Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins
22 mei 2017
Dit artikel beschrijft hoe de ion-selectiviteit van channelrhodopsine wordt bepaald met elektrofysiologische whole-cell patch-clamp opnames met behulp van HEK293 cellen. Hier wordt de experimentele procedure voor het onderzoeken van chloride-selectiviteit van een anion-selectieve channelrhodopsine gedemonstreerd. De procedure is echter overdraagbaar naar andere channelrhodopsinen met een verschillende selectiviteit.
Het algemene doel van dit experiment is om de chloride-selectiviteit van nieuwe licht-gestuurde ionkanalen te bepalen. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in de biofysica van channelrhodopsins, zoals fotocurrentamplitudes, kinetiek en ionselectiviteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de directe aflezing van biofysische kanaalactiviteit die snel en gemakkelijk te repliceren is.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden, omdat elke stap van de experimentele procedure, van de bereiding van HEK-cellen tot het opnemen van fotostromen, moet worden geoptimaliseerd. Het zaaien en doorsnijden van de HEK-cellen zal worden gedemonstreerd door Altina Klein. Om deze procedure te beginnen, weeg de vaste componenten voor 100 milliliter van de intracellulaire en 500 milliliter van de extracellulaire gebufferde oplossingen in afzonderlijke bekers.
Voeg vervolgens de respectieve hoeveelheid van de bereide stockoplossingen toe. Voeg vervolgens ultrapuur water toe en pas voorzichtig de pH aan met behulp van zuren en basen. Pas vervolgens de osmolariteit aan met glucose tot 290 milliosmolen en 320 milliosmolen voor de intracellulaire en extracellulaire oplossingen, respectievelijk.
Bij deze procedure plaatst u maximaal drie lysine-gecoate glazen deksels naast elkaar in een 35-millimeter petrischaal. Zaai vervolgens 1,5 keer 10 tot de vijfde HEK-cellen in twee milliliter standaard DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en één micromolar retinol in elke schaal. Om de cellen voor elke schaal te transfecteren, bereidt u een oplossing van twee microgram plasmide-DNA in 250 microliter DMEM zonder FBS en zes microliter transfectie-reagens.
Na 15 minuten incubatie, voegt u de oplossing voorzichtig toe aan de cellen. Voordat u meet, trekt u enkele laagweerstands-patchpipetten met een micropipettrekker en polijst u deze. Bewaar de pipetten op de dag van meting in een stofvrije container.
30 minuten voorafgaand aan de opnames, zet u alle componenten van de setup aan om op te warmen tot de werktemperatuur. Zorg ervoor dat de buffers op kamertemperatuur zijn. Om te beginnen, verzegelt u de meetkamer met siliconen om lekkage van de externe buffer te voorkomen.
Plaats vervolgens een deksel in de kamer en sluit deze. Vul de kamer voorzichtig met extracellulair buffer om te voorkomen dat de cellen losraken. Bewaar de petrischaal met andere deksels in een incubator voor de volgende set experimenten.
Plaats vervolgens de meetkamer onder de microscoop met behulp van de 40X objectief voor celvisualisatie. Plaats vervolgens een Auger-brug over de badelektrode en plaats deze samen met de vloeistofniveausensor en de perfusie-uitlaat van de badhandler in de kamer. Vervang de extracellulaire oplossing twee keer met één milliliter verse externe oplossing om het resterende kweekmedium en de losgekomen cellen te verwijderen.
Breng de cellen in focus en zoek naar een getransfecteerde cel die geïsoleerd moet worden van andere cellen. Gebruik vervolgens een triple band filterset en oranje licht om mCherry te exciteren en visualiseren. Vul vervolgens een van de getrokken pipetten met de intracellulaire oplossing.
Verwijder de luchtbellen door de pijp te kantelen. Monteer vervolgens de pijp op de pijphouders en oefen wat positieve druk uit om verstopping van de punt te voorkomen. Lokaliseer de punt van de patchpijp onder de microscoop en navigeer deze dicht bij de cel met behulp van de micromanipulator.
Start binnen de dataverzamelsoftware de membraantest in Bath-modus en pas een spanningsstap toe. Controleer of de pijpweerstand in het gewenste bereik van 1,3 tot 3,0 megaohms is. Nullen vervolgens de offsetstromen en pas het pijppotentieel aan door de pijpoffsetknop op de versterker te draaien.
Om een patch in de whole-cell configuratie te vestigen, benadert u de cel langzaam met de patchpijp van bovenaf en laat u de positieve druk los vlak voordat u de cel aanraakt. Soms vormt de cell-attached configuratie zichzelf daarna. Nadat u de cel hebt benaderd, verandert u de membraantest van Bath-modus naar Patch-modus.
Compenseer de pijpcapaciteit door de pijpcapaciteitscompensatieknop te draaien om een platte respons van de testpuls te krijgen. Schakel de membraantest naar Cell-modus. Scheur vervolgens de patch zonder de verzegeling te vernietigen door korte pulsen van negatieve druk of negatieve druk met toenemende sterkte toe te passen om whole-cell bevestiging te verkrijgen.
Start de serieweerstandscompensatie door de twee whole-cell parameters, celcapaciteit en serieweerstand, in te stellen. Schakel in het paneel voor serieweerstandscompensatie voorspelling en correctie in tot 90%. Schakel vervolgens de whole-cell compensatieschakelaar in en pas de whole-cell parameters op een iteratieve manier aan om een ideaal vlakke testverzegelrespons te verkrijgen. Na het vestigen van de whole-cell configuratie, wacht u minimaal twee minuten voordat u opneemt om voldoende vervanging van intracellulaire oplossing door de patchpijp te garanderen.
Neem licht-geïnduceerde stromen op bij verschillende holdingpotentiëlen. Wissel vervolgens de extracellulaire buffer naar laag chloride in de kamer ten minste vijf keer zonder de patch te vernietigen en neem een andere stroom-spanningsrelatie op bij de nieuwe chlorideconcentratie. Deze figuur laat zien dat tijdens de verlichting met groen licht, PsACR1 een snelle transiente stroom vertoont die snel afneemt tot een stationair stroomniveau.
Nadat het licht is uitgeschakeld, vervallen fotostromen binnen milliseconden tot nul. Het verminderen van de extracellulaire chlorideconcentratie schaft volledig de naar buiten gerichte fotostromen af. Het vervangen van de extracellulaire chlorideconcentratie veroorzaakt een verschuiving van het omkeerpotentiaal dat kan worden afgeleid uit een stroom-spanningsplot.
De evaluatie van omkeerpotentiën uit meerdere metingen kwantificeert de dramatische omkeerpotentiaalverschuiving veroorzaakt door de variatie van externe chlorideconcentratie. Opmerkelijk is dat de gemeten omkeerpotentiën direct overeenkomen met de berekende Nernst-potentiën voor chloride, wat de hoge chloride-selectiviteit van PsACR1 bevestigt. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een experimentele procedure om de chloride-selectiviteit van een anion-selectieve channelrhodopsine te bepalen met behulp van elektrofysiologische whole-cell patch-clamp opnames in HEK293-cellen. De methode biedt inzicht in de biofysica van channelrhodopsines, inclusief de amplitudes en kinetiek van de fotostromen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Elektrofysiologie
- Biofysica
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Channelrhodopsines zijn lichtgestuurde ionkanalen.
- Het begrijpen van ionselectiviteit is cruciaal voor hun toepassing in de neurowetenschappen.
- Elektrofysiologische technieken maken directe meting van de kanaalactiviteit mogelijk.
- HEK293-cellen worden veelvuldig gebruikt voor dergelijke experimenten.
Doel van de studie
- Om de chloride-selectiviteit van nieuwe lichtgestuurde ionkanalen te onderzoeken.
- Om belangrijke biofysische eigenschappen van channelrhodopsines te verkennen.
- Om een reproduceerbare experimentele procedure voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Whole-cell patch-clamp metingen.
- Voorbereiding van HEK293-cellen.
- Registratie van fotostromen.
- Optimalisatie van experimentele stappen.
Belangrijkste Resultaten
- Demonstratie van chloride-selectiviteit in de geteste channelrhodopsine.
- Inzichten in fotostroomamplitudes en -kinetiek.
- Vestiging van een betrouwbare methode voor het bestuderen van channelrhodopsines.
- Overdraagbaarheid van de procedure naar andere channelrhodopsines.
Conclusies
- De methode bepaalt effectief de ionselectiviteit in channelrhodopsines.
- Geoptimaliseerde procedures verbeteren de reproduceerbaarheid in elektrofysiologische studies.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van lichtgestuurde ionkanalen.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor het management
Elektrofysiologische bepaling van de ionselectiviteit in channelrhodopsines is van cruciaal belang voor het verminderen van risico's bij de vroegtijdige ontwikkeling van optogenetische instrumenten en het valideren van mechanistische hypothesen in de neurobiologie. Kwantitatieve patch-clampmetingen leveren direct, reproduceerbaar bewijs van de kanaalfunctie, wat bijdraagt aan het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie en een geïnformeerde selectie mogelijk maakt binnen portfolio's van ionkanaalmodulatoren. Deze workflow vormt de basis voor translationele continuïteit, van ontdekking tot preklinische optimalisatie van instrumenten in de neurowetenschappen en aanverwante therapeutische gebieden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Kwantificeert direct de ionselectiviteit en kanaalfunctie, waardoor mechanistische hypothesen worden verduidelijkt.
- Maakt functionele validatie van gemanipuleerde of nieuwe channelrhodopsines in heterologe systemen mogelijk.
- Biedt voorspellende betrouwbaarheid voor de verdere ontwikkeling van tools of therapeutica.
- Faciliteert de triage van portefeuilles door kandidaten met een hoge selectiviteit te onderscheiden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Stelt gevalideerde, reproduceerbare elektrofysiologische assays vast voor de karakterisering van ionkanalen.
- Biedt kwantitatieve stroom-spanningsrelaties en metingen van de omkeerpotentiaal.
- Maakt standaardisatie mogelijk van workflows voor het screenen van lichtgeactiveerde kanalen.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform voor het evalueren van technisch gemodificeerde varianten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro ionselectiviteitsgegevens uit elkaar in overeenkomst met ziekterellevante neuronale modulatiestrategieën.
- Waarborgt continuïteit van validatie in de ontdekkingsfase tot aan de preklinische beoordeling van optogenetische tools.
- Vermindert mechanistische ambiguïteit in translationele neurowetenschappelijke toepassingen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang van interventies op basis van channelrhodopsine.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode bevindt zich op het grensvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie en biedt een basis voor mechanische risicoreductie en assay-gereedheid bij de ontwikkeling van optogenetische instrumenten.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten mogelijk voor ionselectiviteit en kanaalfunctie in gemanipuleerde constructen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve elektrofysiologische resultaten voor de vergelijking van kandidaten.
- Analytics: Levert stroom-spanningscurven en gegevens over de omkeerpotentiaal ter ondersteuning van de statistische analyse van de selectiviteit.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen in vitro validatie en de optimalisatie van preklinische instrumenten in neuronale systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is voor nieuwe channelrhodopsine-varianten en verwante ionkanalen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van ionkanalen.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van elektrofysiologische assays.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie in pipelines voor optogenetische instrumenten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van hoogselectieve channelrhodopsine-kandidaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in patch-clamp elektrofysiologie en celkweektechnieken.
- Vereist toegang tot precisielichtbronnen, versterkers en analytische software.
- Necessiteert strikte standaardisatie van assaycondities en data-analyse tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse channelrhodopsine-constructen en heterologe expressiesystemen.
- Afhankelijk van de optimalisatie van preparatie- en registratiestappen voor reproduceerbaarheid.
