centraal maximum missen, verhoog de Gaussiaanse vervagingswaarde vóór de uitlijning zoals eerder.
Als de kanalen niet nauw gealigneerd zijn, schakel de verschuivingscorrectie in voor de niet-referentiekanalen. Zoek in de deeltjessequentie naar een consistent verschijnende structuur. Identificeer een representatief deeltje en voer het bijbehorende framenummer in het veld "Frames om te gebruiken" in.
Bekijk de resulterende zaden. Zaadverkiezing is een kritisch stadium van deze procedure. Bekijk de ruwe gegevens zorgvuldig om een of meerdere structuren te identificeren die moeten worden gemodelleerd.
De modelkwaliteit is sterk afhankelijk van het kiezen van zaden die deze structuren nauwkeurig weerspiegelen. Pas de referentiekanaal, de Gaussiaanse vervagingsstraal en de verschuivingscorrectie aan zoals nodig is om de identificatie van aanvullende frames met vergelijkbare zaden te optimaliseren. Blijf frames toevoegen en de generatieparameters aanpassen tot de gemiddelde structuur de best waargenomen structuur in de gegevens vertegenwoordigt.
Voer de mapnaam en bestandsvoorvoegsel voor de zaden in. Klik op OK"om de zaadbeelden op te slaan voor later modelleren. Selecteer "Modellen genereren op basis van zaden" en open de map met de geëxtraheerde deeltjes.
Laad de gemiddelde zaden voor elk kanaal. Als u een referentiegebaseerde structuurontdekking doet, selecteert u een referentiekanaal voor uitlijning. Bekende deeltjesstructuur in één kanaal kan worden gebruikt als referentie om een tweede onbekend kanaal uit te lijnen.
Dit zorgt voor onbevooroordeelde mapping van de onbekende structuur. Houd er rekening mee dat chromatische verschuiving tussen kanalen van tevoren moet worden gecorrigeerd. Als de analyse kleine verschillen of subtiele kenmerken in het model zoekt, selecteer dan "Vierkante beeldintensiteit tijdens sjabloonvergelijking."
Stel de minimale overeenkomst in op tussen zestig en tachtig procent en het aantal iteraties op één. Selecteer modellen en deeltjes die tijdens de berekening moeten worden weergegeven en genereer de voorbeeldmodellen. Inspecteer de voorbeeldmodellen.
Verhoog de minimale overeenkomst om alleen deeltjes met de gewenste morfologie te omvatten. Optimaliseer andere modelberekeningparameters indien nodig en selecteer extra elementen bij het modelgeneratieproces om te worden getoond indien gewenst. Zodra de voorbeeldmodellen bevredigend zijn, verhoog het aantal iteraties tot tien.
Stel de mapnaam en bestandsvoorvoegsel in. Klik op OK"om de modelontwikkelingsstacks op te slaan die alle iteraties van het definitieve model bevatten. Een recombinant Vaccinia-virus met twee eiwitten gelabeld met groen en rood fluorescente eiwitten werd afgebeeld door gestructureerde verlichtingsmicroscopie en gemodelleerd met de VirusMapper-plug-in.
Zaadjes werden afzonderlijk gegenereerd voor de frontale en sagittale oriëntaties, elk gemiddeld uit vijf representatieve deeltjes. Afhankelijk van de oriëntatie van het virus, kunnen een of twee laterale lichamen worden onderscheiden. Daarom kunnen aparte modellen worden gegenereerd voor de twee oriëntaties.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de modellen grotendeels afhangt van de kwaliteit van de verkregen ruwe gegevens. Hoewel enkeldeeltjeanalyse de precisie kan verhogen, kan het geen compensatie bieden voor beelden van lage kwaliteit. Na het volgen van deze procedure kan verdere kwantificering of modelaanpassing worden uitgevoerd op deze modellen.
Dit kan helpen bij het beantwoorden van aanvullende vragen, bijvoorbe
Overzicht
Dit manuscript presenteert een methode voor het genereren van hoogprecisie moleculaire modellen van virussen met behulp van single-particle analyse op superresolutie microscopiebeelden. De techniek maakt gebruik van de VirusMapper-software om ons begrip van de virale architectuur en de veranderingen hiervan tijdens een infectie te verbeteren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Virologie
- Microscopie
- Structurele biologie
Achtergrond
- Single-particle-analyse maakt gedetailleerde modellering van nanostructuren mogelijk.
- Superresolutie-microscopie levert beelden met een hoge resolutie van fluorescerend gelabelde componenten.
- De methode kan worden toegepast op diverse biologische systemen buiten virussen.
- Inzicht in de virale structuur is cruciaal voor het begrijpen van infectiemechanismen.
Doel van de studie
- Om nauwkeurige moleculaire modellen van virussen en macromoleculaire complexen te produceren.
- Om de eiwitarchitectuur van complexe virussen te onderzoeken.
- Om structurele veranderingen tijdens het verloop van een virale infectie te verkennen.
Gebruikte methoden
- Beeldacquisitie met behulp van superresolutie fluorescentiemicroscopie.
- Verwerking en concatenatie van beelden tot een stack voor analyse.
- Gebruik van VirusMapper om virale structuren te extraheren en seeds te genereren.
- Modelgeneratie op basis van geselecteerde seeds en iteratieve verfijning.
Belangrijkste resultaten
- Er zijn succesvol precisiemodellen van virale structuren gegenereerd.
- Verschillende oriëntaties van het virus werden afzonderlijk gemodelleerd.
- De kwaliteit van de modellen was afhankelijk van de kwaliteit van de ruwe beeldgegevens.
- Er zijn inzichten verkregen in nanostructuurveranderingen in de virale architectuur.
Conclusies
- Single-particle-analyse verhoogt de precisie van structurele modellen.
- VirusMapper is een waardevol instrument voor het bestuderen van virale architectuur.
- Verdere kwantificering kan diepere inzichten bieden in virale dynamiek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
VirusMapper maakt hoogprecieze structurele modellering van virale componenten mogelijk op basis van superresolutie-microscopiedata, wat targetvalidatie bij de ontdekking van antivirale middelen ondersteunt. Door nanostructurele architectuur en conformationele veranderingen te kwantificeren, biedt het mechanische risicoreductie voor virologische programma's in een vroeg stadium. De open-source high-throughput plugin faciliteert schaalbare toepassing voor onderzoeksteams die virale entry, assemblage of gastheer-pathogeen-interacties bestuderen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de architectuur van virale eiwitten en structurele dynamiek tijdens infectiecycli mogelijk.
- Operationele waarde: Ondersteunt hypothese-gestuurde targetselectie door directe visualisatie van macromoleculaire complexen.
- Voorspellende waarde: Genereert structurele kaarten die inzicht geven in de toegankelijkheid van epitopen en de identificatie van druggable sites.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare structurele resultaten voor de standaardisatie van assays.
- Operationele waarde: Maakt de voorbereiding van gevalideerde biologische modellen mogelijk voor downstream compound screening.
- Platformwaarde: Faciliteert het hergebruik van imaging-workflows voor meerdere virale targets of mutanten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt structurele veranderingen op nanoschaal aan functionele virale fenotypen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via consistente structurele read-outs.
- Risicobeperking: Maakt datagestuurde go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van architecturale stabiliteit over verschillende stammen of condities.
Integratie van Pipeline & Workflow
VirusMapper past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelwitidentificatie tot lead-optimalisatie en biedt structurele inzichten die bijdragen aan het ontwerp van antivirale middelen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van virale assemblage-mechanismen en interacties met gastheerfactoren.
- Screening: Levert assay-klare structurele modellen met kwantitatieve ruimtelijke resolutie voor studies naar verbinding-binding.
- Analytica: Genereert iteratieve modelverfijningen en similariteitsmetrieken die vergelijking tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt structurele observaties met preklinische effectiviteit via correlaties tussen architectuur en functie.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Biedt een gestandaardiseerd open-source platform voor structurele virologie over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het doelwit door directe, hoogresolutie visualisatie van virale componenten.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via geautomatiseerde partikelextractie en iteratieve modellering.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de selectie van lead-verbindingen door structurele aannames in een vroeg stadium te valideren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van antivirale kandidaten mogelijk op basis van structurele conservatie of kwetsbaarheid.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in superresolutiemicroscopie en workflows voor beeldanalyse.
- Afhankelijk van toegang tot gestructureerde illuminatie of vergelijkbare superresolutieplatforms.
- Noodzaak van gestandaardiseerde protocollen voor beeldacquisitie voor consistente particulescheiding en signaalkwaliteit.
- Omvat afstemming tussen teams over de selectie van het referentiekanaal en parameters voor seedgeneratie.
- Beperkt door de kwaliteit van de ruwe beeldgegevens; kan geen gebrekkige labeling of een hoge achtergrond compenseren.
