Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Het algemene doel van deze methode is om het G-quadruplex helicase G4 Resolvase1-eiwit te isoleren uit een bacterieel expressiesysteem met behulp van een unieke ATP-afhankelijke zuiveringsstap om bijna puur en katalytisch actief enzym te isoleren. Deze methode kan onderzoekers helpen bijna puur en katalytisch actief recombinant G4 Resolvase1-eiwit te verkrijgen voor gebruik in een breed scala van in vitro biochemische assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het verkeerd gevouwen of anderszins katalytisch inactieve enzym uit de eiwitvoorbereiding uitsluit.

Het idee om ATP te gebruiken om de G-quadruplex helicase te elueren, ontstond nadat het niet mogelijk was om het katalytisch actieve enzym van de G4-kralen te elueren, zelfs bij uitzonderlijk hoge zoutconcentraties. Bereid en groei grote bacteriecultuur die G-quadruplex Resolvase1 of G4R1 tot expressie brengt zoals beschreven in het tekstprotocol. Ontdooi de bacteriële pellet in drie milliliter TN-buffer bij kamertemperatuur.

Houd de flesschen in de hand en slinger om de bacteriële pellet te ontdooien en te resuspenderen. Zodra ontdooid en relatief gelijkmatig gesuspendeerd, breng het volume op tot vijf milliliter met TN-buffer. Los vervolgens 20 milligram lysozym op in 250 microliter water per cultuur en voeg toe aan de gesuspendeerde bacteriën.

Laat het lysozym de bacteriën gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten verteren terwijl u de flesschen in de hand slingert. De kleur van de suspensie zal iets lichter worden naarmate de vertering vordert, en de suspensie zal relatief niet-visceus zijn. Voeg 250 microliter proteaseremmercocktail afgekort PIC toe.

Voeg vervolgens een 10 microliter aliquot leupeptine toe en meng grondig. Plaats de suspensie op ijs en voeg 10 milliliter koud TN-buffer en 22 microliter beta mercaptoethanol of BME toe. Breng de suspensie over in een 50 milliliter buis.

Sonificeer de bacteriën op ijs met een digitale sonicator ingesteld op 30% amplitude. Pulseer gedurende twee seconden aan en twee seconden uit gedurende één minuut. Herhaal de sonicatie drie keer, waarbij de monsters tussen de sonicatiestapjes minimaal twee minuten op ijs worden afgekoeld.

Voeg vervolgens een gelijk volume koud vier X saline sodium citrate of SSC plus BME, PIC en leupeptine toe en meng de suspensie. In een op tafel liggende centrifuge voorgekoeld tot vier graden Celsius centrifugeert u de lysaten bij 2.300 keer G gedurende 20 minuten. Breng vervolgens het supernatant over in verse voorgekoelde 50 milliliter buizen.

Neem één milliliter streptavidin paramagnetische kralen of SPB-suspensie per cultuur en breng het over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Pelet de SPB met een magneet. Was vervolgens de SPB twee keer met twee X SSC plus vijf millimolair EDTA PH8.

Suspenseer vervolgens de gewassen SPB in 200 microliter van dezelfde oplossing. Voeg één drie OD aliquot G4-DNA toe aan de SPB-suspensie. Meng snel door meerdere keren op en neer te pipetten.

Plaats vervolgens de buizen op een roterende tafel en roteren gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Na deze rotatieperiode, blokkeer de G4-gebonden SPB door één milliliter 0,4% lactalbumine toe te voegen, en bewaar het op ijs tot het nodig is. Om histidine-gelabeld recombinant G4R1 aan kobaltkralen te binden, voegt u één milliliter kobaltkralenslurry toe aan elke 50 milliliter buis die het opgehelderde bacteriële lysate bevat.

Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een roterende tafel. Na incubatie centrifugeert u kobaltkralen bij 110 keer G gedurende vijf minuten in een op tafel liggende centrifuge van vier graden Celsius. Aspirateer de vloeistof voorzichtig en laat een paar milliliter vloeistof over zodat de gepelletiseerde kobaltkralen niet worden verstoord.

Was vervolgens de kralen met 10 tot 15 milliliter koud vier X SSC plus BME en pellet de kralen zoals voorheen. Giet het volgende opgehelderde lysate op de gepelletiseerde kobaltkralen. Incubeer gedurende nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur op de roterende tafel en was de kralen met 10 tot 15 milliliter vier X SSC plus BME.

Pellet vervolgens de kralen gedurende 100 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na een tweede wasbeurt aspireert u de vloeistof en laat ongeveer twee milliliter kralen en vloeistof achter in de bodem van de buis. Breng de proteïnegebonden kobaltkralen over naar een voorgekoelde twee milliliter buis door een een milliliter wide bore pipettetip te gebruiken.

Centrifugeer de kralen kort in de twee milliliter buis op hoge snelheid in een microcentrifuge bij vier graden Celsius. Verwijder en gooi voorzichtig het supernatant door te pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat de proteïnegebonden kobaltkralen niet verloren gaan. Pipetteer 0,5 milliliter histidine elutiebuffer of HEB op de kralen en resuspendeer ze door de buis om te draaien.

Incubeer vervolgens de kobaltkralen in HEB gedurende vijf minuten op een roterende tafel in een koude ruimte. Centrifugeert vervolgens de suspensie gedurende 18.000 keer G gedurende één minuut in een microcentrifuge van vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het proteïnebevattende supernatant door te pipetteren en laat een kleine hoeveelheid vloeistof achter op de kobaltkralen.

Breng het supernatant over naar een voorgekoelde 15 milliliter buis. Herhaal deze stappen voor een totaal van drie HEB-eluties. Elueer vervolgens één keer met 0,2 molair EDTA bij PH 6,0.

De kleur van de kobaltkralen zal veranderen van roze naar wit naarmate het EDTA het kobalt cheleert. Nadat deze vierde en laatste elutie is overgebracht naar de 15 milliliter buis, pipetteer de resterende elutiebuffer van de kobaltkralen door een gel-loadingtip te gebruiken aan het einde van een een milliliter pipettetip. Door de tip tot de bodem van de buis te duwen, kan resterende proteïnebevattende elutiebuffer worden verzam