Name: Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Ontdek hoe atoomkrachtmicroscopie DNA-letselherkenning door reparatie-eiwitten in kaart brengt. Deze methode visualiseert eiwit-DNA-interacties en onderscheidt complexen in nucleotide excisiereparatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PUC19N, CPD-bevattende oligonucleotiden en p44 werden vriendelijk verschaft door respectievelijk Samuel Wilson, Korbinian Heil en Thomas Carell, en Gudrun Michels en Caroline Kisker. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 en TE-671/4 naar IT.

<ol><li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machines+of+DNA+repair%3A+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li>
<li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li>
<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
<li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li>
<li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li>
<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
<li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li>
<li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625(2015).</li>
<li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).</li>
<li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UvrB%2C+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li>
<li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+TFIIH%2C+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA%2C+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li>
<li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li>
<li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
<li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product%2C+UvrB%2A+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UvrB+domain+4%2C+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li>
<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

AFM statistische analyses van bindende posities van eiwitten op lange DNA-fragmenten die specifieke doelstellingsplaatsen bevatten, kunnen interessante details aantonen over de specifieke strategieën die door het eiwit gebruikt worden om deze sites 2 , 3 , 4 , 5 , 6 te herkennen. Om de resulterende positieverdelingen te interpreteren, moeten de posities van d...

Atomische krachtmicroscopie (AFM) is een krachtige techniek voor de analyse van eiwit-DNA-interacties 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Het vereist slechts lage hoeveelheden monstermateriaal om heterogene monsters rechtstreeks te visualiseren met een resolutie op het molecuulniveau. Heterogeniteit kan resulteren uit verschillende conformatieve of oligomere toestanden van een eiwit. In het bijzonder kunnen eiwitcomplexen in het kader van eiwit-DNA-monsters verschillende stoichiometrieën en / of conformaties veroorzaken die geïnduceerd zijn door DNA-binding in het algemeen of aan een specifieke doelplaats in DNA binden. Heterogene monsters kunnen ook twee (of meer) verschillende soorten eiwitten bevatten en een ander eiwitcomplexVormen (bijvoorbeeld bestaande uit slechts één type eiwit versus heteromeer complexen) kunnen verschillen met DNA. De hier beschreven studies maken gebruik van AFM-beeldvorming in lucht op statische, gedroogde monsters van DNA-reparatie-eiwitten die gebonden zijn aan lange (~ 900 basisparen, bp) DNA-fragmenten die een letsel bevatten, die een doelstelling voor deze eiwitten vertegenwoordigt. De hoge moleculaire resolutie van AFM maakt het onderscheid mogelijk tussen verschillende typen eiwitcomplexen en om de bindingsposities van de eiwitten op de DNA-fragmenten te bepalen. Het is belangrijk dat de laesies in de DNA-substraten worden ingevoerd bij goed gedefinieerde posities. Omdat de positie van de laesieplaats in het DNA bekend is, geven de verdelingen van eiwitten die gebonden zijn aan DNA inzicht in (verschillende) laesieherkenningseigenschappen van de (verschillende) eiwitcomplexen, bijvoorbeeld hoe goed ze een bepaald type laesie herkennen (vergeleken Naar niet beschadigd DNA) 2 , 3 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 . Hun posities op het DNA maken het onderscheid mogelijk tussen eiwitcomplexen die specifiek gebonden zijn aan de laesies en complexen die niet specifiek gebonden zijn elders op het DNA. Afzonderlijke karakterisering van deze verschillende complexe typen (complexen die specifiek zijn gebonden aan de lesie versus niet-specifieke complexen) kunnen potentiële conformatieve veranderingen onthullen in de complexen die zijn geïnduceerd bij de identificatie van de doelplaats. De DNA-herstellingsproteïnen die hierop gericht zijn, zijn helicasen die verantwoordelijk zijn voor de herkenning van de laesie in de nucleotide-excisie-reparatie (NER) -weg. Bij bacteriën wordt NER bereikt door de eiwitten UvrA, UvrB en UvrC. UvrA is verantwoordelijk voor het aanvankelijke letselsensor in een UvaA 2 / UvrB 2 DNA-scanningskomplex. Bij laesieverificatie door UvrB converteert dit complex naar monomere UvrB gebonden op de lesion site en dit specifieke complex kan dan de pRokaryotische NER endonuclease UvrC. UvrC exciseert een korte (12-13 nt) streep van enkelstrengs DNA (ssDNA) dat de laesie bevat. Het ontbrekende rek wordt dan door DNA-polymerase opgevuld. Ten slotte sluit DNA ligase de nieuw gesynthetiseerde rek met het originele DNA 9 , 10 . In eukaryoten zijn de meeste eiwitten van de NER-cascade onderdeel van het grote, multimere transcriptiefactor II H (TFIIH) complex. Na aanvankelijke letselsensor via het trimerische CEN2-XPC-HR23B-complex, wordt TFIIH aangeworven op de DNA-doelplaats. Wanneer XPD binnen het complex de aanwezigheid van een NER-targetletsel verifieert, worden de eukaryote NER-endonucleasen XPG en XPF aangeworven om een ​​korte (24-32 nt) streep van ssDNA die de letsel 9 , 10 bevat , te accijnzen. Hierbij werden specifiek de helicasen UvrB en XPD van respectievelijk prokaryotische en eukaryote NER bestudeerd. Deze helicasen vereisen een ongeparkeerde regio in deDNA (een DNA-bubble) om op een van de twee DNA-enkele strengen te treden en vervolgens te verplaatsen langs deze streng, die door ATP-hydrolyse wordt aangevuurd. Naast de DNA-laesies werd derhalve een DNA-bubble geïntroduceerd in de substraten die fungeren als laadplaats voor de eiwitten. De werkwijze voor de bereiding van specifieke lesion-DNA-substraten is eerder beschreven 11 . Het vereist een cirkelvormig DNA-construct (plasmide) met twee dicht gespannen restrictieplaatsen voor een nickase. In het kader van deze studie werd het plasmide pUC19N (2729 bp) gebruikt (gecreëerd door S. Wilson&#39;s laboratorium, NIEHS). Dit plasmide bevat drie nauw gespecificeerde restrictieplaatsen voor de nickase Nt.BstNBI die een 48 nucleotide (nt) rek vormt. Na incubatie met de nickase kan de streep van ssDNA tussen deze plaatsen verwijderd en vervangen worden door een oligonucleotide dat elke doelstelling bevat. Na elke stap wordt complete enzymatische vertering getest via agarosegelelektroforese. Gesneden cirkelvormig DNA kan onderscheiden worden door zijn lagere elektroforetische mobiliteit in vergelijking met het oorspronkelijke supercoiled plasmide. Gapping van het DNA en vervanging van de verwijderde rek door het specifieke substraat oligonucleotide kan worden geëvalueerd via digestie met een restrictie-enzym dat het substraat uitsluitend binnen het gebied tussen de nicks inciseert. Linearisatie van het cirkelvormige plasmide door het enzym zal derhalve worden onderdrukt voor het gapped DNA en hersteld na insertie van het specifieke oligonucleotide. Tenslotte maken twee endonuclease restrictieplaatsen (ideaal single cutters) de mogelijkheid tot het genereren van een lineair DNA-substraat, met de gewenste lengte en met de specifieke doelplaats in een gedefinieerde positie, evenals een DNA-bubble op een afstand van de laesie, ook in 5 &#39;Of 3&#39; richting. Erkenning van de laesies door de NER helicases kan worden onderzocht via AFM beeldvorming. Verstoppelde DNA-translocatie van de helicasen bij tZijn lesion site is zichtbaar als een piek in de eiwit positie verdeling op het DNA en geeft aan dat er lesie herkenning is. Omdat DNA-translocatie van deze helicasen verder gericht is, met 5&#39;-tot-3&#39;-polariteit, geeft de afhankelijkheid van laesieherkenning op de positie van de laadplaats (DNA-bubbel stroomopwaarts of stroomafwaarts van de laesie) ook aan of de lesion bij voorkeur herkend wordt Op de getransloceerde of op de tegenovergestelde, niet-getranslodeerde ssDNA-streng 5 , 9 . In de volgende paragrafen worden de gebruikte methoden ingevoerd en worden de belangrijkste bevindingen van deze experimenten kort besproken. Belangrijk, analoog aan het voorbeeldige werk op DNA-reparatie hier getoond, kan AFM beeldvorming worden toegepast op de studie van verschillende DNA-interactie systemen, zoals DNA replicatie of transcriptie 8 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Molecular Force Probe (MFP) 3D</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>atomic force microscope (AFM)</td></tr><tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td>computer</td></tr><tr><td>ThermoMixer en 1,5 mL blok</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>heat block voor DNA-voorbereiding</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 &amp; blokken voor 0,5 mL buizen</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 &amp; Y267.1</td><td>heat block voor eiwit-DNA-incubaties</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1704467</td><td>elektroforesekamer met gelgieter en voeding</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1645050</td><td>elektroforese-voeding</td></tr><tr><td>Centifuge 5415 D met rotor</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>tafelcentrifuge</td></tr><tr><td>Ultra-Lum elektronische UV transillumonator MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>UV-belichtingstafel</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>UV spectrofotometer</td></tr><tr><td>TKAX-CAD met 0,2 &mu;m capsulefilter</td><td>Unity Lab Services</td><td>N/A</td><td>waterdeïonisatie- en filtereenheid</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-software op Igor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>AFM-software</td></tr><tr><td>ImageJ (open source Java beeldverwerking)</td><td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>Beeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office)</td><td>Microsoft Corporation</td><td>N/A</td><td>gegevensanalysesoftware</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A</td><td>statistische gegevensanalyse en grafieksoftware</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>Olympus</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM cantilevers</td></tr><tr><td>grade V-5 muscovite</td><td>SPI Supplies</td><td>1805</td><td>mica platen</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL 50k Ultracell</td><td>Millipore Ireland Ltd.</td><td>UFC505096</td><td>centrifugefilters</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&nbsp;</td><td>&nbsp;Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>Agarose gel extractiekit</td></tr><tr><td>Rotilabo cellulose papier type 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>AFM depositie blottingpapier</td></tr><tr><td>Anatop 25 (0,02 &mu;m)</td><td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>spuitfilter</td></tr><tr><td>SSpI, BspQI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0132, R0712</td><td>restrictie-enzymen voor DNA substraatvoorbereiding</td></tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>restrictie-enzymen voor DNA voorbereiding controles</td></tr><tr><td>nicking restrictie-enzym Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>R0607</td><td>nickase</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0202S</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>Tris, HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855, 9105</td><td>buffer chemicaliën</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>zout chemicaliën</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>zout chemicaliën</td></tr><tr><td>DTT, TCEP, EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>chemicaliën/reagentia</td></tr><tr><td>agarose, azijnzuur, HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267, 3738, K025</td><td>reagentia</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>nucleotiden</td></tr><tr><td>oligonucleïde #1 in Tabel 1</td><td>Biomers</td><td>op maat</td><td>complementair DNA oligonucleïde</td></tr><tr><td>oligonucleïden #2, #3 en #6 in Tabel 1</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>op maat</td><td>fluoresceine bevattende oligonucleïden</td></tr><tr><td>oligonucleïden #4&nbsp; en #5 in Tabel 1</td><td>privé (beschikbaar bij b.v. TriLink of GlenResearch)</td><td></td><td>CPD bevattende oligonucleïden</td></tr><tr><td>SafeSeal reactiebuisje 0,5 mL en 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 en 72.706</td><td>incubatiebuisjes</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>6x geconcentreerde gel-belastingskleurstof paars</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>DNA-belastingskleurstof</td></tr><tr><td>Midori Green&nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>DNA-kleuring</td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy onderzoek naar dna lesion recognition in nucleotide excision repair

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFM-beeldvorming is een krachtige techniek voor de studie van eiwit-DNA-interacties. Deze enkele molecuulmethode maakt de gelijktijdige resolutie van verschillende moleculen en moleculaire assemblages in een heterogeen monster mogelijk. In de specifieke context van eiwitsystemen die met DNA interageren, kunnen verschillende eiwitcomplexvormen en hun overeenkomstige bindingsposities op doelsites die DNA-fragmenten bevatten, dus worden onderscheiden. Hier wordt een toepassing van AFM gepresenteerd voor de studie van DNA-lesieherkenning in de prokaryote en eukaryote nucleotide-excisie DNA-reparatie (NER) systemen. De procedures voor DNA- en eiwitmonstervoorbereidingen worden beschreven en experimentele evenals analytische details van de experimenten worden verstrekt. De gegevens maken belangrijke conclusies mogelijk over de strategieën waarmee doelplaatsverificatie kan worden bereikt door de NER-eiwitten. Interessant is dat ze verschillende benaderingen van lesieherkenning en -identificatie voor het eukaryote NER-systeem aangeven, afhankelijk van het type lesie. Verder resulteren en verklaren verschillende structurele eigenschappen van de twee verschillende helicasen die betrokken zijn bij prokaryote en eukaryote NER de verschillende strategieën die voor deze twee systemen worden waargenomen. Belangrijk is dat deze experimentele en analytische benaderingen niet alleen kunnen worden toegepast op de studie van DNA-reparatie, maar ook zeer vergelijkbaar op andere eiwitsystemen die met DNA interageren, zoals die welke betrokken zijn bij replicatie- of transcriptieprocessen.

Onderscheid tussen verschillende complexe types op basis van eiwitcomplexvolumes De helicase activiteit van het prokaryotische NER helicase UvrB wordt gestimuleerd door DNA-binding 22 , 23 . UvrB vereist een ongepaarde regio in het DNA (een DNA-bubble) om correct op een van de twee single ssDNA-strengen te laden. In vivo wordt deze DNA-structuur verschaft door DN...

Hier wordt de studie van verschillende DNA-letselsherkenningsbenaderingen via enkele molecuul AFM-beeldvorming gedemonstreerd met het nucleotide-excisiereparatiesysteem als voorbeeld. De procedures van DNA- en eiwitmonstervoorbereidingen en experimentele evenals analytische details voor de AFM-experimenten worden beschreven.

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Het algemene doel van dit atoomkrachtmicroscopie-experiment is om interacties van DNA-reparatie-eiwitten met schadeplaatsen in DNA op te lossen en om onderscheid te maken tussen verschillende DNA-interacties door verschillende eiwitcomplexen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het DNA-reparatiegebied, zoals hoe een bepaald DNA-reparatiesysteem de herkenning van zijn doellessies in het DNA bereikt. Het grote voordeel van deze techniek is dat we de verschillende soorten complexen die betrokken zijn bij het proces van DNA-letselherkenning direct kunnen zien en analyseren.Nicolas Wirth, die deze aanpak tijdens zijn bacheloronderzoek heeft gebruikt, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen, bereid een geschikt DNA-substraat voor door een enkelstrengs DNA-hiaat in een plasmide te genereren. Vul het hiaat opnieuw met gemodificeerde, enkelstrengs DNA-oligonucleotiden en linealiseer ten slotte het plasma-DNA met behulp van geschikte restrictie-enzymen.Voor deze experimenten zijn de dubbelstrengs DNA-substraten ongeveer 1.000 basenparen lang en bevatten ze een DNA-lesie evenals een ongepaarde regio die een DNA-bubbel wordt genoemd voor eiwitbelasting op het DNA. Bereid vervolgens een eiwit-DNA-monster voor AFM-analyse door eerst 10x Reactiebuffer en water in een microreactiebuisje te pipetteren. Voeg vervolgens het DNA en de onderzochte eiwitten toe.Hier bijvoorbeeld 100 nanomolar van het DNA-monster en één micromolar van elk van de eukaryote nucleotide-excisiereparatie-eiwitten XPD en p44. Bewerk daarna de reactie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een warmteblok. Na de incubatie, draai het monster kort door.Bereid vervolgens een mica-substraat voor om het monster op te plaatsen. Gebruik een scalpel om een stukje mica van één centimeter bij één centimeter uit een grotere strip te snijden. Gebruik vervolgens een stukje plakband om de bovenste lagen van de mica te verwijderen om een schone, platte, anatomisch gladde substraatoppervlakte te onthullen.Verdun het eiwit-DNA-monster vijftig- tot honderdvoudig in AFM-depositionsbuffer en deponeer onmiddellijk 20 microliters van het verdunde monster op het mica-oppervlak. De verdunningsfactor hangt af van de monsterconcentratie. Onmiddellijk na het deponeren van het monster op het mica-oppervlak, spoelt u het monster drie tot vier keer met enkele milliliters gefilterd, gedeïoniseerd water en dekt u overtollig vocht af.Gebruik een zachte stroom stikstof om het monster te drogen. Bevestig tenslotte het monster aan de randen met plakband op een microscoopglasplaat. Plaats het monster in het midden van de AFM-standaard en bevestig de microscoopglasplaat met magnetische kussens op de standaard.Steek vervolgens de AFM-tip in de tiphouder. Bevestig de tip in de houder onder een klem door de schroef vast te draaien zodat deze vingerswijd is. Eenmaal bevestigd, breng de tiphouder in de AFM-meetkop.Gebruik de positioneringsschroeven om het monster in een centrale positie te brengen. Plaats de AFM-meetkop bovenop het monster en zorg ervoor dat de kop stabiel staat met zijn poten in de inkepingen van de standaard. Richt vervolgens de AFM-laser op de achterkant van de cantilever voor optimale signaalsterkte.Bekijk het reflectiesignaal in het AFM-videovenster om de laser grof te positioneren. Voor dit AFM-model, draai aan de wielen aan de rechterkant en achterkant van de AFM-meetkop om de X- en Y-posities van de AFM-laser aan te passen om deze centraal op het uiteinde van de cantilever te richten. Optimaliseer vervolgens het detector-somsignaal door de laserpositie fijn af te stellen met de twee wielen.Richt de AFM-laserreflectie op het centrum van de detector door het verschil van de bovenste en onderste diodes van de detectorarray op nul te zetten. Voor deze stap, draai de schroef aan de linkerkant van de meetkop voor dit AFM-model. Bepaal vervolgens de cantilever-residentiefrequentie door naar het masterpaneel-afstemmingsvenster in de software te gaan.Kies een amplitude die overeenkomt met een ingang van één volt voor de Piezo die de cantileveroscillatie aandrijft en stel vervolgens de oscillatiefrequentie in op negatief 5%, iets lager dan de residentiefrequentie. Voer nu een automatische frequentie-afstemming uit en null de fase van de oscillatie. Laat het systeem ongeveer een uur thermisch evenwicht bereiken voordat u begint met beeldvorming, om drift te voorkomen.Wanneer u klaar bent om te beginnen met beeldvorming, stelt u in het hoofdpaneel van de software een beschermende setpoint in en bereidt u zich voor om de tip naar het monsteroppervlak te laten naderen door Engage te selecteren. Laat de voorste wiel van de AFM-kop handmatig zakken totdat de beschermende instelling, of setpoint, is bereikt. Laat vervolgens het voorste wiel voorzichtig verder zakken totdat het Z-sensor signaal volledig naar links is uitgebreid.Activeer de trillingsoscillatietafel en sluit de akoestische isolatiebehuizing. Verlaag vervolgens het setpoint in de AFM-software met behulp van het hamsterwiel om de AFM-tip fijn op het monster te engageren. Om tapping-mode-beeldvorming in het afstotende regime uit te voeren, verlaagt u het setpoint totdat het fasesignaal iets lager is dan de vrije niveaufase.Begin vervolgens met het scannen van het monster. Gebruik de scansnelheid van 2,5 micrometer per seconde in beeldoppervlakken van vier micrometer bij vier micrometer of acht micrometer bij acht micrometer vierkanten met pixelresoluties van 2.048 of 4.096, respectievelijk;en druk op de knop Do Scan. Selecteer relevante eiwit-DNA-complexen vooraf door directe visuele inspectie van de beelden in de AFM-software.Voor XPD-monsters omvatten mogelijke complexen XPD p44 DNA, evenals XPD DNA en p44 DNA met duidelijk verschillende grootten vanwege de verschillende moleculaire massa's van XPD en p44. Meet volumes van individuele eiwitpieken op het DNA door het sectiegereedschap in het analysevenster te gebruiken om de hoogte en diameter van de eiwitpieksecties met de sectievensterscursors te meten. Gebruik deze waarden om het volume van de pieken te bepalen met behulp van eenvoudige wiskundige modellen om het complextype te verifiëren.</

atomic-force-microscopy-investigations-dna-lesion-recognition

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om S-fase cellen efficiënt te identificeren voor downstream microscopiestudies, zoals het meten van DNA-reparatie eiwitrekrutering door lasermicrobestraling.

Laser micro-bestraling om DNA-rekrutering tijdens de S-fase te bestuderen

Dit werk geeft een eenvoudige en visuele methode om multi-nucleotide polymorfismen detecteren op een pneumatische druppel manipulatie platform. Met de voorgestelde werkwijze, het gehele experiment, met inbegrip druppeltje manipulatie en detectie van multi-nucleotide polymorfismen dergelijke kunnen bij 23 ° C zonder behulp van geavanceerde instrumenten.

De Visual Colorimetrische Detectie van Multi-nucleotide polymorphisms op een pneumatische Droplet Manipulation Platform

Drosophila oogenese blijft uitzonderlijk nuttig in de studie van mitochondriale proliferatie en overerving. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om het replicerende mitochondriale DNA (mtDNA) in Drosophila volwassen eierstokken te labelen met 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), wat het mogelijk maakt om mechanismen te ontdekken die geassocieerd zijn met mitochondriale overerving die voorheen discutabel waren.

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

Ontdek hoe atoomkrachtmicroscopie DNA-letselherkenning door reparatie-eiwitten in kaart brengt. Deze methode visualiseert eiwit-DNA-interacties en onderscheidt complexen in nucleotide excisiereparatie.

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Meer video's verkennen