EEG opnemen bij vrij bewegende neonatale ratten met behulp van een nieuwe methode

Het algemene doel van deze methode is het registreren van EEG's bij vrij bewegende neonatale ratpupjes, met behulp van een nieuwe elektrode-opstelling die een week of langer stabiel blijft. Deze methode zal antwoord geven op belangrijke vragen in het veld van de neurowetenschappen en zal nuttig zijn bij de studie naar neonatale epilepsie. Door deze techniek te gebruiken, kunnen hoogwaardige en stabiele EEG-signalen over langere tijdsperioden worden geregistreerd.

Dit zal helpen bij de diagnose van diverse neuropathologische aandoeningen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat pasgeboren ratten van p8 tot p15 zeer moeilijk te hanteren zijn en grote zorg vereisen. De elektrode vereist een getande verbinding om te kunnen functioneren als signaalinterface met de communicatieapparatuur.

Een computer-pinlo-sai vervult deze rol. Scheid voorzichtig de mannelijke en vrouwelijke pinnen van een computer-pinlo-sai met behulp van een tang. Verbind vervolgens de mannelijke en vrouwelijke pinnen met elkaar om een elektrode te vormen en zet de verbinding vast met cyanoacrylaat.

Maak meerdere van dergelijke elektroden. Zodra de verbindingen zijn uitgehard, plaatst u de elektroden tien minuten lang in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water. Plaats ze vervolgens in een ultrasoonreiniger om de elektroden te reinigen.

Plaats het bekerglas vervolgens in een oven die is ingesteld op 45 °C en verhit deze gedurende een half uur. Steriliseer tot slot de elektroden met een UV-blootstelling van 30 minuten. Zet in een veiligheidskabinet eerst de gesteriliseerde chirurgische instrumenten en een gesteriliseerd stereotaxisch apparaat klaar voor de operatie.

Anestheseer vervolgens de pasgeboren ratpup met twee punt vijf procent isofluraan. Wanneer de pup diep onder narcose is, wordt de isofluraanconcentratie verlaagd naar één procent. Controleer voorafgaand aan de verdere procedure met een knijptest in de teen of de rat voldoende is geanestheseerd.

Fixeer vervolgens de kop van de pop in het stereotaxisch apparaat. Plaats de oorstaven in de gehoorgangen en draai de staven voorzichtig vast. Let op: de schedel van een neonate is zeer zacht.

Maak nu een midline incisie van vijftien millimeter in de schedel. Trek vervolgens met een pincet voorzichtig de hoofdhuid uiteen om de incisie te verbreden. Gebruik een stukje met zoutoplossing gedrenkt watten om de incisie open te houden.

Lokaliseer nu het bregma en de lambda en markeer deze met een potlood. De volgende stappen voor de implantatie van de elektroden zijn cruciaal en moeten nauwkeurig worden uitgevoerd. Maak eerst, met een naald van 26 gauge, een boorgat in de prefrontale cortex, 2 mm anterior van het bregma en binnen 0,5 mm van de middellijn.

Maak vervolgens een boorgat in de hippocampus op 1,8 mm posterieur ten opzichte van het bregma en 0,5 mm lateraal van de middellijn. De naald mag niet meer dan 2 mm onder het corticale oppervlak penetreren om hersenschade te minimaliseren. Plaats nu met een pincet de referentie-elektrode in het gat in de cortex en voer de registratie-elektroden in het gat in de hippocampus in.

Breng vervolgens erythromycinezalf aan rond de elektroden en fixeer de elektroden op hun plaats met cyanoacrylaat. Terwijl de lijm uithardt, wordt tandcement bereid tot een kleverige en viskeuze consistentie. De viscositeit van het tandcement is van kritiek belang.

Als het tandcement te dun is, kan dit leiden tot de opbouw van een ongewenste isolerende laag onder de elektrode. Als het cement te dik is, zullen de elektroden gemakkelijker loslaten vanwege de overtollige massa. Droog de schedel en de elektroden grondig voordat u het cement aanbrengt.

Bevestig vervolgens de elektroden aan de schedel met tandheelkundig cement. Breng daarna wat picrinezuur aan op de elektroden om ze een extra beschermlaag te geven. Verwijder nu het dier uit het stereotaxische frame en injecteer subcutaan 300 microliters van een tien procent glucose-oplossing.

Plaats het dier vervolgens op een warmtedeken om het op 37 °C te houden totdat het weer kan lopen. Zodra het dier mobiel is, dient buprenorfine te worden toegediend om postoperatieve pijn te bestrijden, waarna het pupje naar de thuiskooi bij de moeder wordt overgebracht. Wacht vóór gebruik van het implantaat ten minste twee dagen zodat het pupje kan herstellen.

Huis na de herstelperiode de pup alleen en maak ongeveer tien minuten lang opnames, zodat de pup gewend kan raken aan de omgeving. Sluit de elektroden aan op een versterker en verbind de versterker met een AD-converter die is aangesloten op een computer. Zorg ervoor dat deze verbindingen niet in de knoop raken.

Select vervolgens op de gegevensacquisitie-eenheid een bemonsteringssnelheid van ten minste 10.000 hertz voor de opname en controleer of de gegevensoverdracht correct verloopt. Maak een basislijnmeting. Injecteer de pup na het maken van de basislijnmeting intraperitoneaal met kaininezuur om epileptische aanvallen op te wekken.

Observeer en registreer vijftien minuten na de injectie de epileptische ontladingen. Sla de gedigitaliseerde gegevens op en analyseer deze met behulp van software voor signaalverwerking. Bepaal het vermogensniveau van verschillende frequentiecomponenten in de neonatale EEG's middels power spectrum analyse.

Bereken het vermogen vanuit tijdsvensters van één minuut door de root mean square-amplitude te bepalen van één tot honderd hertz, wat de EEG-band is. Tien minuten na de injectie met kainzuur werden recurrente interictale en ictale EEG-ontladingspatronen geregistreerd. De meest voorkomende geregistreerde aanvallen waren van het tonisch-clonische type.

De duur van de ictale tonische fase bedroeg ongeveer vijftien seconden. Er werd ook waargenomen dat tonische ontladingen werden gevolgd door clonische bursts. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u elektroden implanteert en hoogwaardige EEG-registraties verkrijgt van pasgeboren rattenpups van p8 tot p15.

Zodra de voorbereidingen zijn getroffen, kan de cervicale implantatie in minder dan tien minuten worden voltooid, afhankelijk van de complexiteit van de operatie.