Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper
April 9th, 2017
Dit handschrift maakt gebruik van de Fiji-gebaseerde open-source softwarepakket VirusMapper single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie microscopie afbeeldingen om nauwkeurige modellen van de nanoschaal structuur te genereren.
Het algemene doel van deze procedure is het produceren van hoogprecisie moleculaire modellen van virussen of macromoleculaire complexen door enkeldeeltjeanalyse toe te passen op superresolutiebeelden van structuren met fluorescent gelabelde componenten. Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van virologie, inclusief de eiwitarchitectuur van complexe virussen, en hoe deze verandert tijdens het verloop van een infectie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het verzamelen van meerdere beelden van dezelfde structuur het mogelijk wordt om een hogeprecisie kaart van zijn componenten te genereren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur van virussen, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals andere pathogenen en macromoleculaire complexen binnen zoogdiercellen. Eerst, beeld de monster af met superresolutie fluorescentiemicroscopie. Verkrijg beelden van verschillende gezichtsvelden die honderden tot duizenden goed gescheiden deeltjes bevatten zonder ongewenste fluorescente structuren.
Zodra de beelden zijn verkregen en verwerkt, importeer en concateneer de beelden in een stack met geïntercaleerde kanalen. Converteer indien nodig de geconcateneerde afbeelding van een hyper-stack naar een stack. Selecteer vervolgens "Virale structuren extraheren" in het VirusMapper sub-menu en stel de bestandspad in voor de geëxtraheerde deeltjes.
Vul het aantal gefluorescerende kanalen in dat is afgebeeld. Stel het referentiekanaal in op het fluorescentiekanaal waarin de deeltjes het meest consistente uiterlijk hebben. Als die deeltjes een centraal maximum missen, pas dan vooraf detectie Gaussiaanse vervaging toe om het verschijnen van een te induceren.
Schat vervolgens de diameter in pixels van de grootste deeltjes. Stel de ROI-radius in op iets meer dan de helft van die waarde. Schat het aantal ROI's dat per frame nodig is.
Gebruik aanvankelijk niet meer dan honderd ROI's. Stel de maximale ROI-overlap in op basis van de deeltjesscheiding. Bekijk de ROI's voor dat frame.
Pas de straal, het aantal ROI's en de maximale overlap aan zodat elk deeltje in het frame is omsloten door een enkele ROI. Zorg ervoor dat de ROI's minstens een paar pixels breder zijn dan de grootste deeltjes. Klik vervolgens op OK"om de segmentatie uit te voeren.
Sluit het monstersbeeld in de ROI-manager na extractie. Hernoem de geëxtraheerde deeltjessets niet. Selecteer "Zaadjes genereren" en open de map met de geëxtraheerde deeltjesgegevens.
Stel het referentiekanaal in en selecteer alle kanalen waarvoor een zaadje moet worden gegenereerd. Draai indien nodig om eerdere modellen te matchen, de zaden met negentig graden. Voor kanalen waarin de deeltjes een centraal maximum missen, verhoog de Gaussiaanse vervagingswaarde vóór de uitlijning zoals eerder.
Als de kanalen niet nauw gealigneerd zijn, schakel de verschuivingscorrectie in voor de niet-referentiekanalen. Zoek in de deeltjessequentie naar een consistent verschijnende structuur. Identificeer een representatief deeltje en voer het bijbehorende framenummer in het veld "Frames om te gebruiken" in.
Bekijk de resulterende zaden. Zaadverkiezing is een kritisch stadium van deze procedure. Bekijk de ruwe gegevens zorgvuldig om een of meerdere structuren te identificeren die moeten worden gemodelleerd.
De modelkwaliteit is sterk afhankelijk van het kiezen van zaden die deze structuren nauwkeurig weerspiegelen. Pas de referentiekanaal, de Gaussiaanse vervagingsstraal en de verschuivingscorrectie aan zoals nodig is om de identificatie van aanvullende frames met vergelijkbare zaden te optimaliseren. Blijf frames toevoegen en de generatieparameters aanpassen tot de gemiddelde structuur de best waargenomen structuur in de gegevens vertegenwoordigt.
Voer de mapnaam en bestandsvoorvoegsel voor de zaden in. Klik op OK"om de zaadbeelden op te slaan voor later modelleren. Selecteer "Modellen genereren op basis van zaden" en open de map met de geëxtraheerde deeltjes.
Laad de gemiddelde zaden voor elk kanaal. Als u een referentiegebaseerde structuurontdekking doet, selecteert u een referentiekanaal voor uitlijning. Bekende deeltjesstructuur in één kanaal kan worden gebruikt als referentie om een tweede onbekend kanaal uit te lijnen.
Dit zorgt voor onbevooroordeelde mapping van de onbekende structuur. Houd er rekening mee dat chromatische verschuiving tussen kanalen van tevoren moet worden gecorrigeerd. Als de analyse kleine verschillen of subtiele kenmerken in het model zoekt, selecteer dan "Vierkante beeldintensiteit tijdens sjabloonvergelijking."
Stel de minimale overeenkomst in op tussen zestig en tachtig procent en het aantal iteraties op één. Selecteer modellen en deeltjes die tijdens de berekening moeten worden weergegeven en genereer de voorbeeldmodellen. Inspecteer de voorbeeldmodellen.
Verhoog de minimale overeenkomst om alleen deeltjes met de gewenste morfologie te omvatten. Optimaliseer andere modelberekeningparameters indien nodig en selecteer extra elementen bij het modelgeneratieproces om te worden getoond indien gewenst. Zodra de voorbeeldmodellen bevredigend zijn, verhoog het aantal iteraties tot tien.
Stel de mapnaam en bestandsvoorvoegsel in. Klik op OK"om de modelontwikkelingsstacks op te slaan die alle iteraties van het definitieve model bevatten. Een recombinant Vaccinia-virus met twee eiwitten gelabeld met groen en rood fluorescente eiwitten werd afgebeeld door gestructureerde verlichtingsmicroscopie en gemodelleerd met de VirusMapper-plug-in.
Zaadjes werden afzonderlijk gegenereerd voor de frontale en sagittale oriëntaties, elk gemiddeld uit vijf representatieve deeltjes. Afhankelijk van de oriëntatie van het virus, kunnen een of twee laterale lichamen worden onderscheiden. Daarom kunnen aparte modellen worden gegenereerd voor de twee oriëntaties.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kwaliteit van de modellen grotendeels afhangt van de kwaliteit van de verkregen ruwe gegevens. Hoewel enkeldeeltjeanalyse de precisie kan verhogen, kan het geen compensatie bieden voor beelden van lage kwaliteit. Na het volgen van deze procedure kan verdere kwantificering of modelaanpassing worden uitgevoerd op deze modellen.
Dit kan helpen bij het beantwoorden van aanvullende vragen, bijvoorbe
Overzicht
Dit manuscript presenteert een methode voor het genereren van hoogprecisie moleculaire modellen van virussen door middel van single-particle analyse op super-resolutie microscopie beelden. De techniek maakt gebruik van de VirusMapper software om ons begrip van virale architectuur en zijn veranderingen tijdens infectie te verbeteren.
Belangrijke onderdeelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Microscopie
- Structurele biologie
Achtergrond
- Single-particle analyse maakt gedetailleerde modellering van nanoschaal structuren mogelijk.
- Super-resolutie microscopie levert hoge resolutie beelden van fluorescent gelabelde componenten.
- De methode kan worden toegepast op verschillende biologische systemen buiten virussen.
- Het begrijpen van virale structuur is cruciaal voor inzichten in infectiemechanismen.
Doel van het onderzoek
- Om nauwkeurige moleculaire modellen van virussen en macromoleculaire complexen te produceren.
- Om de eiwitarchitectuur van complexe virussen te onderzoeken.
- Om structurele veranderingen tijdens het beloop van virale infectie te verkennen.
Gebruikte methoden
- Beeldverwerving met behulp van super-resolutie fluorescentie microscopie.
- Verwerken en concateneren van beelden in een stack voor analyse.
- Gebruik van VirusMapper om virale structuren te extraheren en zaden te genereren.
- Modelgeneratie op basis van geselecteerde zaden en iteratieve verfijning.
Belangrijkste resultaten
- Hoogprecisie modellen van virale structuren werden met succes gegenereerd.
- Verschillende oriëntaties van het virus werden afzonderlijk gemodelleerd.
- De kwaliteit van de modellen was afhankelijk van de kwaliteit van de ruwe beeldgegevens.
- Inzichten in nanoschaal veranderingen in virale architectuur werden verkregen.
Conclusies
- Single-particle analyse verbetert de precisie van structurele modellen.
- VirusMapper is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van virale architectuur.
- Verdere kwantificering kan diepere inzichten in virale dynamica opleveren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
VirusMapper enables high-precision structural modeling of viral components from super-resolution microscopy data, supporting target validation in antiviral discovery. By quantifying nanoscale architecture and conformational changes, it provides mechanistic de-risking for early-stage virology programs. The open-source, high-throughput plugin facilitates scalable application across discovery teams studying viral entry, assembly, or host-pathogen interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral protein architecture and structural dynamics during infection cycles.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven target selection through direct visualization of macromolecular complexes.
- Predictive Value: Generates structural maps that inform epitope accessibility and druggable site identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative, reproducible structural outputs for assay standardization.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological models for downstream compound screening.
- Platform Value: Facilitates reuse of imaging workflows across multiple viral targets or mutants.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links nanoscale structural changes to functional viral phenotypes.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation via consistent structural readouts.
- Risk Mitigation: Enables data-driven go/no-go decisions based on architectural stability across strains or conditions.
Pipeline & Workflow Integration
VirusMapper fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing structural insights that inform antiviral design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral assembly mechanisms and host-factor interactions.
- Screening: Delivers assay-ready structural models with quantitative spatial resolution for compound binding studies.
- Analytics: Generates iterative model refinements and similarity metrics that enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects structural observations to preclinical efficacy through architecture-function correlation.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, open-source platform for structural virology across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence through direct, high-resolution visualization of viral components.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability via automated particle extraction and iterative modeling.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead selection by validating structural assumptions early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on structural conservation or vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and image analysis workflows.
- Depends on access to structured illumination or comparable super-resolution platforms.
- Necessitates standardized image acquisition protocols for consistent particle separation and signal quality.
- Involves cross-team alignment on reference channel selection and seed generation parameters.
- Limited by the quality of raw imaging data; cannot compensate for poor labeling or high background.
