Name: Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer fluorescente kleuring van erytrocyten en leukocyten voor het bestuderen van bloedceldynamiek in de retinale circulatie van de muis. Deze methode biedt inzicht in retinale ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoeksproject werd gefinancierd uit New Investigator grant van de National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Het team wil graag de onderzoeksopleiding ontvangen die aan Dr Agrawal bij het Institute of Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) is verstrekt aan de National Medical Research Council (NMRC) overzeese onderzoeksopleiding van november 2012 tot oktober 2014 onder mentorschap van prof. David Shima. Dr. Agrawal verwierf het concept en de vaardigheden om de cellen te labelen en live imaging te produceren in het lab van Dr. Shima. Het team zal bijgevolg het toezicht en de begeleiding tijdens de training van prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh en Dr. Daiju Iwata erkennen.

De dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van SingHealth, Singapore en zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde (ARVO) Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkunde en visie Onderzoek. 1. Etikettering van erytrocyten en leukocyten met fluorescerende kleurstoffen <ol><li> Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid ICG (1,5 mg / ml) door 3 mg ICG op te lossen in 1800 μL gesteriliseerd gedistilleerd water. Voeg 200 μl 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe. </li><li> Bereid 40% 1x PBS door 4 ml 1x PBS toe te voegen aan 6 ml gesteriliseerd gedestilleerd water. Bereid 1% boviene serumalbumine (BSA) in PBS door 100 mg BSA toe te voegen aan 10 ml 1x PBS. Meng goed tot de BSA is opgelost. </li></ol></li><li> Isolatie van erytrocyten en leukocyten onder toepassing van dichtheidsgradiëntcentrifugatie <ol><li> Verdoof de muizen (wild tyPe C57BL / 6) met behulp van een combinatie van ketaminehydrochloride (50 mg / kg) en xylazinehydrochloride (0,5 mg / kg) (volgens schema 1, onder ARVO richtlijnen). Bevestig de verdoving door het terugtrekken van de pedaal ( bijv . De knijp). </li><li> Steek de 29-gaalsnaald langzaam in (bij een 1 ml spuit) in een kogelhoek gericht naar het hart. Om te bevestigen dat de naald in het hart zit, trek de plunjer een beetje uit en controleer of bloed in de spuit is opgenomen. Blader 0,8 - 1 ml bloed direct uit het hart. </li><li> Zet het bloed onmiddellijk over in een ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) (1,8 mg / ml bloed) met bloedinzamelbuis en meng zachtjes om bloedstolling te voorkomen. </li><li> Euthanize de muizen door middel van intraperitoneale injectie van pentobarbital (80 mg / kg). </li><li> Laag het gehele bloed op een polysucrose- en natriumdiatrizoaatoplossing (1: 1 verhouding: dichtheid 1,077 g / ml) in een 2 ml microcentrifugebuis en centriFuge (450 xg, 30 min) om de scheiding van de leukocyten en erytrocyten uit het plasma mogelijk te maken. </li><li> Verwijder en wis de supernatant (plasma) met behulp van een pipet. Zet de buffy coat (leukocyten) en erythrocyten (rode bloedcellaag) zorgvuldig over in nieuwe en afzonderlijke buizen met behulp van pipetten. </li></ol></li><li> ICG (1,5%) etikettering van erythrocyten <ol><li> Was de erytrocyten met 1x PBS om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Resuspendeer de erytrocyten in 1x PBS (1: 1) om 50% hematocrit te maken. Aliquot 0,5 ml 50% hematocrit (~ 250 μL verpakte erythrocyten) in microcentrifugebuizen. Centrifugeer de erytrocyten (750 xg, 5 min) en gooi de supernatant weg. </li><li> Voeg 200 μl 40% 1x PBS toe aan de gepelleteerde erythrocyten, meng goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 100 μL ICG (1,5 mg / ml) toe aan de erytrocyt suspensie, meng zachtjes door de buis om te keren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 300 μl 1x PBS toe en incubeer bij37 ° C in een shaker incubator gedurende 60 minuten. </li><li> Centrifugeer de drager erythrocyten (750 xg, 3 min) en resuspendeer in 1 ml 1x PBS. </li><li> Was de cellen ~ 3 - 5 keer met 1x PBS totdat de supernatant helder is (stap 1.3.3). Na de laatste was decomponeer de supernatant en voeg 1% BSA PBS (1: 1) toe aan de geëtiketteerde voorgeswelte erythrocyten om een ​​50% hematocrit (1,25 x 10 8 cellen / ml) ICG geëtiketteerde erythrocyten te verkrijgen. </li></ol></li><li> Natrium fluoresceïne (1%) etikettering van leukocyten <ol><li> Nadat u de buffy coat van het bloed heeft afgescheiden met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie (vanaf stap 1.2.6), wassen de cellen eenmaal met 10 mL 1x PBS door centrifugeren bij 450 xg gedurende 10 minuten om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Resulteer de pellet in 900 μl 1x PBS. </li><li> Voeg 100 μl 10% natrium fluoresceïne toe aan 900 μl van de leukocytsuspensie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Was de gelabelde cellen driemaal met 10 ml 1X PBS door centrifugiNg (450 x g, 10 min). Resuspendeer de cellen in 100 μl 1x PBS. </li></ol></li></ol> 2. Live Imaging van Fluorescently Labelled Cells <ol><li> Live-imaging van ICG genaamd erythrocyten <ol><li> Om cellen voor injectie via staartvene of retro-orbitale route voor te bereiden, verdunnen de 50% hematocrit van ICG geëtiketteerde erythrocyten 10 keer en 50 keer met 1x PBS om respectievelijk 5% en 1% hematocritcellen te maken. </li><li> Plaats de muis onder het infraroodlicht (250W intensiteit) gedurende 5 minuten om de staartvene te vergroten. Verdoof de muis met ketaminehydrochloride (50 mg / kg) en xylazinehydrochloride (0,5 mg / kg) via intraperitoneale injectie (hier volgens schema 1, onder ARVO richtlijnen). </li><li> Dilate elke pupil van de ogen met een daling van 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrine hydrochloride. </li><li> Plaats de contactlens op één oog voor beeldvorming. Gebruik oftalmische gel als een medium voor beeldvorming en om droog te voorkomenS van de hoornvlies. Fixeer de camera van de confocal laser scanning ofthalmoscopie (SLO) met een 25-diopterlens om de breking van het muisoog te compenseren. </li><li> Plaats de muis op het SLO beeldplatform. Zorg ervoor dat de hoornvlies van de muis recht naar de optische hoofd van de SLO-machine staat. </li><li> Schakel de beeldmodule in. Gebruik de bijbehorende beeldmodemsoftware, klik op de knop &quot;Nieuwe patiënt&quot; en voeg de identificatiegegevens van dieren toe, zoals het muisoormerknummer, de geboortedatum, het percentage fluorescerende kleurstof en het gemarkeerde celtype. <ol><li> Plaats de optische zenuw van het dier in het midden van het beeldscherm door de beeldmodule te manoeuvreren. Gebruik de bijbehorende beeldmateriaal software, klik op de knop &#39;Acquire&#39; om de infrarood (IR) fundus beelden te maken met de 30 ° of 15 ° hoekweergave instelling. Zorg ervoor dat het midden van het netvlies, de leerling en het optische pad van de laser op elkaar afgestemd zijn om een ​​beste kwaliteitbeeld te verkrijgen. <br/&gt; OPMERKING: Het optische pad wordt uitgelijnd door de joystick te manoeuvreren om het scherpste beeld en de beste lichtbelichting te verkrijgen. </li></ol></li><li> Neem de ICG fundus video. <ol><li> Zet het ICG-filter (790 nm) aan, zet de camera in de hoge snelheidsmodus met de 30 ° of 15 ° -hoekweergave en stel de ICG-intensiteit op 85 voor alle aflezingen voor standaardisatie. Op het bedieningspaneel klikt u op de knop &#39;Acquire&#39; om de video (basislijnregeling) gedurende 8 minuten bij 8,8 / 15 frames / s te maken. </li></ol></li><li> Laad 100 μL ICG geëtiketteerde erythrocyten in een insulinspuit bevestigd aan een 30 gauge naald. <ol><li> Voor de injectie via de staartaderweg, steek de naaldschuin in de staartader. Bevestig de intraveneuze toegang door de terugstroom van het bloed in de spuit te controleren en de gemerkte cellen in de circulatie te injecteren. </li><li> Voor de injectie via de retro-orbitale route, steek de naald naast het oog in de retro-orbitale ruimtee. Bevestig de retro-orbitale toegang door de terugstroom van het bloed in de spuit te controleren en de gemerkte cellen in de circulatie te injecteren. </li></ol></li><li> Plaats na de injectie de muis en gebruik de IR fundus beelden (zie stap 2.1.6.1) en video met behulp van het ICG filter (zie stap 2.1.7.1). De gelabelde cellen in de retinale circulatie kunnen onmiddellijk na de injectie van de cellen worden weergegeven. </li><li> Nadat u de videoramen hebt verworven, verwijdert u .tiff-afbeeldingen van de video-sequenties door het .tiff-formaat te kiezen bij het exporteren van de video met behulp van de SLO-weergavemodussoftware. Sla de bestanden op in een gewenste map. </li><li> Verwijder de contactlens, plaats het over het andere oog en voltooi de afbeeldingen zoals beschreven in stappen 2.1.4 - 2.1.7. </li><li> Plaats na het imago het verdovende dier onder het infraroodlicht (250W) om de lichaamstemperatuur te behouden tot het terugkeert van verdoving. Wanneer het dier volledig is hersteld, plaats de muis terug in de houderkooi.</li></ol></li><li> Live-imaging van 1% natrium fluoresceïne gelabelde leukocyten <ol><li> Bereid de muis op en stel het instrument op zoals beschreven in paragraaf 2.1. </li><li> Plaats de muis en gebruik de IR fundus beelden zoals beschreven in stappen 2.1.4 - 2.1.6. <ol><li> Verkrijg het fluoresceine-angiogram van de muis met behulp van het fluoresceïnefilter (488 nm) met de hoge-snelheidscamera-modus met de 30 ° of 15 ° -hoekweergave en fluoresceinintensiteit bij 85 voor alle aflezingen voor standaardisatie. Opnemen van de video (basisregeling) op 8,8 / 15 frames / s (zie stap 2.1.7.1). OPMERKING: hier zijn meerdere tracks van video&#39;s (1 min video&#39;s) bij verschillende tijdsintervallen aangeschaft. </li></ol></li><li> Spuit 100 μL gemerkte leukocyten in de muis door de staartvene of retro-orbitale injectie zoals beschreven in paragraaf 2.1.8. </li><li> Plaats de muis direct na de injectie en gebruik de IR fundus beelden (zie stap 2.1.5 en 2.1.6) en de fluoRescein angiogram van de muis (zie paragraaf 2.2.2). </li><li> Let op de gelabelde cellen in de retina of choroidale bloedvaten door het brandpuntspunt van de aftastlaser aan te passen door de focusknop op de beeldmodule te draaien. </li><li> Verkrijg de videolijsten en afbeeldingen met behulp van de SLO-kijkmodulesoftware (zie stap 2.1.10) en sla het op in een gewenste map. </li><li> Volg de procedure, volg stap 2.1.12 voor de verzorging van dieren. </li></ol></li><li> Beeldanalyse door MtrackJ software <ol><li> Open de beeldsequentie in ImageJ door op &quot;File&quot; te klikken. Selecteer &#39;Import&#39; en kies &#39;Beeldvolgorde&#39;, selecteer de gewenste afbeeldingsmap en klik op &#39;Openen&#39;. Op het scherm verschijnt een pop-up venster genaamd &quot;Sequence Options&quot;. Klik op &quot;Ok&quot;; De beeldsequentie wordt geopend. </li><li> Stel het frame interval van de beeldvideo in door op &quot;Afbeelding&quot; te klikken en selecteer &quot;Eigenschappen&quot; voor snelheidsmetingen. Hier is het 8,8 frames / s. </li><li> Open de MTrackJ plugin door &quot;Plugins&quot; te selecteren. Selecteer &quot;Tracking&quot; en selecteer dan &quot;MtrackJ&quot;. Er moet een menu verschijnen. </li><li> Als u de tracking-instellingen wilt aanpassen, selecteert u &#39;Tracking&#39; (onder menu) en selecteert u het vak &#39;Verplaats naar de volgende tijdlijstindex na het toevoegen van punt&#39;. </li><li> Volg de eerste cel. <ol><li> Zoek een cel en volg dezelfde cel in de volgende frames. Klik op het menu op &#39;Toevoegen&#39; om een ​​nieuw nummer toe te voegen. </li><li> Schuif de cursor over de afbeelding (+ teken) en klik op de betreffende cel. OPMERKING: MTrackJ zal automatisch naar het volgende tijdstip springen en een kleine cirkel toevoegen, waarbij de positie van het eerste punt in het traject wordt gemarkeerd. </li><li> Blijf doorgaan met klikken op de huidige positie van de cel terwijl u door de frames van de beeldvolgorde beweegt. OPMERKING: soms worden de cirkels die de vorige punten in het traject markeren, de mogelijkheid om de huidige locatie te bekijken, beïnvloed. Als dit gebeurt,Ga verder naar stap 2.3.5.3.1. <ol><li> Wijzig de weergaveoptie voor het traject door op &quot;Weergeven&quot; in het menu te klikken en selecteer de optie &quot;alleen trackpunten weergeven op de huidige tijd&quot;. Om alle trajecten te zien, deselecteer deze optie. </li></ol></li><li> Blijf doorgaan tot het traject van de eerste cel wordt gezien. Sla dan het spoor op door op &quot;Opslaan&quot; te klikken. </li></ol></li><li> Volg de tweede cel. <ol><li> Klik in het menu op &#39;Toevoegen&#39; om een ​​nieuw nummer te starten. Herhaal stappen 2.3.5.1 - 2.3.5.4 voor het bijhouden van de nieuwe cel. Klik op &quot;Save&quot; om het tweede spoor op te slaan. </li><li> Ga door met deze stappen voor alle waarneembare cellen waargenomen. Nadat u de cellen hebt gevolgd, klikt u op &quot;Meet&quot; en &quot;OK&quot; in het menu tab om de resultaten te krijgen. OPMERKING: een resultaatvenster wordt automatisch geopend, die kan worden opgeslagen en geopend in een spreadsheet voor verdere analyse. </li></ol></li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. Geen financieel of belangenconflict.

Het bestuderen van de hemodynamica in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathofysiologie van veel oogziekten. De bloedstroomdynamiek in de retinale circulatie kan worden bestudeerd door Fourier-domeine optische coherentie-tomografie (FD-OCT), laserspotflowgrafie (LSFG) en retinale oximetrie. Hoewel deze methoden verschillende benaderingen gebruiken om de totale bloedstroom in de retinale circulatie 40 , 41 , <...

Het bestuderen van de stromingsdynamiek van de bloedcellen in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van potentieel visiebedreigende oogziekten en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. De conventionele angiografietechnieken, die de binding van fluorescerende kleurstoffen aan plasma-eiwitten omvatten, verschaffen echter geen informatie over de dynamiek van de erythrocyten of leukocyten 1 . De erytrocytische retinale stromingsdynamiek is belangrijk voor het bestuderen van metabolisch efficiënte circulatie in het retina, en de leukocytestroomdynamiek, om de celmigratie, herkenning, adhesie en vernietiging in verschillende ontstekingsomstandigheden te begrijpen 2 . Er zijn verschillende fluorescerende moleculen gebruikt bij de identificatie en karakterisering van verschillende celtypen 3 . De hemodynamica van de bloedcellen kan worden gemeten door ze te kleuren met de juiste fluorenCent kleurstoffen en het toepassen van de juiste beeldvormingstechnieken 4 . De aanwezigheid van ontstekingsreacties bij intraoculaire ziekten zoals leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en diabetische retinopathie (DR) behelst de accumulatie van lymfocyten in het zieke gebied 5 , 6 . Het bijhouden van de immuuncellen in de weefsels kan helpen bij het begrijpen van de complexe gebeurtenissen die betrokken zijn bij het mechanisme van ziektepatogenese. Radioactieve isotopen zoals 51 Cr en 125 I werden in vroege studies gebruikt als cellracers. Deze kleurstoffen zijn giftig en beïnvloeden de levensvatbaarheid van de cellen. Hoewel de radioactieve markers 3 H en 14 C minder giftig zijn voor de cellen, is het moeilijk om hun signalen in het systeem 7 , 8 te detecteren door hun lagere emissie-energieën. Er werden een aantal fluorochroom-kleurstoffen ingevoerd om de mogelijke problemen die verband houden met w te overwinnenMet radioactieve markers en tracklymfocytemigratie in vitro met behulp van fluorescerende microscopie en flowcytometrie 9 , 10 . Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn DNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, die worden gebruikt om lymfocyten in vivo te volgen. Hoechst 33342 bindt aan AT-rijke gebieden in het DNA, is membraan doorlaatbaar, houdt fluorescentiesignalen gedurende 2 - 4 dagen en is bestand tegen slokkend 9 , 10 . De nadelen van Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn de remming van lymfocyt proliferatie 11 en de korte halveringstijd respectievelijk 9 . Calcein-AM, fluoresceendiacetaat (FDA), 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluoresceïne, acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (en-6) Carboxyfluoresceendiacetaat (CFDA) en 5- (en-6) -carboxyfluoresceendiacetaatacetoxymethylester (CFDA-AM)Zijn de cytoplasmatische fluorescerende kleurstoffen gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FDA, CFDA en CFDA-AM hebben echter lagere retentie in de cellen 9 . BCECF-AM vermindert de proliferatieve respons en beïnvloedt de chemotaxis en superoxideproductie 9 , 12 . Calcein-AM is een fluorescerende kleurstof en bruikbaar voor korte termijn in vivo lymfocytemigratie studies. Het emitert sterke fluorescerende signalen, verstoort de meeste cellulaire functies niet en houdt fluorescente signalen gedurende maximaal 3 dagen 12 , 13 . Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en carboxyfluoresceendiacetaatsuccinimidylester (CFDA-SE) zijn covalente koppeling fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FITC vertoont geen effect op de cellevendigheid en heeft een sterkere affiniteit met B-lymfocyten dan T-lymfocyten 14 , 15 </sup&gt;. De CFDA-SE gelabelde lymfocyten kunnen meer dan 8 weken en tot 8 celafdelingen 9 , 16 in vivo worden gevolgd. C18 DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanineperchloraat), DiO (3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 en PKH26 zijn membraan- Het inbrengen van fluorescerende lipofiele carbocyanine kleurstoffen die gebruikt worden om leukocyten en erythrocyten te labelen. C18 Dil en DiO tonen hogere signalen wanneer ze in het celmembraan worden opgenomen en zijn relatief niet giftig 12 , 17 . PKH2-, PKH3- en PKH26-gemerkte cellen tonen een goede retentie van de fluorescerende signalen met minder toxiciteit 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Echter, PKH2 regelt de CD62L expressie en vermindert de ly<html> Mphocyt levensvatbaarheid 23 . De meeste bovengenoemde studies zijn uitgevoerd voor het bijhouden van de lymfocytemigratie en proliferatie in de lymfatica en het bestuderen van de geëtiketteerde erythrocyten in de niet-oculaire circulatie. Er zijn zeer weinig studies die de etiketteringstechnieken toepassen om de bloedcellen in de oculaire circulatie te bestuderen. Toepassing van scan-laser-oftalmoprofie (SLO) heeft een groot voordeel bij het bestuderen van de gelabelde cellen in de retinale en choroidale circulatie in vivo door fundus angiography 24 . Er zijn verschillende fluorescerende kleurstoffen, zoals ICG, acridine oranje, FITC, natriumfluoresceïne en CFDA die gebruikt worden om de leukocyten in de retinale circulatie door SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = &quot;xref&quot;&gt; 31 , 32 , 33 , 34 . De fototoxiciteit en carcinogeniciteit van acridine oranje 26 , 27 , de interferentie van FITC met de cellulaire activiteit en de eis van een intravascular contrastmiddel voor de oplossing van de retinale en choroidale bloedvaten beperkt hun toepassing in in vivo dierproeven 29 . Natriumfluoresceïne en ICG zijn niet-toxisch, goedgekeurd door de Food and Drug Administration, en veilig voor het testen op mensen 32 , 35 . De meeste dynamische studies zijn gerelateerd aan de etikettering van de leukocyten of erythrocyten en zijn visualisatie in de retinale en choroidale bloedvaten 36 , 37 , 38 , 39 </sup&gt;. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol van ICG-etikettering van de erythrocyten, natriumfluoresceïne-etikettering van de leukocyten, en het bijhouden van de gevisualiseerde gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis met behulp van SLO.

<table><tbody><tr><td>Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12633-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 100 mg/mL</td><td>Novartis</td><td>U1705A/H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood</td><td>BD, USA</td><td>REF 365974</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Insta BioAnalytik pte. ltd</td><td>FINE VORTEX</td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml)</td><td>Troy Laboratories PTY. Limited</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)</td><td>Alcon&nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&nbsp;0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)</td><td>Alcon&nbsp;Laboratories, Inc. USA</td><td>NDC&nbsp;0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin</td><td>Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic Gel 10 G</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>Assure medical disposables</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>ZEISS</td><td>Model: axio imager z1</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent dye etikettering van erythrocyten en leukocyten voor het bestuderen van de flow dynamics in de retinale circulatie van de muis

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

De retinale en choroidale bloedstroomdynamiek kan inzicht verschaffen in de pathofysiologie en vervolg van diverse oogziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie, leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. Het kan ook helpen om de therapeutische reacties in het oog te volgen. De juiste etikettering van de bloedcellen, in combinatie met live-celbeelden van de gelabelde cellen, maakt het mogelijk om de stromingsdynamiek in de retinale en choroidale circulatie te onderzoeken. Hier beschrijven we de gestandaardiseerde protocollen van respectievelijk 1,5% indocyaninegroen (ICG) en 1% natriumfluoresceïne-etikettering van muizen erythrocyten en leukocyten. Scanning laser-oftalmocopie (SLO) werd toegepast om de gelabelde cellen te visualiseren in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wildtype). Beide methoden demonstreerden onderscheiden fluorescent gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis. Deze etiketteringsmethoden kunnen bredere toepassingen hebben in verschillende oogziektenmodellen.

Erythrocyten gemarkeerd met 1,5% ICG werden gevisualiseerd in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wild type). Beide 1% en 5% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten waren onderscheiden in de retinale circulatie. De afzonderlijke gemerkte cellen werden echter duidelijker met 1% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten ( Figuur 1 ). In 5% hematocrit, door het grote aantal gelabelde cellen in de retinale vaten, was het niet mogelijk om ...

Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van de retinale circulatie van bloedcellen bij de muis met behulp van een scanning laser ophthalmoscoop. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over retinale aandoeningen, zoals wat de retinale vloerdynamiek van WBCs en RBCs is en hoe hun stroomdynamiek kan bijdragen aan de pathogenese van de ziekte. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze verschillende ziektefenotypen kan weerspiegelen en dat de uitvoering zeer eenvoudig is.Deze procedure wordt gedemonstreerd door onze teamleden, Praveen, Bo Bo en Neha. Om de laag muizenbloedcellen te isoleren, wordt vers verzameld volbloed bovenop een 1:1 polysucrose- en natriumdiatrizoate-oplossing in een buisje van twee milliliter geplaatst. Centrifugeer de buis vervolgens gedurende 30 minuten.Aspireer vervolgens het plasmasupernatant en gooi dit weg. Verzamel daarna voorzichtig de buffy coat-laag, bestaande uit leukocyten, en de onderliggende laag erytrocyten in afzonderlijke buisjes. Was de erytrocyten vervolgens met 1XPBS om eventuele verontreinigingen te verwijderen en resuspendeer ze in één volume PBS.Breng vervolgens aliquots van een halve milliliter van de suspensie over in microcentrifugebuisjes. Centrifugeer de aliquots, verwijder het supernatant en voeg ongeveer 200 microliter 40% 1XPBS toe aan de gepelletteerde erytrocyten. Meng deze goed.En incubeer ze vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na vijf minuten 100 µL ICG toe aan elke suspensie. Meng de buisjes door ze om te keren en incubeer ze vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 300 µL 1XPBS toe en incubeer gedurende een uur met zachte agitatie bij 37 °C. Centrifugeer daarna de suspensies, behoud de gepelletteerde cellen en resuspendeer deze in 1 mL 1XPBS. Blijf de cellen wassen met 1XPBS totdat het supernatant helder is.Voeg na het afschenken van het supernatant één volume 1% BSA en PBS toe om een hematocriet van 50% van ICG-gelabelde erytrocyten te bereiken. Verwerk vervolgens de verzamelde buffy coat. Was de cellen eerst eenmaal met 10 milliliters 1XPBS om eventuele verontreinigingen te verwijderen.Centrifugeer de monsters opnieuw en resuspendeer de pellet vervolgens in 900 µL 1XPBS. Voeg daarna 100 µL 10% natriumfluoresceïne toe en incubeer de cellen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Was ten slotte de gelabelde lymfocyten drie keer met 10 mL 1XPBS.Centrifugeer deze en resuspendeer ze in 100 µL 1XPBS. Om de met ICG gelabelde erytrocyten voor injectie voor te bereiden, wordt eerst een aliquot voor injectie verdund tot een hematocriet van 5% of 1%. Anestheseer de muis en dilateer de pupillen.Breng vervolgens oogzalf aan in beide ogen. Plaats daarna een contactlens over één van de ogen. Maak nu beelden van de muis met een confocale SLO-camera en een positieve lens van 25 dioptrie om de refractie van het oog te compenseren.Richt het hoornvlies nauwkeurig op de optische kop van de SLO-machine. Schakel vervolgens de beeldvormingsmodule in en manoeuvreer deze totdat de oogzenuw zich in het midden van het beeldscherm bevindt. Neem daarna onder een hoek van 30 graden de infrarode fundusbeelden.Maak vervolgens een infrarood fundusvideo. Schakel de 790 nanometer ICG-filter in, stel de cameramodus in op hoge snelheid en houd de kijkhoek op 15 tot 30 graden. Stel daarna de ICG-intensiteit in op 85 voor alle metingen.Klik op het bedieningspaneel op de knop 'acquire' om een baseline-video op te nemen met 8,8 tot 15 frames per seconde gedurende één minuut. Laad vervolgens 100 µL ICG-gelabelde erytrocyten in een insulinespuit met een naald van 30 gauge en injecteer de cellen in de staartvene of injecteer ze retro-orbitaal. Maak direct na de injectie een nieuwe infrarode fundusopname en een nieuwe ICG-filtervideo.Exporteer de video's na acquisitie in TIFF-formaat voor beeldanalyse. Verwerk de beelden met het gratis beschikbare imaging-softwarepakket MHJ. Stel na het openen van het bestand het frame-interval van de beeldvideo in voor snelheidsmetingen.Open vervolgens de MtrackJ-plugin. Selecteer in het menu 'tracking' en activeer de optie om naar de volgende timeframe-index te gaan na het toevoegen van een punt. Lokaliseer nu een cel van belang en volg deze door elk frame.Klik in het menu op 'toevoegen' om een nieuw spoor toe te voegen en klik vervolgens op de gekozen cel. Klik daarna herhaaldelijk op de huidige positie van de cel terwijl de beelden frame voor frame vorderen. Pas wanneer het spoor is vastgelegd, wijzigt u de weergaveoptie voor het traject in de weergavekeuzes en selecteert u de optie om alleen de spoorpunten op het huidige tijdstip weer te geven.Blijf klikken tot de baan van de cel wordt weergegeven en sla vervolgens het spoor op. Ga nu verder met het volgen van de volgende cel door te beginnen met het add-commando en op dezelfde wijze te werk te gaan als bij de eerste cel. Open na het volgen van alle cellen van belang de weergave van alle spoormetingen via de optie measure.Sla vervolgens de output op voor verdere analyse. Erytrocyten gelabeld met 1,5% ICG werden gevisualiseerd in de retinale circulatie van C57 black 6J muizen met behulp van 1% of 5% hematocriet; de cellen waren onderscheidbaar, maar bij 1% hematocriet waren de gelabelde cellen gemakkelijker te visualiseren. Bij beide geïnjecteerde concentraties was enige erythrostase waarneembaar in de parapapillaire regio, en dit was duidelijker zichtbaar bij 5% hematocriet.Leukocyten werden gelabeld met 1% natriumfluoresceïne en gevisualiseerd als groen gelabelde cellen middels fluorescentiemicroscopie. Er werd enige klontering waargenomen. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in zes uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt toegepast.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de pupillen te verwijden om kwalitatieve beelden en video's van het netvlies te verkrijgen.

fluorescent-dye-labeling-erythrocytes-leukocytes-for-studying-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.

Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Intravitale microscopie kan bij dieren worden gebruikt om retinale vaatdiameters, bloedstroomsnelheden en totale retinale bloedstroom te visualiseren en te meten.

Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.

Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Het retinale vaatstelsel van muizen is bijzonder interessant voor het begrijpen van de mechanismen van vasculaire patroonvorming. Dit protocol meet automatisch de diameter van de retinale vaten van muizen op basis van fluorescerende angiografie-fundusbeelden op een vaste afstand van de optische schijf.

Het meten van de diameter van het netvliesvat van fluorescerende angiografiebeelden van muizen

We demonstreren een methode om de wanden van het retinale vaatstelsel en aanhangende leukocyten te labelen. Deze aanhangende leukocyten kunnen vervolgens onder een fluorescentiemicroscoop worden geteld als een parameter van ontsteking of de reactie van die ontsteking op therapieën.

Kwantificering van door diabetes geïnduceerde adherente leukocyten in retinale vasculatuur

Leer fluorescente kleuring van erytrocyten en leukocyten voor het bestuderen van bloedceldynamiek in de retinale circulatie van de muis. Deze methode biedt inzicht in retinale ziekten.

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis (Video) | JoVE Journal

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

Meer video's verkennen