Transcriptoom analyse C. elegans RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project
April 8th, 2017
Galaxy en David hebben zich ontwikkeld tot populaire tools die het mogelijk maken de onderzoekers zonder bioinformatica training te analyseren en RNA-Seq gegevens te interpreteren. We beschrijven een protocol voor C. elegans onderzoekers RNA-Seq experimenten toegang voeren en verwerken dataset behulp Galaxy en zinvolle biologische informatie uit het gen lijsten met behulp DAVID verkrijgen.
Het algemene doel van dit protocol is om C.elegans-onderzoekers zonder bioinformatica-expertise te helpen bij het uitvoeren van een RNA-sequencing-experiment en het analyseren van de gegevens met behulp van het open-accessplatform Galaxy. Deze methode kan helpen bij het analyseren van complexe high-throughput sequencinggegevens om inzichten te verkrijgen in de transcriptomische kenmerken achter fenotypes in C.elegans. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het wetenschappers zonder eerdere bioinformatica-training in staat stelt om ruwe sequencinggegevens te analyseren en een lijst van differentieel tot expressie gebrachte genen te produceren, samen met hun bijbehorende gene ontology-termen.
Hoewel deze methode specifiek is afgestemd op de nuances van C.elegans-sequencinggegevens, kan deze ook worden toegepast op andere organismen en biologische contexten waarbij sleuteltranscriptieveranderingen in genomen moeten worden onderzocht. Deze video behandelt het webgebaseerde gebruik van de Galaxy-pijplijn. Indien haalbaar, voer de workflow lokaal uit.
Download en installeer Galaxy volgens de instructies op de wiki-pagina. Na het gebruik van de start hier tutorial op de Galaxy-startpagina, volg deze video. Het is van cruciaal belang voor de gebruiker om zich vertrouwd te maken en te oriënteren op de Galaxy-gebruikersinterface en de tools die in de workflow worden gebruikt.
Om te beginnen, klikt u op analyseer gegevens in het koptekstpaneel om toegang te krijgen tot de analysehomeview. De voortgangsbalk in de rechterbovenhoek geeft aan hoeveel schijfruimte is gebruikt. Ga vervolgens naar het menu met gereedschappen op het linkerpaneel en klik op NGS RNA-analyse.
Dit biedt opties om alle tools te gebruiken die vereist zijn voor de analyse van RNA-sequentiegegevens. Start nu een nieuwe analysegeschiedenis. Ga naar het geschiedenispaneel aan de rechterkant.
Klik op het tandwielpictogram en kies de optie nieuw maken uit het pop-upmenu. Geef vervolgens een naam onder geschiedenis op om de analyse te identificeren. Om verder te gaan, ga naar het menu met gereedschappen en klik onder gegevens ophalen op de functie bestand uploaden om ruwe fast queue-bestanden te uploaden.
Nadat de taak in de analyse-interface is geopend, klikt u op lokale bestand kiezen of FTP-bestand kiezen om naar en te selecteren de geschikte sequentiegegevens. Standaard zal Galaxy automatisch het bestandstype detecteren. Selecteer vervolgens het organisme uit het pull-down menu, wat in dit geval C.elegans is.
Klik vervolgens op starten om de gegevensupload te starten. Nadat het bestand is geüpload, wordt de actie opgeslagen in het geschiedenispaneel waaruit de gegevens kunnen worden geselecteerd en toegegangen. Converteer nu bestanden van het fast queue-formaat een voor een naar het fast queue sanger-formaat door toegang te krijgen tot het NGS QC en manipulatiemenu, het fast queue groomer te selecteren, het bestand te kiezen onder bestand om te verzorgen.
Selecteer het juiste type snelheidsgelijkheidsscores invoer en voer het gereedschap uit met behulp van de standaardparameters. Het gegevensbestand kan nu worden geanalyseerd. Besteed speciale aandacht aan de bestandsindelingen en testparameters die in het hele protocol worden gebruikt.
Deze kennis is waardevol voor het oplossen van mislukte tests en andere problemen. Kwaliteitscontroletests kunnen worden gebruikt voordat wordt doorgegaan. Details over het uitvoeren ervan worden gegeven in het tekstprotocol.
Zodra een bestand klaar is om te analyseren, kaart u de sequencinggegevens door eerst de NGS RNA-analysesectie te openen en vervolgens op de top hat-tool te klikken. Vul in het vervolgkeuzemenu het antwoord in op de vraag of dit enkele of gepaarde eindgegevens zijn. Kies vervolgens het juiste fast queue-bestand.
Selecteer een ingebouwd gen gebruiken in het volgende vervolgkeuzemenu en kies de referentie C.elegans-genoomgegevens. Selecteer standaard voor alle andere parameteropties en klik vervolgens op uitvoeren. Om de relatieve abundantie van transcripten in de dataset te schatten, selecteert u de cuff links-tool in de NGS RNA-analysesectie en kiest u vanuit het eerste vervolgkeuzemenu het gemappede geaccepteerde treffers bam-formaatbestand dat is verkregen uit top hat-analyse.
Stel vanuit het tweede vervolgkeuzemenu de referentie-annotatie in op het GTF-bestand dat de huidige genoomgegevens bevat. Wanneer de optie biascorrectie uitvoeren wordt gepresenteerd, selecteer ja en voer de taak uit met de standaardinstellingen. Open vervolgens vanuit het NGS RNA-analysemenu de cuff merge-tool om de geassembleerde transcripten te samenvoegen die zijn geproduceerd voor alle RNA-sequentievoorbeelden.
Het eerste vak in het gereedschap laadt alle GTF-bestanden die in de vorige stap zijn geproduceerd met behulp van cuff links. Selecteer nu het geassembleerde transcriptenbestand voor elk van de geteste stammen of omstandigheden, inclusief de biologische replica's van dezelfde stamvoorwaarde. Selecteer ja voor gebruikersreferentie-annotatie en kies het referentiegenoomgegevensbestand.
Selecteer vervolgens ja voor de optie gebruik sequentiegegevens. Dit zal automatisch het juiste referentiegenoom detecteren en kiezen. Laat alle andere parameters in hun standaardinstellingen staan en klik op uitvoeren.
Er wordt een enkel GTF-bestand geproduceerd. Om meerdere stammen of omstandigheden te vergelijken, ga terug naar de NGS RNA-analysesectie en selecteer de cuff div-tool. Selecteer vervolgens vanuit het transcriptenmenu in de cuff div-tool het samengevoegde uitvoerbestand van cuff merge.
Voer vervolgens labels in voor de twee voorwaarden. Ga voor elke voorwaarde naar replica's en selecteer de individuele geaccepteerde treffers-uitvoerbestanden van top hat die overeenkomen met de verschillende biologische replica's van die voorwaarde. Om meerdere bestanden tegelijkertijd te selecteren, houdt u de commando- of control-toets ingedrukt.
Na het selecteren van de bestanden, gebruikt u de standaardparameterinstellingen en klikt u op uitvoeren om de taak uit te voeren. Download differentieel tot expressie gebrachte gegevens door op de opslaan-pictogram in het gendifferentieeltestvak te klikken dat in het geschiedenispaneel is gegenereerd. Om te beginnen, opent u David vanaf de website.
Kies vanuit de koptekst van de webpagina startanalyse. Kopieer de lijst met genen die zijn verkregen uit Galaxy in vak A en selecteer in dit voorbeeld de genidentificator als worm base gene ID
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol helpt C.elegans-onderzoekers bij het uitvoeren van RNA-sequencing experimenten en het analyseren van de gegevens met behulp van het Galaxy-platform. Het stelt degenen zonder bioinformatica-opleiding in staat om complexe sequencinggegevens effectief te interpreteren.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genomiek
- Bioinformatica
Achtergrond
- RNA-Seq is een krachtig hulpmiddel voor het analyseren van genexpressie.
- Galaxy biedt een toegankelijk platform voor gegevensanalyse.
- Differentiële genexpressieanalyse is cruciaal voor het begrijpen van biologische processen.
- C.elegans dient als modelorganisme voor genetische studies.
Doel van de studie
- Om C.elegans-onderzoekers in staat te stellen RNA-Seq-gegevens te analyseren.
- Om inzichten te geven in transcriptomische kenmerken gerelateerd aan fenotypes.
- Om het begrijpen van genexpressie te vergemakkelijken zonder bioinformatica-expertise te vereisen.
Gebruikte methoden
- RNA-sequencing van C.elegans-monsters.
- Gegevensverwerking met behulp van het Galaxy-platform.
- Identificatie van differentieel uitgedrukte genen.
- Gene ontologie-analyse met behulp van DAVID.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van differentieel uitgedrukte genen.
- Inzichten in gene ontologie termen geassocieerd met de genlijsten.
- Demonstratie van de bruikbaarheid van het Galaxy-platform voor niet-experts.
- Mogelijke toepassing van de methode op andere organismen.
Conclusies
- Het protocol stelt onderzoekers in staat om RNA-Seq-gegevens effectief te analyseren.
- Galaxy en DAVID zijn waardevolle hulpmiddelen voor biologische interpretatie.
- Deze benadering kan worden aangepast voor verschillende biologische contexten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accessible transcriptomic analysis platforms like Galaxy enable discovery teams to interrogate gene expression changes without requiring deep bioinformatics expertise, accelerating early-stage target validation and mechanistic de-risking. By streamlining RNA-Seq data processing and functional annotation, this workflow supports rapid hypothesis testing and portfolio triage in model systems such as C. elegans. The approach enhances reproducibility and scalability for both novice and experienced R&D teams handling small-scale transcriptomic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid identification of differentially expressed genes linked to phenotypic changes.
- Supports functional annotation clustering to clarify biological pathways and mechanisms.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene function in disease-relevant models.
- Reduces reliance on specialized bioinformatics personnel for initial data analysis.
Screening & Assay Development
- Provides standardized workflows for RNA-Seq data quality control and alignment.
- Generates reproducible gene lists for downstream screening or validation assays.
- Ensures quantitative outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Prepares data for enrichment and gene ontology analysis to inform assay design.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic signatures with functional annotation to inform biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in model organisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust gene expression data.
- Facilitates cross-study comparisons by leveraging standardized analysis pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow positions RNA-Seq analysis from raw data through differential expression and functional annotation within the early discovery to preclinical continuum, supporting both target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Empowers teams to test hypotheses and clarify gene function using accessible transcriptomic data analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression outputs for reliable condition comparison.
- Analytics: Integrates statistical thresholds (e.g., p-value cutoffs) and enrichment scores for robust data interpretation.
- Translational Research: Connects gene expression changes to biological processes relevant for preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, user-friendly pipeline adaptable to various organisms and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes RNA-Seq analysis, improving reproducibility and reducing training barriers.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by democratizing data analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires basic familiarity with the Galaxy user interface and workflow modules.
- Needs access to computational infrastructure for data upload and processing.
- Demands attention to file formats, parameter settings, and quality control steps.
- Adaptable to other organisms with available reference genomes and annotation files.
- Dependent on accurate statistical analysis and functional annotation for actionable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
9:39
Conclusion
3:28
Data Analysis with Tuxedo Suite
0:56
Getting Started with Galaxy
6:19
Gene Ontology (GO) Term Analyses Using DAVID
7:56
Results: Transcriptome Dictated by the Transcription Elongation Factor TCER-1, that Extends Lifespan of Germline-less C. elegans
