Toepassing van genetisch gecodeerde Fluorescent stikstofoxide (NO •) Probes, de geNOps, voor real-time beeldvorming van NO • Signalen in afzonderlijke cellen
16 maart 2017
Dit manuscript presenteert protocollen voor de toepassing van nieuwe genetisch gecodeerde stikstofmonoxide (NO•) sondes (geNOps) om NO• schommelingen in één cel in real-time te monitoren met behulp van fluorescentiemicroscopie. De Ca2+-getriggerde NO• vorming op het niveau van individuele endotheelcellen werd gevisualiseerd door geNOps te combineren met een chemische Ca2+ sensor.
Het algemene doel van deze beeldvormingsaanpak is om de stikstofmonoxidesignalen in real time te bewaken op het niveau van individuele cellen met behulp van een nieuwe klasse van genetisch gecodeerde fluorescente stikstofmonoxidesondes, de geNOps. Gezien het belang van stikstofmonoxide in de biologie en fysiologie, is een visualisatie van deze molecuul op cellulair of zelfs subcellulair niveau gewenst sinds het werd ontdekt. We visualiseren de stikstofmonoxidesignalen met nieuwe, relatief eenvoudig gebouwde, op fluorescente eiwitten gebaseerde sondes, de geNOps.
De geNOps reageren direct en onmiddellijk op stikstofmonoxide door fluorescentie demping. Dit betekent dat u de real-time kinetiek van de generatie, diffusie en afbraak van stikstofmonoxide in enkele cellen kunt bewaken. Het belangrijkste voordeel van geNOps is dat u daadwerkelijk naar stikstofmonoxidesignalen kunt kijken met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop.
Begin deze procedure door de opslagoplossing van de endotheliale cellijn of HEK293-cellen te vervangen door één milliliter per putje van de iron(II)booster-oplossing op kamertemperatuur. Incubeer de cellen gedurende exact 20 minuten in het donker. De ijzerbelastingsprocedure is essentieel om volledige responsiviteit van de sondes te krijgen en kan worden aangepast voor verschillende celtypen en toepassingen.
Was daarna de cellen eenmaal met opslagoplossing en incubeer elke put met twee milliliters opslagoplossing gedurende minimaal twee uur op kamertemperatuur om de cellen in evenwicht te laten komen. Vervolgens vervangt u de opslagoplossing door 3,3-micromolaire Fura-2AM in één milliliter opslagoplossing. Bescherm de cellen tegen licht en incubeer ze gedurende 45 minuten.
Na 45 minuten, was de cellen twee keer met opslogoplossing, en incubeer ze opnieuw gedurende minimaal 30 minuten om de cellen in evenwicht te laten komen. Om de procedure te beginnen, bevestigt u eerst een 30-millimeter dekglas bedekt met de endotheliale cellijn of HEK293-cellen in een metalen perfusiekamer. Schakel het beeldvormingssysteem in en plaats vervolgens de metalen perfusiekamer op de microscoop.
Verbind de instroombuis met de bufferreservoirs en schakel vervolgens het perfusiesysteem in. Verbind vervolgens de uitstroom met een vacuümpomp om een constante stroom te garanderen en het wegstromen van het dekglas te voorkomen. Start de zwaartekrachtgestuurde perfusie met fysiologische calciumbuffer met behulp van een semi-automatisch perfusiesysteem.
Definieer vervolgens de beeldvormingsinstellingen met behulp van de respectieve software. Selecteer de excitatiegolflengten 340 nanometer en 380 nanometer voor Fura-2 beeldvorming en 480 nanometer voor het exciteren van G-geNOp. Selecteer vervolgens het beeldvormingsgebied door de xyz-tafel van de microscoop te verplaatsen totdat verschillende fluorescente cellen scherp staan.
Definieer vervolgens de gebieden van belang. Teken de gebieden die verschillende hele enkele fluorescente cellen voor elk beeldvormingsveld bedekken. Definieer vervolgens een achtergrondgebied van vergelijkbare grootte.
Begin met het verzamelen van gegevens op een omgekeerde en geavanceerde fluorescente microscoop met een gemotoriseerde monsterstandaard en een monochromatische lichtbron. Als alternatief, exciteer de cellen op 340 nanometer en 380 nanometer voor Fura-2AM en 480 nanometer voor G-geNOp, respectievelijk. Stel de respectieve belichtingstijden in zodat een duidelijk fluorescent signaal detecteerbaar is over tijd voor alle kanalen.
Verzamel het uitgestraalde licht bij 510 nanometer voor Fura-2AM, 520 nanometer voor G-geNOp met behulp van een CCD-camera met een geschikte filterset bestaande uit de 500-nanometer exciter, een 495-nanometer dichroisch en een 510-520-nanometer emitter. Neem vervolgens elke drie seconden één totaalbeeld op. Neem de eerste drie minuten in fysiologische calciumbuffer op om de basislijn van de respectieve fluorescentiesignalen te verkrijgen.
Zodra een stabiele basislijnfluorescentie wordt waargenomen, schakel over naar 100-micromolaire histamine of ATP bevattende fysiologische calciumbuffer om de cellen drie minuten te stimuleren. Schakel vervolgens terug naar de fysiologische calciumbuffer zonder histamine of ATP en L-NNA gedurende vijf minuten om de verbindingen uit de cellen te verwijderen. Hierna dient u 10-micromolaire NOC-7 toe in de fysiologische calciumbuffer gedurende twee minuten met behulp van het perfusiesysteem.
De stikstofmonoxide donor heeft een sterk effect op de G-geNOp fluorescentie en vermindert meestal de cellen met meer dan 20% als reactie op 10-micromolaire NOC-7. In EA.hy926 cellen is het NOC-7 effect sterker in vergelijking met de agonist-geïnduceerde G-geNOp fluorescentie demping. Was vervolgens de stikstofmonoxide-afgevende verbinding gedurende ongeveer 10 minuten uit met de fysiologische calciumbuffer en stop met opnemen zodra de basale fluorescentie is hersteld.
Hier getoond, zijn de representatieve wide-field fluorescentiebeelden van EA.hy926 cellen die G-geNOp tot expressie brengen die zijn geladen met Fura-2AM. En hier is de representatieve tijdsverloop van de gelijktijdige opnamen van Fura-2 en G-geNOp signalen als reactie op 100-micromolaire histamine. Zoals aangegeven, werd histamine na drie minuten verwijderd met behulp van een perfusiesysteem.
Deze curven vertegenwoordigen de gelijktijdige opnamen van cytosolisch calcium en stikstofmonoxide signalen van een enkele Fura-2AM-geladen endotheelcel die tijdelijk G-geNOp tot expressie brengt. De cellen werden gedurende drie minuten gestimuleerd met 100-micromolaire histamine in een calciumbevattende buffer. En hier getoond, zijn de representatieve gelijktijdig opgenomen calcium en stikstofmonoxide signalen over tijd van een EA.hy926 cel die werd voorbehandeld met 500-micromolaire L-NNA voorafgaand aan meting.
Cellen werden behandeld met 100-micromolaire histamine in aanwezigheid van twee-millimolaire calcium. Deze figure toont de gemiddelde curven die de cytosolische stikstofmonoxide signalen vertegenwoordigen als reactie op één-micromolaire ATP ge
Overzicht
Dit manuscript presenteert protocollen voor het gebruik van genetisch gecodeerde stikstofmonoxide (NO•)-probes (geNOps) om NO•-fluctuaties in individuele cellen in real-time te monitoren via fluorescentiemicroscopie. De studie visualiseert Ca2+-getriggerde NO•-vorming in individuele endotheelcellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Stikstofmonoxide speelt een cruciale rol in diverse biologische processen.
- Realtime visualisatie van NO• op cellulair niveau is al lange tijd een doelstelling.
- Genetisch gecodeerde probes bieden een nieuwe benadering voor het monitoren van NO•-dynamiek.
- Met conventionele fluorescentiemicroscopie is een hoge ruimtelijke en temporele resolutie haalbaar.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van protocollen voor real-time imaging van stikstofmonoxide-signalen in individuele cellen.
- Het gebruiken van geNOps voor het monitoren van de generatie, diffusie en degradatie van NO•.
- Het verbeteren van het begrip van de rol van stikstofmonoxide bij cellulaire signalering.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de endotheliale cellijn of HEK293-cellen met een ijzer(II) boosteroplossing.
- Gebruik van Fura-2AM voor calcium-imaging in combinatie met geNOps.
- Fluorescentiemicroscopie voor het vastleggen van real-time gegevens over NO•- en calciumsignalen.
- Stimulatie van cellen met histamine of ATP om de NO•-respons te observeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van stikstofmonoxidesignalen in real-time.
- Aantoonde effecten van histamine en ATP op de NO•-productie.
- Vastgesteld van een basislijn voor fluorescentiesignalen vóór en na stimulatie.
- Getoond van de responsiviteit van geNOps op stikstofmonoxide-donoren.
Conclusies
- De geNOps-technologie maakt effectieve real-time beeldvorming van stikstofmonoxide mogelijk.
- Deze methode kan verder onderzoek naar stikstofmonoxide-signalering in verschillende celmodellen faciliteren.
- Toekomstige studies kunnen de implicaties van NO• in verschillende fysiologische contexten verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Real-time single-cell imaging van stikstofmonoxide (NO•) dynamiek vult een kritisch gat in het begrip van snelle signaleringsgebeurtenissen die relevant zijn voor ziektebiologie en geneesmiddelenontwikkeling. Het geNOps-platform maakt hoogresolutie kwantificering van de generatie en degradatie van NO• mogelijk, wat mechanistische risicoreductie en targetvalidatie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen voor portfoliotriage en de continuïteit van translationeel onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van NO•-signaleringskinetiek in levende cellen mogelijk voor functionele onderzoeking van targets.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door stimulus-afhankelijke NO•-responsen op single-cell niveau te kwantificeren.
- Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden door NO•-fluctuaties te correleren met upstream triggers, zoals Ca2+-influx.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor de verdere ontwikkeling van NO•-modulerende targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gevalideerd, genetisch gecodeerd probesysteem voor reproduceerbare NO•-detectie in diverse celmodellen.
- Maakt kwantitatieve real-time read-outs mogelijk die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en downstream screening-workflows.
- Ondersteunt duale parameter-imaging (bijv. NO• en Ca2+) voor de ontwikkeling van gemultiplexte assays.
- Faciliteert de betrouwbare evaluatie van NO•-donorverbindingen en pathway-modulatoren.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde systemen door NO•-monitoring mogelijk te maken in fysiologisch relevante celtypen.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door NO•-dynamiek te koppelen aan functionele cellulaire uitkomsten.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie voor NO•-gerelateerde mechanismen.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve NO•-signaleringsgegevens.
Integratie van Pipeline & Workflow
De geNOps-technologie integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot assay-ontwikkeling en translationeel onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en pathway-mapping door real-time kwantificering van het NO•-signaal mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van verbindingen en assay-gereedheid.
- Analytiek: Biedt temporele en spatiale gegevens met een hoge resolutie voor comparatieve analyse van NO•-responsen.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen de ontdekkingsfase en preklinische fasen door NO•-monitoring in ziekterelateerde modellen mogelijk te maken.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Biedt een modulair, genetisch gecodeerd platform dat aanpasbaar is voor verschillende celtypen en experimentele opstellingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in NO•-gerelateerde pathways.
- Operationele waarde: Standardiseert de NO•-detectie met schaalbare, reproduceerbare protocollen voor diverse R&D-teams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste functionele readouts.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van NO•-modulerende targets en verbindingen mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en live-cell imaging.
- Toegang tot geavanceerde imaging-systemen met geschikte filtersets en software is noodzakelijk.
- Standaardisatie van probe-loading en imaging-protocollen over verschillende teams heen is vereist.
- Aanpassing kan noodzakelijk zijn voor verschillende celtypen of experimentele condities.
- De responsiviteit van de probe is afhankelijk van de ijzerbelading en celspecifieke factoren.
