Name: Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer hoe je chloride-selectiviteit in channelrhodopsins bepaalt met whole-cell patch-clamp opnames in HEK293-cellen. Deze methode meet fotostromen en ionselectiviteit voor biofysisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Maila Reh, Tharsana Tharmalingam en vooral Altina Klein voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 tot PH) en de Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) en E4 (PH).

<ol><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle.</a> Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+noninvasive+activation+and+inhibition+of+neural+and+network+activity+by+vertebrate+rhodopsin+and+green+algae+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).</li>
<li>Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+selectivity+and+competition+in+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ion selectivity and competition in channelrhodopsins.</a> Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).</li>
<li>Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476</a> (2012).</li>
<li>Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Channelrhodopsin+with+a+Red-Shifted+Spectrum+and+Rapid+Kinetics+from+Mesostigma+viride%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride.</a> MBio. 2 (3), 1-9 (2011).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+highly+efficient+blue-shifted+channelrhodopsin+from+the+marine+alga+Platymonas+subcordiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis.</a> J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).</li>
<li>Hou, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Chlamydomonas+Channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins.</a> Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).</li>
<li>Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation+of+Channelrhodopsin+into+a+Light-Activated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomonas+sulcata+ACR1%3A+A+Fast+Anion+Channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).</li>
<li>Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Natural+Green+Light+Absorbing+Chloride+Conducting+Channelrhodopsin+from+Proteomonas+sulcata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata.</a> J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B., Steinbach, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+patch+clamp%3A+A+method+for+resolving+currents+through+individual+open+channels+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The extracellular patch clamp: A method for resolving currents through individual open channels in biological membranes.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 375 (2), 219-228 (1978).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol.+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. Arch. Eur. J. Physiol. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> J. Neurosci. Methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Amtmann, A., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+procedure+for+the+correction+of+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments+on+endo-+and+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A unified procedure for the correction of liquid junction potentials in patch clamp experiments on endo- and plasma membranes.</a> J. Exp. Bot. 48, (Special) 361-364 (1997).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e1-e18 (2012).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84 (21), 7413-7417 (1987).</li>
<li>Halliwell, J., Whitaker, M., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch01.pdf">Using microelectrodes.</a> Microelectrode Tech. Plymouth Work. Handb. 3, 1-15 (1949).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J. Vis. Exp. (20), e1-e2 (2008).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 411 (2), 204-211 (1988).</li>
<li>Berndt, A. Mechanismus und anwendungsbezogene Optimierung von Channelrhodopsin-2. , Diss Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100191266</a> (2011).</li>
<li>Prigge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color-tuned+channelrhodopsins+for+multiwavelength+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics.</a> J. Biol. Chem. 287 (38), 31804-31812 (2012).</li>
<li>Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., Hegemann, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3325117/">Rectification of the channelrhodopsin early conductance.</a> Biophys. J. 101 (5), 1057-1068 (2011).</li>
<li>Beppu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+countering+of+glial+acidosis+suppresses+glial+glutamate+release+and+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage.</a> Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).</li>
<li>Wietek, J., Prigge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+Channelrhodopsins%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancing Channelrhodopsins: An Overview.</a> Methods Mol. Biol. 1408, 141-165 (2016).</li>
<li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+approaches+addressing+extracellular+modulation+of+neural+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Optogenetic approaches addressing extracellular modulation of neural excitability.</a> Sci. Rep. 6, 1-20 (2016).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red-shifted+optogenetic+excitation%3A+a+tool+for+fast+neural+control+derived+from+Volvox+carteri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri.</a> Nat. Neurosci. 11 (6), 631-633 (2008).</li>
<li>Sugiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocurrent+attenuation+by+a+single+polar-to-nonpolar+point+mutation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocurrent attenuation by a single polar-to-nonpolar point mutation of channelrhodopsin-2.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8 (3), 328-336 (2009).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v14/n4/full/nn.2776.html">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+differentiating+photocurrent+properties+of+two+channelrhodopsins+from+chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas.</a> J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eNpHR%3A+a+Natronomonas+halorhodopsin+enhanced+for+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).</li>
<li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bepaling van omkeerpotentiaal bij gedefinieerde ionische en elektrische omstandigheden geeft informatie over de ionen die worden vervoerd na lichtactivering van ChRs. Als uitsluitend één ionensoort in een complex fysiologisch medium wordt gevarieerd en de verkregen omkeerpotentiaalverschuivingen volgens het theoretische Nernst-potentieel, is deze ionensoort de enige vervoerde. Voor ChR&#39;s zijn reversibele potentiële verschuivingen echter meestal minder uitgesproken dan verwacht van de Ner...

Channelrhodopsins (ChR) zijn lichtgated ion kanalen die zich voordoen in de oogpunt van motiele groene algen, en dienen als primaire fotosensoren voor fototaxis en fobische reacties 1 . Sinds hun eerste beschrijving in 2002 2 hebben ChRs de weg gebaan voor het opkomende veld van optogenetica en kan het worden toegepast in een verscheidenheid aan excitabele cellen, bijv. Binnen de skeletspieren, het hart of de hersenen 3 , 4 , 5 . Expressie van ChRs in doelcellen resulteert in lichtregelbare ionpermeabiliteit van de respectievelijke cel. In een neuronale context laat dit toe met activering 6 , 7 , 8 of remming 9 , 10 van het potentieel van de potentieel (AP) - afhankelijk van het uitgevoerde ion - met de ruimtelijke en temporalePrecisie van licht waarbij wordt benadrukt hoe de ionen selectiviteit van een ChR variant zijn optogenetische toepassing bepaalt. De eerste ontdekte ChR&#39;s van Chlamydomonas reinhardtii en Volvox carteri zijn doorlaatbaar voor protonen, maar ook voor monovalente kationen zoals natrium, kalium en in mindere mate divalente kationen zoals calcium en magnesium 11 , 12 , 13 . Vandaag, meer dan 70 natuurlijke kation-conducterende channelrhodopsins (CCR&#39;s) 14 , 15 , 16 , 17 en verschillende gemanipuleerde varianten 18 , 19 , 20 met verschillende eigenschappen zoals Fotocurrentgrootte, spectrale gevoeligheid, kinetiek en kation selectiviteit zijn beschikbaar. Terwijl in de neurowetenschappen CCR&#39;s aRe gebruikt om cellen te activeren en AP&#39;s te activeren. Lichtgedreven microbiële pompen waren de enige beschikbare antagonisten voor het zwijgen van neuronen. In 2014 lieten twee groepen tegelijkertijd zien dat CCR&#39;s kunnen worden omgezet in anion-conducting channelrhodopsins (ACR&#39;s) door verandering van de polariteit langs de putatieve ion geleidende porie via moleculaire engineering 9 , 21 . Vervolgens werden natuurlijke ACR&#39;s geïdentificeerd in verschillende cryptofyte alg 22 , 23 , 24 . Belangrijker nog, lichtactivering van ACR&#39;s bemiddelt chloridestromen in volwassen neuronen waardoor remming van neuronale activiteit bij veel lagere lichtintensiteiten mogelijk is dan microbiële pompen die alleen enkele ladingen per geabsorbeerd foton transporteren. ChR activiteit kan direct worden aangepakt door elektrofysiologische patch-clamp opnames van licht geïnduceerde stromingen in HEK293 cellen. De patch-klemTechniek werd oorspronkelijk ontwikkeld in de late jaren 1970 en werd verder verbeterd door Hamill et al. , Waardoor de opname van de entiteit van stromen van een kleine cel (hele cel modus) met hoge stroomresolutie en directe controle van de membraanspanning 26 mogelijk is . Toegepast in celcultuur, deze techniek zorgt voor een nauwkeurige controle van de ionische en elektrische opname omstandigheden, en maakt het mogelijk om de ion selectiviteit te bestuderen, samen met de relatieve bijdrage van de ionen tot de totale stroom. Hierbij illustreren we het onderzoek van ionen selectiviteit voor de anion-conducting channelrhodopsin van Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via de opname van stroomspanning relaties onder verschillende extracellulaire chloride concentraties om high chloride conductance te bewijzen.

<table><tbody><tr><td>HEK293 cellen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>Human embryonale niercellen</td></tr><tr><td>Retinal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Agarbruggen</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biochrome</td><td>S0615</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-Glucose</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-Methyl-D-glucamine</td></tr><tr><td>Na-Aspartate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>L-Asparaginezuur natriumzout monohydraat</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Beperkingsenzym</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Chemocompetent E. coli</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny broth medium</td><td>Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>Agar platen</td></tr><tr><td>Plasmid zuiveringskit</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrome</td><td>A 2213</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Coverslip coating</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Vuurpolijsten</td></tr><tr><td>Serologische pipetten</td><td>TPP</td><td></td><td>Verschillende maten</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Roerder</td><td>IKA</td><td>RCT classic</td><td></td></tr><tr><td>Zilverdraad</td><td>Science Products</td><td>AG-T25; AG-T10</td><td>Elektroden, 0.64 mm (bad); 0.25 mm (elektrode)</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Knick</td><td>765 Calimetric</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Vuurpolijsten</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Binder</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur schalen</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm interne diameter</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Roth</td><td>P232</td><td>15 mm diameter</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>R&ouml;ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10 transmissie</td></tr><tr><td>Pipethouders</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>DigiData1400</td><td>Digitaal analoog converter</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>Ingesteld op 540 nm volledige intensiteit</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillairen</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Borosililaat capillairen met vuuropgepoetste uiteinden OD 1,5 mm ID&nbsp; 0,86 mm</td></tr><tr><td>Micropipetpuller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Bad handler</td><td>Lorenz Messger&auml;tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>Tripleband filterset</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Fluorescentie filter&nbsp; ECFP/EYFP/mCherry&nbsp;</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optometer</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Meet lichtintensiteiten</td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Opnamekamer</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voeding</td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Vermijdt elektrische ruis van de ingebouwde voeding van de microscoop</td></tr><tr><td>Vibratie geïsoleerde tafel</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Faraday kooi</td><td>Op maat gemaakt of een commercieel passende tafel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slangen</td><td>Elke commerciële; bijv. Roth</td><td></td><td>Verschillende maten en materialen voor badhantering en toepassing van pipettendruk; agarbruggen</td></tr><tr><td>Lineaire schudder</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Liquid junction potentiaal calculator</td><td>Molecular Devices of rechtstreeks van Peter H. Barry</td><td></td><td>Het programma is inbegrepen in de Clampex aankoopsoftware of kan worden verkregen van&nbsp; p.barry@unsw.edu.au</td></tr><tr><td>Data acquisitie software</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Data evaluatie software</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank of Addgene</td><td>KF992074.1 of Addgene plasmid #85465</td><td>Gen dat codeert voor PsACR1</td></tr><tr><td>Versterker handleiding</td><td>Molecular Devices</td><td>The Axon Guide</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Gedurende het afgelopen decennium werden channelrhodopsinen onontbeerlijk in neurowetenschappelijk onderzoek waar ze gebruikt worden als hulpmiddelen om niet-invasieve manipulatie van elektrische processen in doelcellen. In deze context is ionen-selectiviteit van een kanaalrhodopsine van bijzonder belang. Dit artikel beschrijft het onderzoek van chloride selectiviteit voor een onlangs geïdentificeerd anion-conducting channelrhodopsin van Proteomonas sulcata via elektrofysiologische patch-clamp opnames op HEK293 cellen. De experimentele procedure voor het meten van lichtgatede fotocromen eist een snelle omschakelbare - ideaal monochromatische - lichtbron die in de microscoop van een anders gebruikelijke patch-klemopstelling is gekoppeld. Voorbereidende procedures voorafgaand aan het experiment worden beschreven met betrekking tot bereiding van gebufferde oplossingen, overwegingen over vloeibare kruisingspotenties, zaaien en transfectie van cellen en het trekken van patchpipetten. De feitelijke opname van stroomspanning relatieS om de omkeringspotentiaal te bepalen voor verschillende chloride concentraties vindt plaats 24 uur na 48 uur na transfectie. Tenslotte worden elektrofysiologische gegevens geanalyseerd met betrekking tot theoretische overwegingen van chlorideleiding.

<html> Figuur 2 toont representatieve resultaten verkregen uit metingen volgens het beschreven protocol. Tijdens verlichting met groen licht, heeft Ps ACR1 een snelle transientstroom die snel afneemt op een stationair stroomniveau. Nadat het licht is uitgeschakeld, vervallen de fotocellen binnen millisekonden tot nul ( Figuur 2A ). Het uitwisselen van de extracellulaire chloride concentratie zorgt voor een verschuiving van het omkeringspotentieel...

Dit artikel beschrijft hoe de ion-selectiviteit van channelrhodopsine wordt bepaald met elektrofysiologische whole-cell patch-clamp opnames met behulp van HEK293 cellen. Hier wordt de experimentele procedure voor het onderzoeken van chloride-selectiviteit van een anion-selectieve channelrhodopsine gedemonstreerd. De procedure is echter overdraagbaar naar andere channelrhodopsinen met een verschillende selectiviteit.

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Het algemene doel van dit experiment is om de chloride-selectiviteit van nieuwe licht-gestuurde ionkanalen te bepalen. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in de biofysica van channelrhodopsins, zoals fotocurrentamplitudes, kinetiek en ionselectiviteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de directe aflezing van biofysische kanaalactiviteit die snel en gemakkelijk te repliceren is.Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden, omdat elke stap van de experimentele procedure, van de bereiding van HEK-cellen tot het opnemen van fotostromen, moet worden geoptimaliseerd. Het zaaien en doorsnijden van de HEK-cellen zal worden gedemonstreerd door Altina Klein. Om deze procedure te beginnen, weeg de vaste componenten voor 100 milliliter van de intracellulaire en 500 milliliter van de extracellulaire gebufferde oplossingen in afzonderlijke bekers.Voeg vervolgens de respectieve hoeveelheid van de bereide stockoplossingen toe. Voeg vervolgens ultrapuur water toe en pas voorzichtig de pH aan met behulp van zuren en basen. Pas vervolgens de osmolariteit aan met glucose tot 290 milliosmolen en 320 milliosmolen voor de intracellulaire en extracellulaire oplossingen, respectievelijk.Bij deze procedure plaatst u maximaal drie lysine-gecoate glazen deksels naast elkaar in een 35-millimeter petrischaal. Zaai vervolgens 1,5 keer 10 tot de vijfde HEK-cellen in twee milliliter standaard DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en één micromolar retinol in elke schaal. Om de cellen voor elke schaal te transfecteren, bereidt u een oplossing van twee microgram plasmide-DNA in 250 microliter DMEM zonder FBS en zes microliter transfectie-reagens.Na 15 minuten incubatie, voegt u de oplossing voorzichtig toe aan de cellen. Voordat u meet, trekt u enkele laagweerstands-patchpipetten met een micropipettrekker en polijst u deze. Bewaar de pipetten op de dag van meting in een stofvrije container.30 minuten voorafgaand aan de opnames, zet u alle componenten van de setup aan om op te warmen tot de werktemperatuur. Zorg ervoor dat de buffers op kamertemperatuur zijn. Om te beginnen, verzegelt u de meetkamer met siliconen om lekkage van de externe buffer te voorkomen.Plaats vervolgens een deksel in de kamer en sluit deze. Vul de kamer voorzichtig met extracellulair buffer om te voorkomen dat de cellen losraken. Bewaar de petrischaal met andere deksels in een incubator voor de volgende set experimenten.Plaats vervolgens de meetkamer onder de microscoop met behulp van de 40X objectief voor celvisualisatie. Plaats vervolgens een Auger-brug over de badelektrode en plaats deze samen met de vloeistofniveausensor en de perfusie-uitlaat van de badhandler in de kamer. Vervang de extracellulaire oplossing twee keer met één milliliter verse externe oplossing om het resterende kweekmedium en de losgekomen cellen te verwijderen.Breng de cellen in focus en zoek naar een getransfecteerde cel die geïsoleerd moet worden van andere cellen. Gebruik vervolgens een triple band filterset en oranje licht om mCherry te exciteren en visualiseren. Vul vervolgens een van de getrokken pipetten met de intracellulaire oplossing.Verwijder de luchtbellen door de pijp te kantelen. Monteer vervolgens de pijp op de pijphouders en oefen wat positieve druk uit om verstopping van de punt te voorkomen. Lokaliseer de punt van de patchpijp onder de microscoop en navigeer deze dicht bij de cel met behulp van de micromanipulator.Start binnen de dataverzamelsoftware de membraantest in Bath-modus en pas een spanningsstap toe. Controleer of de pijpweerstand in het gewenste bereik van 1,3 tot 3,0 megaohms is. Nullen vervolgens de offsetstromen en pas het pijppotentieel aan door de pijpoffsetknop op de versterker te draaien.Om een patch in de whole-cell configuratie te vestigen, benadert u de cel langzaam met de patchpijp van bovenaf en laat u de positieve druk los vlak voordat u de cel aanraakt. Soms vormt de cell-attached configuratie zichzelf daarna. Nadat u de cel hebt benaderd, verandert u de membraantest van Bath-modus naar Patch-modus.Compenseer de pijpcapaciteit door de pijpcapaciteitscompensatieknop te draaien om een platte respons van de testpuls te krijgen. Schakel de membraantest naar Cell-modus. Scheur vervolgens de patch zonder de verzegeling te vernietigen door korte pulsen van negatieve druk of negatieve druk met toenemende sterkte toe te passen om whole-cell bevestiging te verkrijgen.Start de serieweerstandscompensatie door de twee whole-cell parameters, celcapaciteit en serieweerstand, in te stellen. Schakel in het paneel voor serieweerstandscompensatie voorspelling en correctie in tot 90%. Schakel vervolgens de whole-cell compensatieschakelaar in en pas de whole-cell parameters op een iteratieve manier aan om een ideaal vlakke testverzegelrespons te verkrijgen. Na het vestigen van de whole-cell configuratie, wacht u minimaal twee minuten voordat u opneemt om voldoende vervanging van intracellulaire oplossing door de patchpijp te garanderen.Neem licht-geïnduceerde stromen op bij verschillende holdingpotentiëlen. Wissel vervolgens de extracellulaire buffer naar laag chloride in de kamer ten minste vijf keer zonder de patch te vernietigen en neem een andere stroom-spanningsrelatie op bij de nieuwe chlorideconcentratie. Deze figuur laat zien dat tijdens de verlichting met groen licht, PsACR1 een snelle transiente stroom vertoont die snel afneemt tot een stationair stroomniveau.Nadat het licht is uitgeschakeld, vervallen fotostromen binnen milliseconden tot nul. Het verminderen van de extracellulaire chlorideconcentratie schaft volledig de naar buiten gerichte fotostromen af. Het vervangen van de extracellulaire chlorideconcentratie veroorzaakt een verschuiving van het omkeerpotentiaal dat kan worden afgeleid uit een stroom-spanningsplot.De evaluatie van omkeerpotentiën uit meerdere metingen kwantificeert de dramatische omkeerpotentiaalverschuiving veroorzaakt door de variatie van externe chlorideconcentratie. Opmerkelijk is dat de gemeten omkeerpotentiën direct overeenkomen met de berekende Nernst-potentiën voor chloride, wat de hoge chloride-selectiviteit van PsACR1 bevestigt. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van

whole-cell-patch-clamp-recordings-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

The video demonstrates recording electrical activity in the photoreceptor neurons of Drosophila's ommatidium by establishing a whole-cell configuration. It highlights the activation of transient receptor potential channels by light pulses, resulting in measurable quantum bumps.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

In this video, embryonic kidney cell cultures expressing light-dependent ion channel proteins fused with a fluorescent reporter demonstrate the effect of light on ion movement. Whole-cell patch clamp is used to monitor the movement of ions.

Optogenetic Electrophysiology Recording of Cells with Light-Dependent Ion Channels

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Het doel van deze video aan te tonen procedures voor het verkrijgen van gezonde, intacte haarcellen van het binnenoor organen van volwassen zebravissen en gebruik voor patch clamp studies gericht op het karakteriseren van de biofysische eigenschappen van de voltage-gated kanalen.

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Leer hoe je chloride-selectiviteit in channelrhodopsins bepaalt met whole-cell patch-clamp opnames in HEK293-cellen. Deze methode meet fotostromen en ionselectiviteit voor biofysisch onderzoek.

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Meer video's verkennen