Met behulp van een volledige immunohistochemische methode om de innervatie van de galwegen in te studeren Suncus murinus

Het algemene doel van deze procedure is om immunohistochemistry-kleuring van het gehele preparaat te gebruiken voor de visualisatie van de zenuwverdeling in de galwegen van Suncus murinus. Deze methode kan worden gebruikt om de zenuwverdeling van de viscerale organen van veel soorten te analyseren, met name onregelmatige of kleine organen die moeilijk te beoordelen zijn met standaardmethoden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de operatie eenvoudig is.

Het vereist geen ingewikkelde procedures en het heeft een hoge slagingskans. Het uitvoeren van de procedure zal worden gedemonstreerd door Yidan Dai, een afgestudeerde student, en Shuang-Qin Yi, een onderzoeksmedewerker, beide uit mijn laboratorium. Begin door het dier te spoelen met individuele PBS- en 4% paraformaldehyde-perfusies in een afzuigkast.

Injecteer vervolgens twee tot drie milliliter witte neopreenlatex via de perfusiekatheter in de abdominale aorta om de bloedvaten te labelen. En wanneer alle weefsels van belang zijn gelabeld, verwijder de abdominale organen en hun bijbehorende zenuwen en vaten. Injecteer vervolgens ongeveer 0,1 milliliter blauwe neopreenlatex in de galblaas om het galsysteem te labelen en fixeer de weefsels in 4% paraformaldehyde een nacht bij vier graden Celsius voor immunokleuring van het gehele preparaat.

De volgende ochtend breng je het monster over in een glazen fles voor vier een-uur wasbeurten in gedestilleerd water op een nutator op kamertemperatuur. Na de laatste wasbeurt, incubeer de weefsels in vers bereide 1% orthoperiodisch zuur gedurende 20 minuten op kamertemperatuur om eventuele intrinsieke peroxidasereacties te voorkomen. Was vervolgens het monster gedurende 10 minuten in gedestilleerd water op kamertemperatuur, gevolgd door incubatie in vers bereide 0,004% papillon gedurende twee uur in een waterbad met een constante temperatuur van 37 graden Celsius met zacht schudden.

Aan het einde van de incubatie, was het monster gedurende 50 tot 60 minuten met gedestilleerd water. Bewaar vervolgens de weefsels in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius een nacht. De volgende ochtend was je het monster in gedestilleerd water zoals zojuist gedemonstreerd, gevolgd door een tweede incubatie van twee uur in vers bereide papillon.

Was het monster gedurende nog eens 50 tot 60 minuten in gedestilleerd water, gevolgd door overnacht fixatie in 4% paraformaldehyde. Op de derde ochtend was je de weefsels vier keer in gedestilleerd water, gevolgd door immersie in drie opeenvolgende stijgende sucrose-incubaties van 30 minuten. Bevriest vervolgens het monster gedurende 30 tot 60 minuten bij min 20 graden Celsius, gevolgd door volledige ontdooiing bij kamertemperatuur.

Na de derde bevriezings-ontdooicyclus, breng je het monster over in 2% Triton X-100 voor een overnacht incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend breng je het monster over in een container met het primaire antilichaam van belang voor zacht schudden op de nutator bij vier graden Celsius gedurende drie tot zes dagen, afhankelijk van de grootte van het specimen. Na de geschikte labelperiode, verwijder je het ongebonden primaire antilichaam met vier een-uur wasbeurten in PBS op kamertemperatuur en label je het specimen met het geschikte secundaire antilichaam gedurende drie dagen met zacht schudden bij vier graden Celsius.

Aan het einde van de secundaire antilichaam labelperiode, was je het specimen vier keer in PBS. Bewaar vervolgens de weefsels in 10 microliters 30% waterstofperoxide in 100 milliliter vers bereide 0,002% DAB-kleuroplossing bij vier graden Celsius gedurende 16 tot 72 uur met zacht schudden. Wanneer de optimale kleuringsintensiteit is bereikt, breng je het specimen over in 0,04% natriumaziet in PBS om de kleuringsreactie te stoppen.

Dompel vervolgens het monster voorzichtig in een 10 centimeter Petri-schaal met vers PBS en maak gehele preparaatbeelden van de weefsels met behulp van een camera gemonteerd op een stereomicroscoop. Naast de visualisatie van de innervatie van de extrahepatische galwegen, maakt het labelen met antilichaam tegen neurofilament-positieve zenuwvezels ook de ondubbelzinnige identificatie mogelijk van de loop en verdelingsdichtheid van de nervus vagus langs de slokdarm en in de maag. Het labelen van de bloedvaten van de galblaas met witte neopreenlatex toont dunne nerveuze fibrose in hoog contrast met de omringende weefsels, waarbij een hogere dichtheid van innervatie wordt waargenomen in de hals van de galblaas dan in de fundus.

In de bovenste galgang worden twee soorten zenuwbundels gelabeld, de fijne zenuwbundels die een onregelmatig en dicht netwerk van zenuwen vormen en zich op en in de galwegen aanhechtend bevinden, en de dikkere zenuwbundels die parallel aan het oppervlak van de galwegen zijn verdeeld. Het labelen van de gemeenschappelijke galgang met blauwe neopreenlatex en de vaten met witte neopreenlatex maakt de visualisatie van de dunne zenuwvezels aan het einde van de gemeenschappelijke galgang en het gebied van de papilla duodeni mogelijk. Voordat je deze procedure probeert, zorg er dan voor dat je de tijdlijn voor elk van de experimenten doorloopt, aangezien het hele proces twee tot drie weken duurt om te voltooien.

Om het specimen niet te beschadigen bij het veranderen van de oplossingen, giet je de oplossingen altijd uit in plaats van het specimen met pincetten te verwijderen. Nadat je deze video hebt bekeken, zou je deze techniek moeten kunnen toepassen op het labelen van een reeks zenuwen in verschillende viscerale organen.