Name: Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Leer een ATP-afhankelijke zuiveringsmethode voor G4 Resolvase1 uit bacteriële systemen. Deze techniek levert bijna zuiver, katalytisch actief enzym op voor biochemische assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken onze financieringsbronnen, met inbegrip van een gulle gift van de Ware Foundation (naar JPV), The National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (naar PJS), en Ball State University opstarten fondsen (tot PJS). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol is een zeer efficiënte expressie, zuivering en kwantificering regeling voor de isolatie van het DHX36 genproduct, G4-Resolvase1 (G4R1, ook wel Rhau en DHX36) (figuur 1). Dit protocol maakt gebruik van twee zuivering stappen: His-tag affiniteit zuivering op kobalt affiniteit kralen en enzymatische zuivering op G4-DNA-geconjugeerde kralen. De laatste stap is uniek omdat het profiteert van de strakke affiniteit, hoge specificiteit en afwikkelen katalytische activiteit die rG4R1 heeft voor G4 s...

G4 structuren zijn zeer stabiel nucleïnezuur secondaire structuren die zich vormen binnen guanine-rijke gebieden van DNA en RNA. G4 structuren worden gestabiliseerd via Hoogsteen-waterstofbruggen en coördineren binding binnen de centrale holte met eenwaardige kationen (bijv. K + en Na +) die aanzienlijk bijdragen aan de opmerkelijke thermische stabiliteit van G4 structuren 1, 2. Vroege bioinformatica studies suggereerden dat het menselijk genoom bevat&gt; 375.000 &quot;potentieel-G4 vormende motieven&quot; 3, 4. Meer recent onderzoek blijkt dat het aantal motieven G4 hoger met een factor van 02-05 mei, terwijl een andere studie voorspelt 716.310 verschillende potentiaal G4 vormende sequenties in het humane genoom 6. G4-vormende sequenties zijn evolutionair geconserveerd en niet willekeurig verspreid inhet genoom. G4 motieven zijn verrijkt in genen coderende gebieden en ruim 40% van gen promoters bevatten G4 motieven 7. Interessant is dat de verrijking van G4 motieven in een gen aangetoond dat het de functie van het gen suggereren. Bijvoorbeeld, proto-oncogenen en genen betrokken bij ontwikkeling aanzienlijk grotere verrijking van G4 structuren dan tumorsuppressorgenen 8, 9. Met een hoge thermische stabiliteiten, een bijna alomtegenwoordige aanwezigheid in het genoom, en het potentieel aanzienlijk beïnvloeden belangrijke cellulaire processen, is verrassend te vinden dat de cel enzymen geëvolueerd om deze structuren te beheren. Een dergelijke enzym G4 Resolvase1 (G4R1, ook wel Rhau en DHX36), die we gekarakteriseerd als de bron van de meeste tetramolecular G4-DNA oplossen activiteit in menselijke (HeLa) cellen 10. Sindsdien is aangetoond that G4R1 stevig bindt en katalytisch wikkelt tetramolecular en unimoleculaire DNA-G4 en G4-RNA met de kleinste gemelde KD voor een G4-bindend eiwit 11, 12, 13. Daarnaast heeft de G4 oplossen activiteit van G4R1 betrokken bij een groot aantal biochemische en cellulaire processen, waaronder telomere / telomerase biologie 11, 14, 15, 16, transcriptie en lassen 17, 18, 19, 20, ontwikkeling 21, hematopoiese 21, en het immuunsysteem regelgeving 22, 23. Met een overwicht van G4 sequenties specifiek gelegen in het hele genoom en de diverse cellulaire processes dat G4R1 onlangs geïmpliceerd betrokken zijn bij het vermogen om expressie en efficiënt zuiveren zeer actieve rG4R1 daarbij van het grootste belang zijn voor het ophelderen van de biochemische mechanismen en het gedrag van dit eiwit. Hier tonen we een nieuwe expressiesystemen en zuiveringsschema (figuur 1) die gebruik maakt van de ATP-afhankelijke, G4 oplossen activiteit van rG4R1 actieve enzym efficiënt isoleren. Deze regeling kan worden aangepast aan andere ATP-afhankelijke enzymen nucleïnezuur waarvoor het product van de enzymatische reactie is niet langer een substraat voor binding te zuiveren, zoals het geval is voor G4R1.

<table><tbody><tr><td>TriEx4-DHX36 plasmid</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS competent cells</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &micro;g/mL in bacteriële platen/grote culturen</td></tr><tr><td>Carbenicillin (getest voor plantencelcultuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &micro;g/mL in bacteriële platen/grote culturen</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme (uit kippeneiwit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>of uit standaardbron</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>of uit standaardbron</td></tr><tr><td>1.5 M Tris-HCl, pH 8.8</td><td></td><td></td><td>Voor het gieten van het resolutie-gel (voor eiwitkwantificeringsgel); Uit standaardbron</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.8</td><td></td><td></td><td>Voor het gieten van het stacking-gel (voor eiwitkwantificeringsgel); Uit standaardbron</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetaat, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>of uit standaardbron</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Uit standaardbron</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (1&nbsp;M oplossing)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>of uit standaardbron</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine hemisulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine paramagnetische kralen</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>0718</td><td>of uit standaardbron</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>Uit standaardbron; pas pH aanvankelijk aan met NaOH, pas vervolgens de pH terug naar beneden met HCl.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>A-lactalbumine (Type 1 uit rundermelk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Kobaltmetaal affiniteitkralen</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Ijsazijnzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-Trifosfaat (uit bacteriële bron)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide/Bis oplossing (37,5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>om eiwitgel-loopbuffer te maken (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>10% Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1667</td><td>om eiwitgel-loopbuffer te maken (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); of uit standaardbron</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>of uit standaardbron</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>om eiwitgel-loopbuffer te maken (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); Uit standaardbron</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range Protein MW markers</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Gebiotineerde Z33 oligo ("Z33-Bio")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&rsquo; AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotine 3&rsquo;</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5&rsquo; TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3&rsquo;</td></tr><tr><td>Fluor-gecoate TLC-plaat</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% in H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Multiband UV-lamp</td><td></td><td></td><td>In staat om UV-licht uit te zenden bij 365 nm</td></tr><tr><td>Centrifuge voor op tafel (met roterende emmerrotor)</td><td></td><td></td><td>In staat om afgekoeld te worden tot 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>In staat om afgekoeld te worden tot 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>Of equivalent dat in staat is om sonificatiepulsen te leveren (30% amplitude, 2 s AANWEZIG/2 s UIT)</td></tr><tr><td>50 &deg;C waterbad</td><td></td><td></td><td>Voor de vorming van Z33 in quadruplex</td></tr><tr><td>37 &deg;C incubator voor bacteriën</td><td></td><td></td><td>Voor bacteriële transformaties en initiële overnachtelijke groei van grote culturen van Rosetta2 E. coli getransformeerd met TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg;C/14&nbsp;&deg;C schuddende incubator voor bacteriën</td><td></td><td></td><td>Voor groei en eiwitinductie van grote culturen van Rosetta2 E. coli getransformeerd met TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td></td><td></td><td>in staat om OD600 te lezen; in staat om oligomeerconcentraties te lezen op basis van basesequentie (zoals Biorad SmartSpec 3000)</td></tr>

een g-quadruplex dna-affiniteit aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve g4 resolvase1

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Hogere orde nucleinezuurstructuren genaamd G-quadruplexen (G4, G4 structuren) kunnen vormen in guanine-rijke gebieden van zowel DNA als RNA en zeer thermisch stabiel. Er zijn&gt; 375.000 vermoedelijke G4 vormende sequenties in het humane genoom, en ze zijn verrijkt in promotergebieden, ongetranslateerde gebieden (UTR) en in de telomere repeat. Vanwege de mogelijkheid van deze structuren om cellulaire processen zoals replicatie en transcriptie beïnvloeden, de cel geëvolueerd enzymen te beheren. Een dergelijke enzym G4 resolvase 1 (G4R1), die biochemisch werd mede gekenmerkt door laboratoriumwaarden Nagamine et al. en bleek zeer stevig aan beide G4-DNA en G4-RNA (K d in de low-pM range) te binden. G4R1 is de bron van de meeste G4 oplossen activiteit in HeLa cellysaten en is sindsdien geïmpliceerd een rol telomeren metabolisme, lymfe ontwikkeling, gentranscriptie, hematopoiese en immune surveillance spelen. De mogelijkheid om efdoende te uiten en te zuiveren katalytisch actieve G4R1 van belang is voor laboratoria geïnteresseerd zijn in het verkrijgen van meer inzicht in de kinetische interactie van G4 structuren en G4 oplossen van enzymen. We beschrijven hier een gedetailleerde werkwijze voor de zuivering van recombinant G4R1 (rG4R1). De beschreven werkwijze omvat de traditionele affiniteit gebaseerde zuivering van een C-eindstandige histidine-gemerkte enzym tot expressie gebracht in humane codon-geoptimaliseerd bacteriën het gebruik van het vermogen van rG4R1 te binden en te ontspannen G4-DNA zeer actieve enzym te zuiveren per ATP afhankelijke elutiestap. Het protocol een kwaliteitscontrole stap waarbij de enzymatische activiteit van rG4R1 wordt gemeten door het onderzoeken van het vermogen van het gezuiverde enzym DNA-G4 ontspannen. Een werkwijze wordt ook beschreven dat zorgt voor de kwantificering van gezuiverde rG4R1. Alternatieve aanpassingen van dit protocol worden besproken.

Dit protocol (figuur 1) routinematig levert bijna pure, katalytisch actieve rG4R1. Als maat voor de enzymatische activiteit wordt meestal waargenomen dat 50% van 0,2 pmol TAMRA-gemerkt tetramolecular G4-DNA in monomeren omgezet in het 0,2-0,013 ul reeks rG4R1, zoals bepaald door de G4 activiteitstest hierboven (figuur geschetste 2). Coomassiekleuring gezuiverd rG4R1 markeert een afzonderlijke band bij het verwachte 120 kDa groot, met een ondergeschikte verontreinigende ...

G4 Resolvase1 bindt aan G-quadruplex (G4) met de kleinste structuren gerapporteerde affiniteit voor een G4-bindend eiwit en vertegenwoordigt het merendeel van de G4-DNA afwikkelen activiteit in HeLa-cellen. We beschrijven een nieuw protocol dat de affiniteit en ATP-afhankelijke afwikkelen activiteit van de G4-Resolvase1 gordels om specifiek te zuiveren katalytisch actieve recombinant G4R1.

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Het algemene doel van deze methode is het isoleren van het G-quadruplex helicase G4 Resolvase1-eiwit uit een bacterieel expressiesysteem, met behulp van een unieke ATP-afhankelijke zuiveringsstap om een nagenoeg zuiver en katalytisch actief enzym te isoleren. Deze methode kan onderzoekers helpen om nagenoeg zuiver en katalytisch actief recombinant G4 Resolvase1-eiwit te verkrijgen voor gebruik in een breed scala aan in vitro biochemische assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat misvouwen of anderszins katalytisch inactief enzym uit de eiwitpreparatie wordt uitgesloten.Het idee om ATP te gebruiken voor de elutie van de G-quadruplex-helicase ontstond nadat het niet lukte om het katalytisch actieve enzym van de G4-beads te elueren, zelfs niet bij uitzonderlijk hoge zoutconcentraties. Bereid en kweek grote bacteriële culturen die G-quadruplex Resolvase1 of G4R1 tot expressie brengen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Ontdooi de bacteriële pellet in drie milliliter TN-buffer bij kamertemperatuur.Houd de flesjes in de hand en draai deze rond om het bacteriële pellet te ontdooien en te resuspenderen. Zodra het pellet is ontdooid en relatief gelijkmatig is gesuspend

a-g-quadruplex-dna-affinity-approach-for-purification-enzymatically

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Kristalstructuur van eiwit-DNA-complexen kan inzicht verschaffen in eiwitfunctie, mechanisme, evenals de aard van de specifieke interactie. Hier rapporteren we hoe de lengte en sequentie uiteinden van duplex DNA optimaliseren voor co-kristallisatie...

Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

We beschrijven gevoelige, gel-gebaseerde discontinue assays om de kinetiek van lagging-strandinitiatie te onderzoeken met behulp van de replicatie-eiwitten van bacteriofaag T7.

Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Door de bacteriofaag T7 Replication Eiwitten

Een single-molecuul magnetische pincet platform te manipuleren van de G-quadruplexes is gemeld, waardoor voor de studie van G4 stabiliteit en verordening door verschillende eiwitten.

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.

Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie

Bis-3-chloorpiperidines (B-CeP's) zijn nuttige chemische sondes om G-quadruplex-structuren in DNA-sjablonen in vitro te identificeren en te karakteriseren. Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van tastende reacties met B-CeP's en het oplossen van reactieproducten door middel van polyacrylamidegelelektroforese met hoge resolutie.

In vitro Chemisch in kaart brengen van G-quadruplex DNA-structuren door Bis-3-Chloropiperidines

Een belangrijke barrière voor technologieën zoals CRISPR zijn de off-target gebeurtenissen die vitale genen kunnen verstoren. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing' (CIRCLE-seq) is een techniek die is ontworpen om onbedoelde splitsingsplaatsen te identificeren. Deze methode brengt de genoombrede activiteit van CRISPR-Cas9 met hoge gevoeligheid en zonder bias in kaart.

CIRCLE-Seq voor ondervraging van off-target genbewerking

Dit protocol demonstreert het uitvoeren van een single-molecule assay voor live visualisatie van DNA-afwikkeling door CMG helicase. Het beschrijft (1) het prepareren van een DNA-substraat, (2) het zuiveren van fluorescerend gelabelde Drosophila melanogaster CMG-helicase, (3) het voorbereiden van een microfluïdische flowcel voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie, en (4) de single-molecule DNA-afwikkeltest.

Real-time visualisatie van DNA met één molecuul door CMG Helicase

Dit protocol schetst een op fluorescentiemicroscopie gebaseerde DNA-replicatietest met één molecuul, waardoor real-time visualisatie van interacties tussen DNA-polymerasen en obstakels zoals G-quadruplex-structuren mogelijk is.

Fluorescentievisualisatie met één molecuul van DNA-polymerasedynamiek bij G-quadruplexen

Een protocol voor de productie, zuivering en het gebruik van enzymverpakte buitenmembraanvesikels (OMV) dat zorgt voor verbeterde enzymstabiliteit voor implementatie in diverse toepassingen wordt gepresenteerd.

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

Hier presenteren we een methode om S100A12 (Calgranulin C) uit te drukken en te zuiveren. We beschrijven een protocol om zijn antimicrobiële activiteit tegen het menselijke pathogeen H. pylori te meten.

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Leer een ATP-afhankelijke zuiveringsmethode voor G4 Resolvase1 uit bacteriële systemen. Deze techniek levert bijna zuiver, katalytisch actief enzym op voor biochemische assays.

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Meer video's verkennen