ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een ARC DECRA aan PRJ (DE120101311) en door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onderzoek subsidie ​​op LP (PO 1440 / 1-1). De Australische Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door fondsen van de staat regering van Victoria en de Australische federale regering. Wij erkennen Dr Jeremy Ng Chi Kei, die experimenten hier beschreven, zoals gepubliceerd in Kei et al uitgevoerd. , 2016. We zijn dankbaar voor de bepalingen van transgene vis uit Prof. Higashijima en dank Profs. Turner en Rupp voor de levering van de pCS2 + plasmide en Dr. Wilkinson voor het genereren van H2B-RFP en H2A-GFP constructen. Wij danken FishCore faciliteit personeel (Monash University) voor het verzorgen van onze dieren.

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish%3A+EMBO+practical+course%2C+KIT%2C+Sept.+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23(2013).</li>
<li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li>
<li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vsx2+in+the+zebrafish+retina%3A+restricted+lineages+through+derepression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14(2009).</li>
<li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li>
<li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2(2006).</li>
<li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alx%2C+a+zebrafish+homolog+of+Chx10%2C+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li>
<li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li>
<li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep04898">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898(2014).</li>
<li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li>
<li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li>
<li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1894769">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li>
<li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li>
<li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+goldfish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li>
<li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Inzicht in de mate waarin naburige cellen beïnvloeden timing van de expressie van cruciaal lot van de cel bepalend is essentieel als doel efficiënt instrueren embryonale of geïnduceerde multipotente stamcellen te differentiëren in een bepaalde post-mitotische celtype of weefsel patroon. Het bestuderen deze moleculaire gebeurtenissen in de ontwikkeling van cellen van de levende dieren verschaft bovendien relevante dynamische (temporele en ruimtelijke) gegevens over de specifieke cellulaire contexten gerelateerd aan deze ...

<html> De mogelijkheid om belangrijke ontwikkelingsprocessen in een in vivo vertebrate visualiseren heeft bijgedragen dat de zebravis een belangrijk model voor de studie van normale en zieke omstandigheden (besproken in 1, 2). Vooral de neurale retina is een toegankelijk deel van het centrale zenuwstelsel. Het netvlies leent zich gemakkelijk studies van neurogenese voeren vanwege de goed georganiseerde, maar relatief eenvoudige structuur en zijn sterk geconserveerd neuron types in gewervelde species 3. Dynamiek van cellulaire gedrag zoals proliferatie, celcyclus exit asymmetrische celdeling, het lot specificatie, differentiatie en neurale vorming circuits kan het gehele proces van retinogenesis, die de centrale retina van de zebravis wordt aangevuld met 3 d postfertilization volgen ( dpf) 4, 5,ref &quot;&gt; 6, 7. Bovendien kan de functionele eisen van verschillende genen in elk van de bovengenoemde stappen gelijktijdig worden beoordeeld in de zebravis netvlies, waardoor een voordeel boven andere vertebraat modellen waarin fenotypen uit de toepassing van gen knockout technieken kunnen alleen worden beoordeeld na autopsie van gefixeerde weefsels. Met name het gebruik van transgene lijnen waarin we visualiseren en controleren de expressie van fluorescerende eiwitten reporter transgenen in de retina, kunnen we tijdresolutie van genexpressie die het ontstaan ​​van een bepaald celtype neuronale grondslag verkrijgen. Door de snelle ontwikkeling van de zebravis, kunnen deze gebeurtenissen worden gevisualiseerd gedurende de gehele ontwikkelingsperiode, waardoor diepere inzichten in de temporele belang van genexpressie ten opzichte van neuronale cellen identiteitsverwerving en celgedrag. Tenslotte kunnen deze benaderingen efficiënt gecombineerd in de zebravis met de productie van chimeer via transplantaties, waardoor inzicht in twee belangrijke aspecten van genfunctie. Ten eerste behandeling getransplanteerd van een donor embryo, waarin een bepaald gen werd neergeslagen terwijl zij ontwikkelen een ongelabeld wildtype milieu, kunnen we relevante informaties genfunctie in een cel-autonome wijze te verkrijgen. Dit leidt tot belangrijke inzichten over de functie van retinale lot bepalende factoren binnen de progenitorcellen zij worden doorgaans uitgedrukt in. Een voorbeeld hiervan is het onderzoek van de ontwikkeling lot resultaat van voorlopers die niet meer functioneel eiwit te genereren van deze genen 4, 6, 8, 9. Met behulp van deze aanpak, hebben we laten zien dat veel lot bepalende factoren (bijvoorbeeld Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handelen cel-autonomously specifieke retinale neuronale lot te rijden; het ontbreken van genexpressie voornamelijk leidt tot een lot schakelaar, zodat de cellen met gen knockdown levensvatbare door eerst een alternatieve lot van de cel 4, 6, 7, 10 blijven. In de tweede plaats kan een dergelijke chimerische experimenten worden gebruikt om te beoordelen hoe wild type voorouders gedragen wanneer ze binnen de verschillende genetische omgevingen te ontwikkelen. Bijvoorbeeld door vergelijking van de ontwikkeling van WT cellen die gewoonlijk een gen van belang (en reporter transgen) in WT versus gemanipuleerde nieuwe omgeving (bijvoorbeeld gen knockout / knockdown) tot expressie, de daaruit voortvloeiende effecten op genexpressie en lot van de cel kan worden beoordeeld . Het ontbreken van bepaalde neuronen in de nieuwe omgeving, bijvoorbeeld, is aangetoond dat wild type voorlopercellen te beïnvloeden in een cel non-autonome wijze, om vertekening hen naar differentiatie in de ondervertegenwoordigd or ontbrekende neuron typen 4, 7, 11, 12. Gezien het feit dat het netvlies neuronen worden geboren in een geconserveerd histogenic bestelling door de opeenvolgend getimede expressie van specifieke neuronale lot determinant genen (lot genexpressie) (beoordeeld in 13), gebruikten we deze methoden om aan te tonen hoe de timing van het lot genexpressie in wild type voorlopers wordt beïnvloed wanneer dergelijke voorlopers ontwikkelen retinale hostomgevingen met geïnduceerde afwijkende cellulaire composities. Hier schetsen we deze benaderingen als bewijs voor hoe de combinatie van relatief standaard en meest gebruikte technieken maakt het onderzoek naar de timing van het lot genexpressie in de ontwikkeling van het netvlies voorouders 8, 9. Dit protocol beschrijft een experimentele benadering combineren time-lapse imaging met het gemak van perhet vormen van transplantatie in de ex vivo ontwikkeling van de zebravis embryo individuele mosaically volgen gelabelde cellen gedurende de gehele periode van ontwikkelings retinogenesis. Door het uitvoeren van functionele gen manipulaties, hetzij in de gastheer embryo, donor embryo, beide of geen van beide, kan men de cel autonomie van gen-functie te beoordelen. Deze benadering kan wijd aangepast soortgelijke vraagstellingen in andere systemen waarvoor de afzonderlijke componenten hier beschreven geschikt.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Agarose gecoate schalen kunnen een paar dagen van tevoren worden voorbereid, afgesloten met parafilm om uitdrogen te voorkomen en bewaard worden bij 4 &#176;C</td></tr><tr><td>Agarose low melt</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>Kan in groter volume worden voorbereid, in de magnetron worden verwarmd om te vloeibaar te maken en vervolgens gesmolten worden gehouden in een 40 &#176;C waterbad. 1 mL aliquots kunnen worden voorbereid (één voor elke groep embryo's die worden gemonteerd).</td></tr><tr><td>borosilicaat glas capillairbuis zonder filament</td><td>SDR Scientific</td><td>30-0035</td><td>alternatieven met vergelijkbare diameter kunnen worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>borosilicaat glas capillairbuis met filament</td><td>SDR Scientific</td><td>30-0038</td><td>alternatieven met vergelijkbare diameter kunnen worden gebruikt&nbsp;</td></tr><tr><td>glas petrischalen (60 mm diameter)</td><td>Science Supply</td><td>1070506</td><td>elke glazen alternatief van elke maat</td></tr><tr><td>Injectiebuis (2 m)</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>Dit verbindt de naaldhouder met de spuit tijdens transplantatie</td></tr><tr><td>Microinjectievorm (kunststof mal met wigvormige uitsteeksels)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>PT-1</td><td>alternatieven met vergelijkbare vorm kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>micronaaldhouder</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>elke alternatief dat past bij de buitendiameter van de injectienaalden kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>microinjector</td><td>Narishige of Eppendorf Femtojet</td><td></td><td>Pneumatische injector die gasdruk gebruikt</td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>vergelijkbare alternatieven kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>microloader tip</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mineralolie</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>naaldtrekker</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-2000</td><td>Instellingen gebruikt voor deze trekker zijn: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Elke naaldtrekker kan worden gebruikt als deze resulteert in een geschikte tipafmeting</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td><td>elke paraffine film</td></tr><tr><td>Pasteur pijpje plastic</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pijpje glas</td><td>Hirschmann Laborgeräte</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp;Protease Type XIV</td></tr><tr><td>N-fenyl thioureum</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTU is giftig en kan worden bereid als een stockoplossing om frequente blootstelling aan het poeder te vermijden, raadpleeg MSDS voor aankoop/gebruik.</td></tr><tr><td>Qiaquick gel extractie</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>elke alternatieven om DNA te zuiveren kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Rneasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>elke alternatieven om RNA te zuiveren kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>SP6 mMessage kit</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>elke alternatieven om DNA te transcriberen met behulp van SP6</td></tr></tbody></table>

in vivo beeldvorming van transgene gene expression individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to cell nonautonomous invloeden studie

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

De genetische en technische troeven hebben de zebravis gewervelde een belangrijk modelorganisme waarin de gevolgen van gen-manipulaties kunnen worden getraceerd in vivo gedurende de snelle ontwikkelingsperiode gemaakt. Meerdere processen kunnen worden onderzocht waaronder celproliferatie, genexpressie, celmigratie en morfogenese. Belangrijk, kan het genereren van chimeren door middel transplantaties gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor mozaïek etikettering en volgen van individuele cellen onder invloed van de nieuwe omgeving. Bijvoorbeeld, door het combineren functioneel gen manipulaties van de ontvangende embryo (bijvoorbeeld door micro-injectie morfolino) en levende beeldvorming, de effecten van extrinsieke signalen nonautonomous cellen (aangeleverd door de genetisch gemodificeerde milieu) individuele getransplanteerde donor cellen kan worden geëvalueerd. Hier laten we zien hoe deze aanpak wordt gebruikt om het begin van fluorescerende transgenexpressie vergelijken als proxy voor de timing die het lot determinatie in verschillende genetische host-omgevingen. In dit artikel geven we het protocol voor microinjecting zebravis embryo&#39;s donorcellen te markeren en te-gen knock-down in gastheer embryo&#39;s, een beschrijving van de transplantatie techniek die wordt gebruikt om chimere embryo&#39;s te genereren, en het protocol voor de voorbereiding en uitvoering in vivo time-lapse confocale veroorzaken beeldvorming van meerdere embryo. Vooral uitvoeren op meerdere beeldvorming is cruciaal bij het vergelijken van de timing van gebeurtenissen zoals het ontstaan ​​van genexpressie. Dit vereist het verzamelen van gegevens uit meerdere controle en experimentele embryo&#39;s tegelijk verwerkt. Een dergelijke benadering kan eenvoudig worden uitgebreid voor onderzoek extrinsieke invloeden in een orgaan of weefsel van keuze toegankelijke imaging leven, mits transplantaties gemakkelijk kunnen worden gericht volgens de gevestigde embryonale lot kaarten.

Dit werk geeft een experimentele protocol om veranderingen in genexpressie timing beoordelen wanneer wild type netvlies voorouders ontwikkelen binnen een morphant gastheer embryo. De experimentele gastheer embryo&#39;s Ptf1a morphants, die de tussenliggende geboren horizontale en amacrine interneuronen van het netvlies 7, 26 missen. Deze werden vergeleken gastheer embryo&#39;s die waren geïnjecteerd met een standaard controle mor...

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Het algemene doel van deze procedures is om te bestuderen hoe veranderingen in genexpressie, zowel binnen ontwikkelende cellen als in hun directe omgeving, temporele processen tijdens de ontwikkeling beïnvloeden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen, zoals of de timing van de lotbepaling wordt aangestuurd door genen die cel-autonoom binnen een cel worden tot expressie gebracht, of cel-niet-autonoom in naburige cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in de mogelijkheid om individuele progenitorcellen in een in vivo gewerveld dier te volgen terwijl de cellen zich ontwikkelen in genetisch verschillende omgevingen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Stefanie Dudczig, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium. Nadat de zebratvisembryo's en de micro-injectienaaldjes met Morpholinos of mRNA zijn voorbereid volgens het tekstprotocol, wordt de naaldpunt ondergedompeld in een druppel minerale olie in een schaaltje. Meet het injectievolume door op het voetpedaal te drukken en pas de gasdruk en/of de duur aan totdat het injectievolume gelijk is aan 1 nanoliter, gemeten met een micrometer-objectglas of eventueel met het oculair-meetraster.Plaats een microscoopglasplaatje in een Petrischaal en breng met een transferpipet embryo's in het enkelcellige stadium aan langs de rand van het glaasje. Verwijder vervolgens met een fijne transferpipet zoveel mogelijk vloeistof om bewegingen tijdens de injecties te voorkomen. Lijn de embryo's daarna uit in een enkele kolom met behulp van een Microloader-pipetpunt waarvan de helft van de dunne punt is afgeknipt.Breng vervolgens de naald naar een embryo in het eencellige stadium en doorboor het chorion en de dooier in één vloeiende beweging. Zodra de naaldpunt in het midden van de dooier is geplaatst, druk dan één keer op het voetpedaal en micro-injecteer één nanoliter H2AGFP of H2BRFP mRNA in de dooier van het embryo in het eencellige stadium. Verwijder de injectienaald, verschuif de schaal met de embryo's om het volgende embryo in positie te brengen en ga door met injecteren totdat de gehele kolom embryo's is geïnjecteerd.Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, kantelt u de schaal onder een hoek van 30 tot 45 graden en gebruikt u een zachte stroom E3-medium vanuit een knijpfles om de geïnjecteerde embryo's over te brengen naar een nieuwe, schone Petrischaal. Drie uur na bevruchting controleert u de donor-embryo's op labelingsignaal onder een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 2X tot 5X met behulp van een RFP-filter. Selecteer goed ontwikkelde embryo's met een sterk fluorescent signaal.Nadat de injectieplaten en petrischalen volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt de punt van een langwerpige, fijngetrokken glazen Pasteurpipet op een lengte gesneden die een comfortige hantering mogelijk maakt; gebruik hiervoor een diamantmes om de naald in te krassen terwijl deze wordt gedraaid totdat de punt afbreekt. Zorg ervoor dat de snede recht is. Om beschadiging van de gedechorioneerde embryo's te voorkomen, wordt de glazen overdrachtspipet vervolgens vlamgepolijst door het gesneden oppervlak in een bunsenbrander te draaien om gladde uiteinden te verkrijgen.Om de embryo's te dechorioneren, plaatst u goed ontwikkelde gast- en donorembryo's in twee afzonderlijke Erlenmeyerglazen bikaers van 10 milliliter en verwijdert u zoveel mogelijk vloeistof. Voeg 5 milliliter van de eerder bereide protease-oplossing van 0,5 milligram per milliliter toe aan elke bikaer en draai voorzichtig met de embryo's terwijl u deze onder een dissectiemicroscoop observeert. Terwijl u blijft draaien, gebruikt u zodra het eerste embryo uit het chorion is gekomen E3-medium om drie keer snel te spoelen om de protease-oplossing te verwijderen door het grootste deel van de vloeistof weg te gieten en de bikaer opnieuw te vullen door voorzichtig E3 langs de wand in te gieten.Stop de enzymatische dechorionering door snel maar voorzichtig te spoelen zodra de eerste paar gedechorioneerde embryo's zichtbaar zijn. Kies voor de transplantaties uitsluitend gedechorioneerde embryo's die een symmetrische celmassa hebben en geen duidelijke deformaties of beschadigingen aan de dooierzak vertonen. Om de blastula-transplantatie uit te voeren, plaatst u de naald in de naaldhouder en verbindt u deze met de slang van het transplantatieapparaat.Test de afdichting door de spuit handmatig te bedienen om vloeistof door de naald aan te zuigen en weer uit te stoten. Breng vervolgens met een glazen pipet de donorembryo's over naar de eerste kolom van de agarosemal. Breng daarna de gastembryo's over naar de kolommen twee tot en met zes van de agarosemal.Plaats de transplantatienaald voorzichtig op de blastomeercellen van een donorembryo en zuig langzaam ongeveer 20 tot 50 cellen op in de transplantatienaald. Vermijd het opzuigen van de dooier. Til de transplantatienaald met behulp van de micromanipulator uit het donorembryo.Verplaats de injectieschaal naar links en steek de punt van de transplantatienaald door de zijkant van de celmassa, in de dierpool van het eerste gastembryo. Deponeer vijf tot 10 cellen nabij het oppervlak, overeenkomstig een fate-mapping die aantoont dat dit gebied het oogveld van de voorhersenen vormt. Om de embryo's te monteren voor beeldvorming, zuigt u maximaal vijf embryo's op in een plastic transferpipet en laat u de embryo's door zwaartekracht in de punt ophopen.Raak met de transferpipet het oppervlak aan van een eerder geprepareerde plastic buis met 1% low-melt agarose, zodat de embryo's in de buis zakken terwijl de hoeveelheid E3-transfer wordt beperkt. Verplaats vervolgens de vijf embryo's van de plastic agarosebuis naar een petrischaal met 0,5 tot één milliliter agarose en verwijder met dezelfde transferpipet het overtollige agarose zodat er slechts een kleine druppel overblijft. Gebruik een microladingpipet waarvan de tip is afgebroken om de embryo's lateraal uit te lijnen totdat de agarose stolt.Ga vervolgens door met het monteren van maximaal vijf embryo's tegelijk, in individuele agarose-druppels. Vermijd bij beeldvorming met een rechtopstaande microscoop het plaatsen van embryo's binnen één centimeter van de rand van de Petrischaal. Gebruik aanvullende 1% low-melt agarose om de agarose-druppels aan de zijkant van de schaal met elkaar te verbinden, om verschuivingen en zijdelingse bewegingen tijdens de beeldvorming te voorkomen.Kies embryo's met de juiste montagehoek en een sterke hartslag, en een klein aantal getransplanteerde donorcellen voornamelijk in het anterieure ventrale kwadrant van de ontwikkelende retina, waar de golf van genexpressie begint. Voer de beeldvorming uit volgens het tekstprotocol. Zoals in deze figuur wordt getoond, resulteert micro-injectie van één nanoliter mRNA in de dooier van embryo's in het eencellige stadium in fluorescentie-reportereiwitexpressie drie uur na bevruchting; in dit stadium worden de helderste donoren geselecteerd.Op 24 uur na bevruchting werden embryo's met getransplanteerde donorcellen op de relevante locaties in het netvlies gedurende 16 tot 24 uur onderworpen aan time-lapse imaging. Deze confocale afbeelding van een enkele optische Z-sectie toont een overlay van het brightfield in rode kanalen bij het ontwikkelende oog, met enkele gelabelde donorcellen in het rood binnen een verder ongelabelde gastomgeving. Deze micrografen zijn afkomstig uit time-lapse imaging van ontwikkelende wild-type donorcellen uit atoh7:gapGFP transgene embryo's die zijn getransplanteerd in een ongelabelde wild-type gast.Het begin van de transgene expressie is voor een paar cellen aangegeven, zoals hier te zien is. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen de micro-injecties binnen twee uur worden uitgevoerd, en kunnen de selectie, preparatie en transplantatie van embryo's op dezelfde dag binnen drie uur worden voltooid. Na of parallel aan deze procedures kunnen we embryo's ook fixeren op specifieke leeftijden voor post-mortem analyse.We kunnen bijvoorbeeld kwantificeren welk percentage donorcellen een bepaald gen of eiwit tot expressie brengt, een specifieke morfologie vertoont of naar een bepaalde locatie is gemigreerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u zebravissenembryo's genetisch kunt manipuleren en chimeren kunt creëren tussen genetisch verschillende donoren en gastheren. U zou ook in staat moeten zijn om de embryo's te monteren voor in vivo time-lapse imaging om vragen te beantwoorden die niet in gefixeerd weefsel beantwoord kunnen worden.

in-vivo-imaging-transgenic-gene-expression-individual-retinal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Zebravis celtransplantatie maakt de combinatie van genetica en embryologie aan het weefsel specifieke hersenschimmen te genereren. Deze video toont gastrula geënsceneerde cel transplantaties die hebben onze lab naar de rol van astroglial bevolking en de specifieke begeleiding signalen tijdens commissuur vorming in de voorhersenen te onderzoeken.

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

Demonstreren we een protocol om chimere zebravis embryo's te genereren voor live-imaging cellulaire gedrag tijdens de embryogenese.

Transplantatie van GFP-expressie blastomeren voor Live Beeldvorming van het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen in chimère zebravis embryo&#39;s

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.

Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy

Imaging retinale weefsel kan informeren eencellige die niet kunnen worden verzameld van traditionele biochemische methoden. Dit protocol beschrijft voorbereiding van retinale segmenten van zebravis confocal imaging. Fluorescerende genetisch gecodeerd sensoren of indicator kleurstoffen toestaan visualisatie van tal van biologische processen in verschillende retinale celtypes.

Voorbereiding verse retinale segmenten van volwassen Zebrafish voor Ex Vivo Imaging experimenten

Leer hoe je in vivo beeldvorming van individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s gebruikt om cel-nonautonome signalering tijdens neurogenese te bestuderen.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryos to Cell Nonautonomous Invloeden Studie (Video) | JoVE Journal

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo's to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Meer video's verkennen