Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van

Het doel van deze procedure is het bepalen van de activiteit van cytochroom P450's, of CYP's, in gekweekte cellen. CYP's zijn sleutelenzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van geneesmiddelen en toxische stoffen, en hun expressie blijft in vitro vaak niet behouden. De normale expressie van CYP-enzymen gaat vaak verloren wanneer cellen in vitro worden gekweekt.

Daarom zijn veel in vitro modellen potentieel beperkt in hun relevantie voor het begrijpen van het metabolisme van geneesmiddelen en toxische stoffen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de eenvoud bij het beoordelen van de CYP-activiteit in gekweekte cellen. Met behulp van probesubstraten en inhibitoren worden verschillende kwantificeringsplatforms gepresenteerd, waaronder massaspectrometrie.

Begin met het verkrijgen van cryovials met cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Het verstrekte protocol gebruikt een hepatische cellijn als voorbeeld. Open onder steriele omstandigheden voorzichtig de cryovial om eventuele overdruk te laten ontsnappen en pipetteer vervolgens de inhoud van de cryovial in een buis van 10 milliliter gevuld met negen milliliter voorverwarmd Williams'E-medium bij 37 graden Celsius.

Centrifugeer de oplossing gedurende 10 minuten bij 400 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vijf milliliter eigen ontdooimedium, voorverwarmd tot 37 °C en aangevuld met glutamine. Nadat de levensvatbare cellen zijn geteld zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de cellen gezaaid in een 24-well collageen-gecoate plaat met een dichtheid van 60.000 levensvatbare cellen per well en een eindvolume van 0,5 milliliter ontdooimedium.

Na enkele dagen in cultuur vormen de cellen een subconfluente trabeculaire structuur. De optimale metabole activiteit wordt doorgaans waargenomen tussen dag zeven en 10, en is het laagst op dag vier. Gebruik voor het voorbereiden van de gedifferentieerde luchtwagepitheelculturen commercieel verkrijgbaar, volledig gedifferentieerd primair luchtwagepitheel dat is gegroeid op de lucht-vloeistofinterface op een insert.

Verwijder met een steriele pincet voorzichtig de celinsert uit de agarose-matrix en breng deze over naar de nieuwe plaat die vooraf is gevuld met 700 µL van het eigen culturemedium. Beoordeel de integriteit van het luchtwegweefsel met methoden die in het tekstprotocol worden vermeld, zoals de transepitheliale weerstand of de ciliaire slagfrequentie. Bereid vóór het experiment twee series celinserts voor de luchtwegcellen en wells voor de hepatische cellen voor, met minimaal drie replica's.

Gebruik één serie voor het inhibitie-experiment en de andere uitsluitend voor de metabole probe. Bereid een derde serie cellen voor als medium-blank controle. Vervang op de dag van het experiment het celkweekmedium door 450 µL vers medium.

Voeg 50 µL medium met de 10x CYP-remmer toe aan de reeks cellen die zijn voorbereid voor het inhibitie-experiment en pre-incubeer gedurende 30 minuten. Vervang vervolgens het medium in de inhibitiereeks door 450 µL vers medium en voeg 50 µL medium toe dat zowel de 10x CYP-remmer als het 10x probesubstraat bevat. Voeg 50 µL medium met het 10x probesubstraat toe aan de overige cellen en voeg daarna een equivalente hoeveelheid vehicle, verdund in medium, toe aan de blanco celcontroles.

Na het incuberen van de cellen gedurende nul tot vijf minuten voor tijdstip één, de nul-achtergrondcontrole, wordt het medium verzameld in afzonderlijk gelabelde buisjes en wordt het medium ingevroren voor verdere verwerking. Incubeer vervolgens de cellen van tijdstip twee gedurende 16 uur in de celincubator. Aan het einde van de incubatieperiode wordt het medium met dezelfde methode verzameld voor kwantificering van het metabolische product.

Breng 250 µL incubatiemedium over naar een 1,5 ml microbuisje en voeg een stockoplossing van de 4-methylumbelliferon-interne standaard toe tot een eindconcentratie van 100 nM is bereikt. Stel de pH van het medium in op een waarde tussen 4,5 en 5,0 door 1 M HCl toe te voegen, één µL per keer. Verifieer de pH door 2 tot 10 µL medium op een pH-strip te pipetteren en voeg vervolgens 150 units betaglucuronidase arylsulfatase van Helix pamatia toe.

Na een incubatie van één uur bij 37 °C wordt de reactie gestopt door het toevoegen van 250 µL koud methanol. Verdamp het oplosmiddel met behulp van een vacuümcentrifuge bij 45 °C. Reconstitueer de monsters met 500 µL van een oplossing van 30% acetonitril in water.

Voor kwantificering op basis van massaspectrometrie voegt u 250 µL van elke seriële verdunningsstandaard toe aan een amberkleurig glazen vial voor ultra-performance vloeistofchromatografie voor injectie in de UPLC-MS autosampler. Voeg ook de testmonsters toe aan amberkleurige UPLC-vials en plaats deze in de UPLC-autosampler. Nadat alle vials zijn gerandomiseerd, voert u de UPLC-MS uit met de instellingen zoals beschreven in het tekstprotocol, afhankelijk van de specifieke probe die gekwantificeerd moet worden.

Gebruik de tool Quantitate, Build Quantitation Method in de kwantificatie-instrumenten van de massaspectrometer om de kalibratiecurve te genereren op basis van de verkregen synthetische standaard en interne standaard, en gebruik vervolgens de Quantitation Wizard om de monsterbatch en de te kwantificeren monsters te selecteren en de kwantificatiemethode uit te voeren. Om CYP1A1 en CYP1B1 te induceren, dient de plaatindeling uit het tekstprotocol te worden gebruikt. Incubeer de cellen die bestemd zijn voor inductie gedurende een periode van 72 uur in medium met een eindconcentratie van 10 nanomolar TCDD.

Verwijder na deze periode het medium, spoel de wells drie keer met PBS en voeg vers medium toe. Voordat de cellen worden geïncubeerd met de luminogene reporterprobe, dient de aangewezen subset van geïnduceerde cellen 30 minuten te worden gepreïncubeerd met de CYP1A1, CYP1B1-remmer in medium. Voeg de luminogene probe, luciferin 6'chloroethyl ether, toe aan de niet-geïnduceerde, geïnduceerde en geïnduceerde cellen met remmer tot een eindconcentratie van 50 micromolar.

Incubeer gedurende vier uur en breng vervolgens 25 µL kweekmedium over naar een witte, ondoorzichtige 96-wells plaat en voeg 25 µL van het door de fabrikant geleverde luciferingdetectiereagens toe. Na incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur wordt de plaat onmiddellijk uitgelezen met een luminometer. De relatieve luminescentie die wordt gegenereerd door de dealkylering van lucifering 6'chloorethyl-ether, gekatalyseerd door CYP1A1 en CYP1B1, wordt hier gepresenteerd.

Het voorbeeld laat geen enzymactiviteit zien in afwezigheid van TCDD-inductie. Na TCDD-inductie wordt CYP1A1- en CYP1B1-activiteit waargenomen in zowel de hepatische als de respiratoire celtypen. Ten slotte vermindert of elimineert de toevoeging van de CYP1A1- en CYP1B1-remmer alfa-naftoflavon de CYP-activiteit.

Om de CYP2A6- en 2A13-activiteit in hepatische celtypen en celtypen van de luchtwegen te beoordelen, werd de hoeveelheid 7-hydroxycoumarine die door hydroxylering van coumarine door het enzym werd geproduceerd, gemeten met UPLC LC-MS. Bij nul minuten incubatie met coumarine wordt alleen achtergrondruis gedetecteerd. Na 16 uur wordt hydroxylering van coumarine waargenomen met de vorming van 7-hydroxycoumarine in de twee celtypen.

Ten slotte voorkomt de toevoeging van de CYP2A, 2A13-remmer de vorming van 7-hydroxycoumarine. Zodra de methode onder de knie is, kunnen de incubatie van de probe en de kwantificatie van deze techniek in de meeste gevallen binnen enkele uren tot maximaal één dag worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het uitvoeren van verschillende fase 1-metabolisme-assays met verschillende celtypen, waarbij de specificiteit van het enzym wordt bevestigd door middel van remming en/of inductie indien nodig.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat verschillende celtypen langere incubatietijden kunnen vereisen, en het is essentieel om een celtype op te nemen dat als positieve controle kan dienen. Vergeet niet dat het werken met TCDD extreem gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van volledige persoonlijke beschermingsmiddelen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het gebruik van geschikte in vitro-modellen voor de preklinische evaluatie van nieuwe geneesmiddelen en de risicobeoordeling van chemicaliën en ingrediënten die worden gebruikt in consumentenproducten.