Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair
24 mei 2017
Hier wordt de studie van verschillende DNA-letselsherkenningsbenaderingen via enkele molecuul AFM-beeldvorming gedemonstreerd met het nucleotide-excisiereparatiesysteem als voorbeeld. De procedures van DNA- en eiwitmonstervoorbereidingen en experimentele evenals analytische details voor de AFM-experimenten worden beschreven.
Het algemene doel van dit atoomkrachtmicroscopie-experiment is om interacties van DNA-reparatie-eiwitten met schadeplaatsen in DNA op te lossen en om onderscheid te maken tussen verschillende DNA-interacties door verschillende eiwitcomplexen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het DNA-reparatiegebied, zoals hoe een bepaald DNA-reparatiesysteem de herkenning van zijn doellessies in het DNA bereikt. Het grote voordeel van deze techniek is dat we de verschillende soorten complexen die betrokken zijn bij het proces van DNA-letselherkenning direct kunnen zien en analyseren.
Nicolas Wirth, die deze aanpak tijdens zijn bacheloronderzoek heeft gebruikt, zal de procedure demonstreren. Om te beginnen, bereid een geschikt DNA-substraat voor door een enkelstrengs DNA-hiaat in een plasmide te genereren. Vul het hiaat opnieuw met gemodificeerde, enkelstrengs DNA-oligonucleotiden en linealiseer ten slotte het plasma-DNA met behulp van geschikte restrictie-enzymen.
Voor deze experimenten zijn de dubbelstrengs DNA-substraten ongeveer 1.000 basenparen lang en bevatten ze een DNA-lesie evenals een ongepaarde regio die een DNA-bubbel wordt genoemd voor eiwitbelasting op het DNA. Bereid vervolgens een eiwit-DNA-monster voor AFM-analyse door eerst 10x Reactiebuffer en water in een microreactiebuisje te pipetteren. Voeg vervolgens het DNA en de onderzochte eiwitten toe.
Hier bijvoorbeeld 100 nanomolar van het DNA-monster en één micromolar van elk van de eukaryote nucleotide-excisiereparatie-eiwitten XPD en p44. Bewerk daarna de reactie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een warmteblok. Na de incubatie, draai het monster kort door.
Bereid vervolgens een mica-substraat voor om het monster op te plaatsen. Gebruik een scalpel om een stukje mica van één centimeter bij één centimeter uit een grotere strip te snijden. Gebruik vervolgens een stukje plakband om de bovenste lagen van de mica te verwijderen om een schone, platte, anatomisch gladde substraatoppervlakte te onthullen.
Verdun het eiwit-DNA-monster vijftig- tot honderdvoudig in AFM-depositionsbuffer en deponeer onmiddellijk 20 microliters van het verdunde monster op het mica-oppervlak. De verdunningsfactor hangt af van de monsterconcentratie. Onmiddellijk na het deponeren van het monster op het mica-oppervlak, spoelt u het monster drie tot vier keer met enkele milliliters gefilterd, gedeïoniseerd water en dekt u overtollig vocht af.
Gebruik een zachte stroom stikstof om het monster te drogen. Bevestig tenslotte het monster aan de randen met plakband op een microscoopglasplaat. Plaats het monster in het midden van de AFM-standaard en bevestig de microscoopglasplaat met magnetische kussens op de standaard.
Steek vervolgens de AFM-tip in de tiphouder. Bevestig de tip in de houder onder een klem door de schroef vast te draaien zodat deze vingerswijd is. Eenmaal bevestigd, breng de tiphouder in de AFM-meetkop.
Gebruik de positioneringsschroeven om het monster in een centrale positie te brengen. Plaats de AFM-meetkop bovenop het monster en zorg ervoor dat de kop stabiel staat met zijn poten in de inkepingen van de standaard. Richt vervolgens de AFM-laser op de achterkant van de cantilever voor optimale signaalsterkte.
Bekijk het reflectiesignaal in het AFM-videovenster om de laser grof te positioneren. Voor dit AFM-model, draai aan de wielen aan de rechterkant en achterkant van de AFM-meetkop om de X- en Y-posities van de AFM-laser aan te passen om deze centraal op het uiteinde van de cantilever te richten. Optimaliseer vervolgens het detector-somsignaal door de laserpositie fijn af te stellen met de twee wielen.
Richt de AFM-laserreflectie op het centrum van de detector door het verschil van de bovenste en onderste diodes van de detectorarray op nul te zetten. Voor deze stap, draai de schroef aan de linkerkant van de meetkop voor dit AFM-model. Bepaal vervolgens de cantilever-residentiefrequentie door naar het masterpaneel-afstemmingsvenster in de software te gaan.
Kies een amplitude die overeenkomt met een ingang van één volt voor de Piezo die de cantileveroscillatie aandrijft en stel vervolgens de oscillatiefrequentie in op negatief 5%, iets lager dan de residentiefrequentie. Voer nu een automatische frequentie-afstemming uit en null de fase van de oscillatie. Laat het systeem ongeveer een uur thermisch evenwicht bereiken voordat u begint met beeldvorming, om drift te voorkomen.
Wanneer u klaar bent om te beginnen met beeldvorming, stelt u in het hoofdpaneel van de software een beschermende setpoint in en bereidt u zich voor om de tip naar het monsteroppervlak te laten naderen door Engage te selecteren. Laat de voorste wiel van de AFM-kop handmatig zakken totdat de beschermende instelling, of setpoint, is bereikt. Laat vervolgens het voorste wiel voorzichtig verder zakken totdat het Z-sensor signaal volledig naar links is uitgebreid.
Activeer de trillingsoscillatietafel en sluit de akoestische isolatiebehuizing. Verlaag vervolgens het setpoint in de AFM-software met behulp van het hamsterwiel om de AFM-tip fijn op het monster te engageren. Om tapping-mode-beeldvorming in het afstotende regime uit te voeren, verlaagt u het setpoint totdat het fasesignaal iets lager is dan de vrije niveaufase.
Begin vervolgens met het scannen van het monster. Gebruik de scansnelheid van 2,5 micrometer per seconde in beeldoppervlakken van vier micrometer bij vier micrometer of acht micrometer bij acht micrometer vierkanten met pixelresoluties van 2.048 of 4.096, respectievelijk;en druk op de knop Do Scan. Selecteer relevante eiwit-DNA-complexen vooraf door directe visuele inspectie van de beelden in de AFM-software.
Voor XPD-monsters omvatten mogelijke complexen XPD p44 DNA, evenals XPD DNA en p44 DNA met duidelijk verschillende grootten vanwege de verschillende moleculaire massa's van XPD en p44. Meet volumes van individuele eiwitpieken op het DNA door het sectiegereedschap in het analysevenster te gebruiken om de hoogte en diameter van de eiwitpieksecties met de sectievensterscursors te meten. Gebruik deze waarden om het volume van de pieken te bepalen met behulp van eenvoudige wiskundige modellen om het complextype te verifiëren.</
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert het gebruik van atoomkrachtmicroscopie (AFM) om de herkenning van DNA-laesies door reparatie-eiwitten te onderzoeken. De focus ligt op het nucleotide-excisie-reparatiesysteem, waarbij de monstervoorbereiding en experimentele procedures gedetailleerd worden beschreven.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- DNA-reparatiemechanismen
- atoomkrachtmicroscopie
- proteïne-DNA-interacties
Achtergrond
- Het begrijpen van de herkenning van DNA-schade is essentieel voor inzicht in reparatieprocessen.
- Atomic force microscopy maakt de visualisatie van moleculaire interacties mogelijk.
- Het nucleotide-excisie-reparatiesysteem dient als model voor het bestuderen van deze interacties.
- Single-molecule technieken leveren gedetailleerde informatie over de vorming van complexen.
Doel van de studie
- Om interacties tussen DNA-reparatie-eiwitten en beschadigd DNA op te lossen.
- Om onderscheid te maken tussen verschillende DNA-interacties die worden gemedieerd door diverse eiwitcomplexen.
- Om het begrip van letselherkenning in DNA-reparatiesystemen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een enkelstrengs DNA-substraat met een gap.
- Het opvullen van de gap met gemodificeerde enkelstrengs DNA-oligonucleotiden.
- Linearisatie van plasmid-DNA met behulp van restrictie-enzymen.
- Gebruik van atoomkrachtmicroscopie om eiwit-DNA-interacties te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van DNA-reparatie-eiwitcomplexen op plaatsen van beschadiging.
- Identificatie van verschillende typen interacties tussen eiwitten en DNA-laesies.
- Inzichten in de mechanismen van laesieherkenning door het nucleotide-excisie-reparatiesysteem.
- Demonstratie van de effectiviteit van AFM bij het bestuderen van moleculaire interacties.
Conclusies
- De studie biedt een nieuwe benadering voor het begrijpen van DNA-reparatiemechanismen.
- Atoomkrachtmicroscopie is een krachtige tool voor het analyseren van eiwit-DNA-interacties.
- De bevindingen dragen bij aan de bredere kennis van processen voor de herkenning van DNA-schade.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
atoomkrachtmicroscopie maakt directe visualisatie van eiwit-DNA-interacties mogelijk met resolutie op enkelvoudig molecuulniveau, wat bijdraagt aan de validatie van targets in DNA-reparatiepaden. Deze benadering biedt mechanistische inzichten in strategieën voor laesieherkenning, wat helpt bij het verminderen van risico's bij therapeutische targets die betrokken zijn bij genomische stabiliteit. De methode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door functionele complexen en hun bindingsvoorkeuren op beschadigd DNA te onderscheiden.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het visualiseren van specifieke eiwit-DNA-complexformaties op de plaatsen van beschadigingen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het onderscheiden van functionele versus niet-functionele herstelcomplexen.
- Wetenschappelijke waarde: Verduidelijkt padspecifieke herkenningsmechanismen, wat het vertrouwen in targets verhoogt bij oncologische targets gerelateerd aan NER.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Operationele waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare beelduitvoer voor kwantitatieve beoordeling van proteïnebindingsdynamiek.
- Operationele waarde: Maakt assay-gereedheid mogelijk door heterogene complexen in één monster op te lossen, wat comparatieve screening faciliteert.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbaar platform voor het evalueren van compound-effecten op interacties tussen DNA-reparatieproteïnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Waarde: Biedt ziekterelevante systeeminzichten door strategieën voor laesieherkenning te koppelen aan de reparatie-efficiëntie in prokaryotische en eukaryotische NER.
- Translationele Waarde: Ondersteunt preklinische continuïteit door visualisatie van target engagement over soortspecifieke reparatiemechanismen mogelijk te maken.
- Translationele Waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling via directe observatie van laesiespecifieke bindingspatronen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door directe visualisatie van target engagement te bieden, wat de lead-identificatie ondersteunt via mechanistische de-risking van DNA-reparatietargets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests door het onderscheiden van strategieën voor laesieherkenning op basis van eiwitpositionering en complexvorming.
- Screening: Levert kwantitatieve resultaten via metingen van complexvolume en -hoogte, waardoor vergelijking van bindingsaffiniteiten en stoichiometrie mogelijk wordt.
- Analytics: Genereert structurele read-outs zoals distributies van bindingsposities en laesiespecifieke piekformatie, wat bijdraagt aan de mechanistische interpretatie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt fundamentele ontdekkingen met preklinische validatie door het onthullen van geconserveerde en divergerende herkenningsmechanismen binnen NER-systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare imaging-capaciteit die toepasbaar is op replicatie, transcriptie en andere eiwit-DNA-systemen buiten DNA-herstel.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door mechanistische ambiguïteit in paden voor laesieherkenning op te lossen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde protocollen voor monstervoorbereiding en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door direct bewijs te leveren van target-interactie en complexe functionaliteit.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde mechanismen voor laesieherkenning.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, het ontwerp van DNA-substraten en de bediening van AFM.
- Afhankelijk van toegang tot AFM-instrumentatie met tapping-mode mogelijkheden en analytische software voor volume- en hoogtemetingen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor procedures voor monsterdepositie, spoelen en drogen om de consistentie van de gegevens te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar verschillende eiwit-DNA-systemen, met name wat betreft buffercompatibiliteit en oppervlaktebindingscondities.
- Beperkt door de noodzaak van zeer zuivere monsters om verstorende signalen bij de interpretatie van complexe mengsels te voorkomen.
