Transcriptoom analyse C. elegans RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project
8 april 2017
Galaxy en David hebben zich ontwikkeld tot populaire tools die het mogelijk maken de onderzoekers zonder bioinformatica training te analyseren en RNA-Seq gegevens te interpreteren. We beschrijven een protocol voor C. elegans onderzoekers RNA-Seq experimenten toegang voeren en verwerken dataset behulp Galaxy en zinvolle biologische informatie uit het gen lijsten met behulp DAVID verkrijgen.
Het algemene doel van dit protocol is om C.elegans-onderzoekers zonder bioinformatica-expertise te helpen bij het uitvoeren van een RNA-sequencing-experiment en het analyseren van de gegevens met behulp van het open-accessplatform Galaxy. Deze methode kan helpen bij het analyseren van complexe high-throughput sequencinggegevens om inzichten te verkrijgen in de transcriptomische kenmerken achter fenotypes in C.elegans. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het wetenschappers zonder eerdere bioinformatica-training in staat stelt om ruwe sequencinggegevens te analyseren en een lijst van differentieel tot expressie gebrachte genen te produceren, samen met hun bijbehorende gene ontology-termen.
Hoewel deze methode specifiek is afgestemd op de nuances van C.elegans-sequencinggegevens, kan deze ook worden toegepast op andere organismen en biologische contexten waarbij sleuteltranscriptieveranderingen in genomen moeten worden onderzocht. Deze video behandelt het webgebaseerde gebruik van de Galaxy-pijplijn. Indien haalbaar, voer de workflow lokaal uit.
Download en installeer Galaxy volgens de instructies op de wiki-pagina. Na het gebruik van de start hier tutorial op de Galaxy-startpagina, volg deze video. Het is van cruciaal belang voor de gebruiker om zich vertrouwd te maken en te oriënteren op de Galaxy-gebruikersinterface en de tools die in de workflow worden gebruikt.
Om te beginnen, klikt u op analyseer gegevens in het koptekstpaneel om toegang te krijgen tot de analysehomeview. De voortgangsbalk in de rechterbovenhoek geeft aan hoeveel schijfruimte is gebruikt. Ga vervolgens naar het menu met gereedschappen op het linkerpaneel en klik op NGS RNA-analyse.
Dit biedt opties om alle tools te gebruiken die vereist zijn voor de analyse van RNA-sequentiegegevens. Start nu een nieuwe analysegeschiedenis. Ga naar het geschiedenispaneel aan de rechterkant.
Klik op het tandwielpictogram en kies de optie nieuw maken uit het pop-upmenu. Geef vervolgens een naam onder geschiedenis op om de analyse te identificeren. Om verder te gaan, ga naar het menu met gereedschappen en klik onder gegevens ophalen op de functie bestand uploaden om ruwe fast queue-bestanden te uploaden.
Nadat de taak in de analyse-interface is geopend, klikt u op lokale bestand kiezen of FTP-bestand kiezen om naar en te selecteren de geschikte sequentiegegevens. Standaard zal Galaxy automatisch het bestandstype detecteren. Selecteer vervolgens het organisme uit het pull-down menu, wat in dit geval C.elegans is.
Klik vervolgens op starten om de gegevensupload te starten. Nadat het bestand is geüpload, wordt de actie opgeslagen in het geschiedenispaneel waaruit de gegevens kunnen worden geselecteerd en toegegangen. Converteer nu bestanden van het fast queue-formaat een voor een naar het fast queue sanger-formaat door toegang te krijgen tot het NGS QC en manipulatiemenu, het fast queue groomer te selecteren, het bestand te kiezen onder bestand om te verzorgen.
Selecteer het juiste type snelheidsgelijkheidsscores invoer en voer het gereedschap uit met behulp van de standaardparameters. Het gegevensbestand kan nu worden geanalyseerd. Besteed speciale aandacht aan de bestandsindelingen en testparameters die in het hele protocol worden gebruikt.
Deze kennis is waardevol voor het oplossen van mislukte tests en andere problemen. Kwaliteitscontroletests kunnen worden gebruikt voordat wordt doorgegaan. Details over het uitvoeren ervan worden gegeven in het tekstprotocol.
Zodra een bestand klaar is om te analyseren, kaart u de sequencinggegevens door eerst de NGS RNA-analysesectie te openen en vervolgens op de top hat-tool te klikken. Vul in het vervolgkeuzemenu het antwoord in op de vraag of dit enkele of gepaarde eindgegevens zijn. Kies vervolgens het juiste fast queue-bestand.
Selecteer een ingebouwd gen gebruiken in het volgende vervolgkeuzemenu en kies de referentie C.elegans-genoomgegevens. Selecteer standaard voor alle andere parameteropties en klik vervolgens op uitvoeren. Om de relatieve abundantie van transcripten in de dataset te schatten, selecteert u de cuff links-tool in de NGS RNA-analysesectie en kiest u vanuit het eerste vervolgkeuzemenu het gemappede geaccepteerde treffers bam-formaatbestand dat is verkregen uit top hat-analyse.
Stel vanuit het tweede vervolgkeuzemenu de referentie-annotatie in op het GTF-bestand dat de huidige genoomgegevens bevat. Wanneer de optie biascorrectie uitvoeren wordt gepresenteerd, selecteer ja en voer de taak uit met de standaardinstellingen. Open vervolgens vanuit het NGS RNA-analysemenu de cuff merge-tool om de geassembleerde transcripten te samenvoegen die zijn geproduceerd voor alle RNA-sequentievoorbeelden.
Het eerste vak in het gereedschap laadt alle GTF-bestanden die in de vorige stap zijn geproduceerd met behulp van cuff links. Selecteer nu het geassembleerde transcriptenbestand voor elk van de geteste stammen of omstandigheden, inclusief de biologische replica's van dezelfde stamvoorwaarde. Selecteer ja voor gebruikersreferentie-annotatie en kies het referentiegenoomgegevensbestand.
Selecteer vervolgens ja voor de optie gebruik sequentiegegevens. Dit zal automatisch het juiste referentiegenoom detecteren en kiezen. Laat alle andere parameters in hun standaardinstellingen staan en klik op uitvoeren.
Er wordt een enkel GTF-bestand geproduceerd. Om meerdere stammen of omstandigheden te vergelijken, ga terug naar de NGS RNA-analysesectie en selecteer de cuff div-tool. Selecteer vervolgens vanuit het transcriptenmenu in de cuff div-tool het samengevoegde uitvoerbestand van cuff merge.
Voer vervolgens labels in voor de twee voorwaarden. Ga voor elke voorwaarde naar replica's en selecteer de individuele geaccepteerde treffers-uitvoerbestanden van top hat die overeenkomen met de verschillende biologische replica's van die voorwaarde. Om meerdere bestanden tegelijkertijd te selecteren, houdt u de commando- of control-toets ingedrukt.
Na het selecteren van de bestanden, gebruikt u de standaardparameterinstellingen en klikt u op uitvoeren om de taak uit te voeren. Download differentieel tot expressie gebrachte gegevens door op de opslaan-pictogram in het gendifferentieeltestvak te klikken dat in het geschiedenispaneel is gegenereerd. Om te beginnen, opent u David vanaf de website.
Kies vanuit de koptekst van de webpagina startanalyse. Kopieer de lijst met genen die zijn verkregen uit Galaxy in vak A en selecteer in dit voorbeeld de genidentificator als worm base gene ID
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol ondersteunt onderzoekers die werken met C.elegans bij het uitvoeren van RNA-sequencing-experimenten en het analyseren van de data met behulp van het Galaxy-platform. Het stelt personen zonder bio-informatica-opleiding in staat om complexe sequencing-data effectief te interpreteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genomics
- Bio-informatica
Achtergrond
- RNA-Seq is een krachtige tool voor het analyseren van genexpressie.
- Galaxy biedt een toegankelijk platform voor data-analyse.
- Differentieel genexpressie-onderzoek is cruciaal voor het begrijpen van biologische processen.
- C.elegans dient als modelorganisme voor genetische studies.
Doel van de studie
- Om onderzoekers van C.elegans in staat te stellen RNA-Seq data te analyseren.
- Om inzicht te bieden in transcriptomische signaturen die gerelateerd zijn aan fenotypes.
- Om het begrip van genexpressie te vergemakkelijken zonder dat bioinformatische expertise vereist is.
Gebruikte methoden
- RNA-sequencing van C.elegans monsters.
- Gegevensverwerking met behulp van het Galaxy-platform.
- Identificatie van differentieel tot expressie gekomen genen.
- Gen-ontologieanalyse met behulp van DAVID.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van differentieel tot expressie gebrachte genen.
- Inzichten in gene ontology-termen geassocieerd met de genlijsten.
- Demonstratie van de bruikbaarheid van het Galaxy-platform voor niet-experts.
- Potentiële toepassing van de methode op andere organismen.
Conclusies
- Dit protocol stelt onderzoekers in staat om RNA-Seq-gegevens effectief te analyseren.
- Galaxy en DAVID zijn waardevolle tools voor biologische interpretatie.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor diverse biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Toegankelijke platformen voor transcriptoomanalyse, zoals Galaxy, stellen onderzoeksteams in staat om genexpressieveranderingen te onderzoeken zonder dat hiervoor diepgaande bio-informatica-expertise vereist is, wat de validatie van targets in een vroeg stadium en het mechanistische risicobeheer versnelt. Door de verwerking van RNA-Seq-gegevens en functionele annotatie te stroomlijnen, ondersteunt deze workflow snelle hypothesetesten en portfolio-triage in modelsystemen zoals C. elegans. Deze benadering verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor zowel beginnende als ervaren R&D-teams die kleinschalige transcriptoomstudies uitvoeren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt snelle identificatie mogelijk van differentieel tot expressie gebrachte genen die gekoppeld zijn aan fenotypische veranderingen.
- Ondersteunt functionele annotatieclustering om biologische pathways en mechanismen te verduidelijken.
- Faciliteert hypothese-gedreven analyse van genfuncties in ziekte-relevante modellen.
- Vermindert de afhankelijkheid van gespecialiseerd bio-informaticapersoneel voor de initiële data-analyse.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde workflows voor kwaliteitscontrole en alignment van RNA-Seq data.
- Genereert reproduceerbare genenlijsten voor downstream screening of validatie-assays.
- Waarborgt kwantitatieve output die geschikt is voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Bereidt data voor op enrichment- en gene ontology-analyse om het ontwerp van assays te informeren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt transcriptomische signaturen uit met functionele annotatie ter ondersteuning van biomarker-ontdekking.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie in modelorganismen.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van robuuste genexpressiegegevens.
- Faciliteert vergelijkingen tussen verschillende studies door gebruik te maken van gestandaardiseerde analysepipelines.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze workflow plaatst RNA-Seq-analyse, van ruwe data tot differentiële expressie en functionele annotatie, binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van zowel target-validatie als mechanistische studies.
- Discovery Biology: Stelt teams in staat om hypothesen te testen en genfuncties te verduidelijken met behulp van toegankelijke transcriptomische data-analyse.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve genexpressie-outputs voor een betrouwbare vergelijking van condities.
- Analytics: Integreert statistische drempelwaarden (bijv. p-waarde cut-offs) en enrichment-scores voor een robuuste interpretatie van gegevens.
- Translationeel onderzoek: Verbindt veranderingen in genexpressie met biologische processen die relevant zijn voor preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Biedt een schaalbare, gebruiksvriendelijke pijplijn die aanpasbaar is aan diverse organismen en experimentele contexten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit in onderzoek in een vroeg stadium.
- Operationele waarde: Standaardiseert RNA-Seq-analyse, waardoor de reproduceerbaarheid verbetert en trainingsdrempels worden verlaagd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door de democratisering van data-analyse.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van assets in de ontdekkingsfase.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basiskennis van de Galaxy-gebruikersinterface en workflowmodules.
- Toegang tot computationele infrastructuur voor data-upload en verwerking is noodzakelijk.
- Aandacht voor bestandsformaten, parameterinstellingen en kwaliteitscontroles is vereist.
- Aanpasbaar voor andere organismen met beschikbare referentiegenomen en annotatiebestanden.
- Afhankelijk van nauwkeurige statistische analyse en functionele annotatie voor bruikbare resultaten.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
9:39
Conclusion
3:28
Data Analysis with Tuxedo Suite
0:56
Getting Started with Galaxy
6:19
Gene Ontology (GO) Term Analyses Using DAVID
7:56
Results: Transcriptome Dictated by the Transcription Elongation Factor TCER-1, that Extends Lifespan of Germline-less C. elegans
