Name: Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van In Vitro Cell Cultures (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer hoe u CYP-activiteit beoordeelt in gekweekte cellen met behulp van massaspectrometrie en luminogene probes. Deze methode verbetert de relevantie van in vitro-modellen voor farmacologisch en toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Epithelix Sarl en Biopredic International voor het verstrekken van de luchtwegcellen en de micrografieën van de levercellen en Neil Smith voor de figuur die de experimentele procedure illustreert.

<ol><li>Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Canton%2C+C+%22Encyclopedia+of+Drug+Metabolism+and+Interactions%22">Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions</a>. , 1-31 (2016).</li>
<li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li>
<li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((57+varieties%3A+the+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li>
<li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+drug+metabolizing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ+Palacky%22%5BJournal%5D)">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).</li>
<li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li>
<li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li>
<li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hepatoma+HepaRG+cells%3A+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li>
<li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+%28MucilAir%29+to+assess+respiratory+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li>
<li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li>
<li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li>
<li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism%3A+substrates+and+inhibitors+in+vitro%2C+in+vivo+and+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li>
<li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li>
<li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li>
<li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism%3A+a+clinical+probe+for+P450+2E1%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li>
<li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver%2C+Helix+pomatia%2C+and+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li>
<li>Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf">http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf</a> (2013).</li>
<li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+omics+analyses%2C+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25947886">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li>
</ol>

AB en EM waren medewerkers van British American Tobacco op het moment dat dit manuscript werd geschreven. Het werk in dit manuscript beschreven werd gefinancierd door British American Tobacco, en de daaraan verbonden kosten voor deze video-artikel werd betaald door British American Tobacco.

Momenteel zijn veel gestandaardiseerde toxicologische testsystemen gebruiken gemanipuleerde bacteriën, cellijnen, of embryonale cellen die niet representatief zijn voor de normale menselijke stofwisseling 1. Dit kan leiden tot onnauwkeurige voorspellingen van de mogelijke toxische activiteit van een chemische stof of geneesmiddel. Innovatieve in vitro modellen, zoals 3D celculturen en organen op een chip, ontwikkeld in een poging om betere repliceren normale morfologie en metabolische activiteit van menselijke weefsels 21, 22, 23. Metabole competentie is een criterium dat kan worden gebruikt om te ontcijferen welke modellen zijn het best geschikt voor toxicologische evaluatie en geneesmiddelbiotransformatie studies. De techniek die we in dit document zijn beschreven is ontworpen om de activiteit van CYP-enzymen met levende cellen te meten. Het is flexibel en kan worden gebruikt voor verschillende mobiele systemen in 2D of 3D cultures en biedt de mogelijkheid om ofwel een luminogene probe- of een massa-spectrometrie gebaseerde aanpak te gebruiken. Beide methoden zijn gevoelig genoeg om nanogram hoeveelheden materiaal te detecteren en vereisen slechts een klein aantal cellen gekweekt in een multi-well formaat. Ze kunnen ook worden toegepast op bolvormige of cellen gekweekt in complexe matrices. De keuze van het substraat probe is natuurlijk een cruciaal element van het protocol. De specificiteit van de assay berust op de sonde selectief de CYP enzym en een andere laag van zekerheid kan worden verkregen door toepassing van een selectieve remmer van CYP. De substraten en in dit document vermeld remmers zijn slechts een paar voorbeelden, maar anderen kan worden gevonden in de literatuur. Het is belangrijk om meerdere incubatietijden overwegen bij het werken met een nieuw celtype als negatief gevolg CYP activiteit kan worden veroorzaakt door het enzym tot expressie wordt gebracht op een laag niveau. De toevoeging van een celtype dat kan worden toegepast als een positieve controle is het raadzaam om tegen eennegatief resultaat is niet gekoppeld aan een technisch probleem en om te helpen met het oplossen van problemen. Primaire levercellen metabolisch bekwaam en kan worden gebruikt als controle, bijvoorbeeld primaire hepatocyten in suspensie zijn zeer makkelijk te gebruiken maar hun levensvatbaarheid in de tijd beperkt. Hepatische cellijnen zijn mogelijke alternatieven die relatief eenvoudig te gebruiken zoals beschreven in dit protocol, maar sommige zijn beter dan andere wat betreft metabole activiteit 6, 21. Aangezien de bepaling is niet destructief, tenzij totaal eiwit gekwantificeerd, kan men de CYP activiteit in de tijd volgen longitudinale studies 20. Dit is een belangrijk punt, omdat sommige cellen variabele CYP activiteit zal hebben na verloop van tijd in de cultuur. Een negatief resultaat zou kunnen houden met het gebrek aan confluentie voortgang van de differentiatie of dedifferentiatie in vitro. In dat geval is de benadering semi-quantitative aangezien de gegevens niet wordt genormaliseerd door de totale hoeveelheid eiwit in elke cel cultuur. Het is niet altijd mogelijk of aanbevolen om het weefsel opnieuw na meting van de CYP activiteit blootstelling aan probes, remmers of induceerders kan een toxisch effect op het weefsel zoals het geval is voor TCDD. Celfracties zoals microsomen kan ook worden gebruikt om CYP activiteit van een bepaald celtype te karakteriseren. Microsoompreparaten vereisen echter veel celmateriaal, de toevoeging van geschikte cofactoren en buffer zodat de enzymen actief blijven. Met behulp van levende cellen elimineert de lastige microsoomoplossing voorbereiding stap en uit te werken, die buffers en co-factoren het beste werken. Als algemene aanbeveling is een praktische tip om het expressieprofiel van CYPs te karakteriseren in celkweken te controleren of deze overeenkomt met de enzymatische activiteit. Deze extra niveau van controle verdient aanbeveling, gezien het feit dat de metabole probes niet Entirekenen specifiek voor één CYP en geeft beter het vertrouwen dat de gemeten metabole activiteit gelijk is aan de overeenkomstige enzym expressie. Aangezien CYP membraaneiwitten zijn ze relatief moeilijk te bereiden op Western blots derhalve kwantitatieve RT-PCR is de beste methode om deze enzymen 20 profiel zijn. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol beschrijft een werkwijze voor het testen CYP enzymactiviteit dat slechts vertegenwoordigt een familie van metabolische enzymen, zij het een belangrijke. De flexibiliteit van een massaspectrometrie benadering maakt de ontwikkeling van verkrijging werkwijzen voor andere metabolische transformaties van testsubstraten. Echter, die zijn ontwikkeld worden een voor een tijd en er zijn minder bekende specifieke probes en selectieve inhibitoren voor andere metabolische enzymen families. Die kloof moet worden gericht aan zorgen voor een uitgebreide beoordeling van het metabool competentie van in vitro cel systeMevr.

Xenobiotische metabolisme is het proces waarbij chemicaliën lichaamsvreemd worden gemodificeerd door de toevoeging van hydrofiele groepen en de conjugaten hun uitscheiding 1 te vergemakkelijken. Kenmerkend het metabolisme van xenobiotica Twee stappen met fase I voornamelijk bestaande uit een oxidatie onder toevoeging van een of meerdere hydroxylgroepen 1, 2. In fase II worden de hydroxylgroepen gebruikt als acceptoren voor een hydrofiel conjugaat zoals glucuronide of sulfaat groep 1, 2. Als een acceptor groep reeds op de moleculen, kan de conjugatiestap onafhankelijk van fase I metabolisme gebeuren. Elke reactie wordt uitgevoerd door een specifieke groep enzymen, bijvoorbeeld CYP (cytochroom P450), dat de hydroxylering katalyseren (figuur 1) en dealkylering van chemische substraten 3. Conjugation wordt gekatalyseerd door sulfotransferasen, UDP-glucuronosyltransferasen (figuur 1), glutathion-S-transferasen en N-acetyltransferases 4. Elk weefsel en orgaan een specifiek metabolisch enzym expressie profiel, de lever tot expressie meeste van deze eiwitten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figuur 1: Voorbeeld van fase I en fase II metabolisme van Cumarine. CYP2A6 / CYP2A13 katalyseren de 7-hydroxylering van cumarine. 7-hydroxycoumarine is geconjugeerd aan een glucuronidedeel van fase II-enzymen UGTs met UGT1A6 en UGT1A9 die de hoogste activiteit. Inzicht in het metabolisme van xenobiotica is van cruciaal belang bij de evaluatie van de veiligheid van geneesmiddelen en voor de chemische risicobeoordeling om twee redenen: de reactiekinetiek zal bepalen hoe lang een geneesmiddel of chemische stof in het lichaam in een actieve of inactieve vorm b blijftefore uitscheiding; en de uitgangsverbinding kan een reactiever, onstabiele en giftige soorten worden gemodificeerd door metabolische enzymen. Dergelijke reacties ook bekend als &quot;biologische activering&quot; worden voornamelijk te wijten aan fase I CYP-enzymen, maar ook zeldzame gevallen van fase II conjugatie 5. Op basis hiervan werd het vermogen van een in vitro model om het risico van een geneesmiddel of een chemische voorspellen is sterk afhankelijk van de metabole competentie van het celsysteem. Cellijnen afgeleid van zieke weefsels of transformatie van normale cellen verliezen vaak een deel, zo niet alle metabole enzymprofiel representatieve hun weefsel van oorsprong 6. Het handhaven van de normale metabole enzymprofiel lijkt beter primaire celkweken (althans op korte termijn kweken) en wordt verder verbeterd wanneer het weefsel gekweekt in een matrix waardoor het de 3D-structuur 1 te behouden. Daarom is de characterization van de metabole competentie van een in vitro celsysteem is een belangrijke eerste stap bij het geleiden van het beslissen welke celmodel is wenselijk chemische veiligheid evaluaties uit te voeren. In dit artikel presenteren we een protocol om de activiteit en expressie van fase I CYP-enzymen in vitro profiel voorbeelden van de toepassing met een hepatische cellijn 7 en 3D primaire long- celculturen 8. CYP specifieke substraten, hun stofwisselingsproducten en remmer besturingselementen worden beschreven met massa spectrometry- en luminogene-kwantificering methoden. Omdat sommige CYP induceerbaar en constitutief anderen zullen voorbeelden worden gegeven voor de twee scenario.

<table><tbody><tr><td>Reagens &amp; Cellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu;m spuitfilter</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24 wells plaat</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-fenyl pentyne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxybupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxychlorzoxazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-ethoxycoumarine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-hydroxycoumarine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-methoxypsoraleen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>azijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-naftoflavone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glucuronidase/arylsulfatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>chlorzoxasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>collageen</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>coumarine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>disulfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoxamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (Glutamine supplement)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG metabolisme supplement</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG ontdooimedium supplement</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir luchtwegcellen</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>MucilAir luchtwegcellen onderhoudsmedium</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &mu;m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro;m 2.1 x 50 mm</td><td>Waters</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams&rsquo; E medium</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS software</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Analyst 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>luminometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>spectrofotometer</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>celteller</td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>roterende verdamper</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren fase i metabolic competentie van<em&gt; in vitro</em&gt; cell cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Xenobiotische metaboliserende enzymen spelen een sleutelrol bij de biotransformatie van geneesmiddelen en toxische stoffen door het toevoegen van functionele groepen die de oplosbaarheid verhogen en uitscheiding vergemakkelijken. In sommige gevallen deze structurele wijzigingen leiden tot de vorming van nieuwe giftige producten. Met het oog op het verminderen van dierproeven kunnen chemische risico&#39;s worden beoordeeld met behulp metabolisch competente cellen. De expressie van metabolische enzymen is echter niet stabiel in de tijd velen in vitro primaire kweek systemen en vaak gedeeltelijk of afwezig is in cellijnen. Daarom is de studie van geneesmiddelen, additieven en verontreinigingen metabolisme milieu in vitro idealiter uitgevoerd in celsystemen waarbij metabolische activiteit gekarakteriseerd. We leggen hier een aanpak om de activiteit van een klasse van metabolische enzymen (Human Fase I) in 2D cellijnen en primaire 3D culturen te meten met behulp van chemische sondes en hun stofwisselingsproducten kwantificeerbare door UPLC massaspectrometrie enluminometrie. De werkwijze kan worden toegepast om de metabole activiteit te testen in cellijnen en primaire cellen afkomstig uit verschillende weefsels.

Voorbeelden van metabolische activiteit gemeten voor twee paren CYP (CYP1A1 / 1B1 en CYP2A6 / 2A13) in de luchtweg celcultures van drie verschillende donoren (luchtweg M360, M370, M417) en de hepatische cellijn (Hep lijn) getoond in figuur 6 20. CYP activiteit gemeten door luminometrie Figuur 6A toont de relatieve luminescentie geproduceerd door CYP1A1 / 1B1 O-dealkyleringsactiviteit van Luc-CEE (luciferine 6&#39;-chloorethylether) in de luchtwegen cellen (3 donoren) en levercellen met en zonder inductie TCDD. CYP1A1 / 1B1 zeer induceerbaar enzymen en worden meestal niet tot expressie op constitutieve niveau in de meeste weefsels. Zoals te zien is in figuur 6A, is er geen luminogene signaal gedetecteerd wanneer de cellen niet worden geïnduceerd. Wanneer beide celtypen gepreïncubeerd met TCDD, een sterke CYP1A1 / 1B1 inductor, een merked luminogene signaal wordt waargenomen vergeleken met de controlegroep (figuur 6A). Dit betekent dat de Luc-CEE sonde leidende gemetaboliseerd om de vrijlating van de luciferine rest die vervolgens wordt gekwantificeerd. De algehele werking van de TCDD behandelde hepatische cellijn lager dan de luchtweg cellen, zelfs na een totale proteïne normalisatie. Dit is niet ongebruikelijk omdat cellijnen zijn vaak minder metabolisch actief zijn dan primaire cellen. Toevoeging van α-naftoflavon een duidelijk remmend effect op CYP1A1 / 1B1 activiteit in alle celtypes die CYP-afhankelijkheid van Luc-CEE metabolisme bevestigt verder. Kwantificering van CYP450 metabolieten gebruik UPLC-MS Figuur 6B illustreert de kwantificering van CYP2A6 / 2A13-activiteit in cellen van de luchtwegen 3 donors (Airway M343, M345, M347) en levercellen (Hep lijn) na incubatie met coumarine bij aanwezigheid en afwezigheid van het inhiBITOR 8-methoxypsoraleen. De gegevens worden genormaliseerd op totaal eiwit. In het coumarine 0 min incubatie control, geen 7-hydroxycoumarine gedetecteerd (Figuur 6B). CYP2A6 / 2A13 wordt constitutief tot expressie in bepaalde weefsels en derhalve na 16 uur incubatie met cumarine vorming van 7-hydroxycoumarine wordt gedetecteerd in verschillende celtypes getest, zelfs zonder inductie. Wanneer 8-methoxypsoraleen is een CYP2A-remmer toegevoegd (figuur 6B), wordt de vorming van 7-hydroxycoumarine aanzienlijk verminderd. Opgemerkt dient te worden dat in de aanwezigheid van de CYP-remmer, is het normaal om nog op te sporen enkele resterende activiteit als remming is zelden compleet en aangezien andere CYP misschien ook in staat zijn om de ondergrond te herkennen, maar het verwerken van het veel minder efficiënt. Ook kan worden opgemerkt dat de opgenomen metabole activiteit tussen verschillende donoren kunnen bij het gebruik van primaire cellen is toegankelijk voor CYP2A6 in de luchtwegen cellen(Figuur 6B). Dit zal naar verwachting als CYP activiteit is onderhevig aan genotype en polymorfismen van elke donor. <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figuur 6: Activity Assay Resultaat CYP1A1 / 1B1 activiteit (A) en CYP2A6 / 2A13 activiteit (B) in de lever cellijn en drie Airway celdonoren (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE dealkyleringsactiviteit weergegeven met en zonder inductie van CYP1A1 / 1B1 van TCDD. α-naftoflavon werd als CYP1A1 / 1B1 remmer. Activiteit wordt uitgedrukt als relatieve luminescentie-eenheden (RLU) genormaliseerd door incubatie tijd in minuten (min) en totaal eiwit (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 geen inductie nodig omdat ze constitutief tot expressie worden gebracht. Cumarine 7-hydroxylering activiteit in pmol / min / mg eiwit wordt getoond op verschillende tijdstippen met en zonder inhibitor 8-methoxypsoralen. Alle resultaten worden weergegeven als een gemiddelde van drie onafhankelijke metingen met standaardafwijkingen van het gemiddelde. Dit cijfer werd gewijzigd van 20 Baxter. Aanvullende Tabel 1: UPLC and Mass Spectrometer instellingen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Metabole competentie van in vitro systemen is een belangrijke voorwaarde voor de biotransformatie en dispositie van drugs en toxische stoffen. In dit protocol beschrijven we de toepassing van referentie- metabole probes fase I metabolisme in celkweken beoordelen.

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Het doel van deze procedure is het bepalen van de activiteit van cytochroom P450's, of CYP's, in gekweekte cellen. CYP's zijn sleutelenzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van geneesmiddelen en toxische stoffen, en hun expressie blijft in vitro vaak niet behouden. De normale expressie van CYP-enzymen gaat vaak verloren wanneer cellen in vitro worden gekweekt.Daarom zijn veel in vitro modellen potentieel beperkt in hun relevantie voor het begrijpen van het metabolisme van geneesmiddelen en toxische stoffen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de eenvoud bij het beoordelen van de CYP-activiteit in gekweekte cellen. Met behulp van probesubstraten en inhibitoren worden verschillende kwantificeringsplatforms gepresenteerd, waaronder massaspectrometrie.Begin met het verkrijgen van cryovials met cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Het verstrekte protocol gebruikt een hepatische cellijn als voorbeeld. Open onder steriele omstandigheden voorzichtig de cryovial om eventuele overdruk te laten ontsnappen en pipetteer vervolgens de inhoud van de cryovial in een buis van 10 milliliter gevuld met negen milliliter voorverwarmd Williams'E-medium bij 37 graden Celsius.Centrifugeer de oplossing gedurende 10 minuten bij 400 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in vijf milliliter eigen ontdooimedium, voorverwarmd tot 37 °C en aangevuld met glutamine. Nadat de levensvatbare cellen zijn geteld zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de cellen gezaaid in een 24-well collageen-gecoate plaat met een dichtheid van 60.000 levensvatbare cellen per well en een eindvolume van 0,5 milliliter ontdooimedium.Na enkele dagen in cultuur vormen de cellen een subconfluente trabeculaire structuur. De optimale metabole activiteit wordt doorgaans waargenomen tussen dag zeven en 10, en is het laagst op dag vier. Gebruik voor het voorbereiden van de gedifferentieerde luchtwagepitheelculturen commercieel verkrijgbaar, volledig gedifferentieerd primair luchtwagepitheel dat is gegroeid op de lucht-vloeistofinterface op een insert.Verwijder met een steriele pincet voorzichtig de celinsert uit de agarose-matrix en breng deze over naar de nieuwe plaat die vooraf is gevuld met 700 µL van het eigen culturemedium. Beoordeel de integriteit van het luchtwegweefsel met methoden die in het tekstprotocol worden vermeld, zoals de transepitheliale weerstand of de ciliaire slagfrequentie. Bereid vóór het experiment twee series celinserts voor de luchtwegcellen en wells voor de hepatische cellen voor, met minimaal drie replica's.Gebruik één serie voor het inhibitie-experiment en de andere uitsluitend voor de metabole probe. Bereid een derde serie cellen voor als medium-blank controle. Vervang op de dag van het experiment het celkweekmedium door 450 µL vers medium.Voeg 50 µL medium met de 10x CYP-remmer toe aan de reeks cellen die zijn voorbereid voor het inhibitie-experiment en pre-incubeer gedurende 30 minuten. Vervang vervolgens het medium in de inhibitiereeks door 450 µL vers medium en voeg 50 µL medium toe dat zowel de 10x CYP-remmer als het 10x probesubstraat bevat. Voeg 50 µL medium met het 10x probesubstraat toe aan de overige cellen en voeg daarna een equivalente hoeveelheid vehicle, verdund in medium, toe aan de blanco celcontroles.Na het incuberen van de cellen gedurende nul tot vijf minuten voor tijdstip één, de nul-achtergrondcontrole, wordt het medium verzameld in afzonderlijk gelabelde buisjes en wordt het medium ingevroren voor verdere verwerking. Incubeer vervolgens de cellen van tijdstip twee gedurende 16 uur in de celincubator. Aan het einde van de incubatieperiode wordt het medium met dezelfde methode verzameld voor kwantificering van het metabolische product.Breng 250 µL incubatiemedium over naar een 1,5 ml microbuisje en voeg een stockoplossing van de 4-methylumbelliferon-interne standaard toe tot een eindconcentratie van 100 nM is bereikt. Stel de pH van het medium in op een waarde tussen 4,5 en 5,0 door 1 M HCl toe te voegen, één µL per keer. Verifieer de pH door 2 tot 10 µL medium op een pH-strip te pipetteren en voeg vervolgens 150 units betaglucuronidase arylsulfatase van Helix pamatia toe.Na een incubatie van één uur bij 37 °C wordt de reactie gestopt door het toevoegen van 250 µL koud methanol. Verdamp het oplosmiddel met behulp van een vacuümcentrifuge bij 45 °C. Reconstitueer de monsters met 500 µL van een oplossing van 30% acetonitril in water.Voor kwantificering op basis van massaspectrometrie voegt u 250 µL van elke seriële verdunningsstandaard toe aan een amberkleurig glazen vial voor ultra-performance vloeistofchromatografie voor injectie in de UPLC-MS autosampler. Voeg ook de testmonsters toe aan amberkleurige UPLC-vials en plaats deze in de UPLC-autosampler. Nadat alle vials zijn gerandomiseerd, voert u de UPLC-MS uit met de instellingen zoals beschreven in het tekstprotocol, afhankelijk van de specifieke probe die gekwantificeerd moet worden.Gebruik de tool Quantitate, Build Quantitation Method in de kwantificatie-instrumenten van de massaspectrometer om de kalibratiecurve te genereren op basis van de verkregen synthetische standaard en interne standaard, en gebruik vervolgens de Quantitation Wizard om de monsterbatch en de te kwantificeren monsters te selecteren en de kwantificatiemethode uit te voeren. Om CYP1A1 en CYP1B1 te induceren, dient de plaatindeling uit het tekstprotocol te worden gebruikt. Incubeer de cellen die bestemd zijn voor inductie gedurende een periode van 72 uur in medium met een eindconcentratie van 10 nanomolar TCDD.Verwijder na deze periode het medium, spoel de wells drie keer met PBS en voeg vers medium toe. Voordat de cellen worden geïncubeerd met de luminogene reporterprobe, dient de aangewezen subset van geïnduceerde cellen 30 minuten te worden gepreïncubeerd met de CYP1A1, CYP1B1-remmer in medium. Voeg de luminogene probe, luciferin 6'chloroethyl ether, toe aan de niet-geïnduceerde, geïnduceerde en geïnduceerde cellen met remmer tot een eindconcentratie van 50 micromolar.Incubeer gedurende vier uur en breng vervolgens 25 µL kweekmedium over naar een witte, ondoorzichtige 96-wells plaat en voeg 25 µL van het door de fabrikant geleverde luciferingdetectiereagens toe. Na incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur wordt de plaat onmiddellijk uitgelezen met een luminometer. De relatieve luminescentie die wordt gegenereerd door de dealkylering van lucifering 6'chloorethyl-ether, gekatalyseerd door CYP1A1 en CYP1B1, wordt hier gepresenteerd.Het voorbeeld laat geen enzymactiviteit zien in afwezigheid van TCDD-inductie. Na TCDD-inductie wordt CYP1A1- en CYP1B1-activiteit waargenomen in zowel de hepatische als de respiratoire celtypen. Ten slotte vermindert of elimineert de toevoeging van de CYP1A1- en CYP1B1-remmer alfa-naftoflavon de CYP-activiteit.Om de CYP2A6- en 2A13-activiteit in hepatische celtypen en celtypen van de luchtwegen te beoordelen, werd de hoeveelheid 7-hydroxycoumarine die door hydroxylering van coumarine door het enzym werd geproduceerd, gemeten met UPLC LC-MS. Bij nul minuten incubatie met coumarine wordt alleen achtergrondruis gedetecteerd. Na 16 uur wordt hydroxylering van coumarine waargenomen met de vorming van 7-hydroxycoumarine in de twee celtypen.Ten slotte voorkomt de toevoeging van de CYP2A, 2A13-remmer de vorming van 7-hydroxycoumarine. Zodra de methode onder de knie is, kunnen de incubatie van de probe en de kwantificatie van deze techniek in de meeste gevallen binnen enkele uren tot maximaal één dag worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het uitvoeren van verschillende fase 1-metabolisme-assays met verschillende celtypen, waarbij de specificiteit van het enzym wordt bevestigd door middel van remming en/of inductie indien nodig.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat verschillende celtypen langere incubatietijden kunnen vereisen, en het is essentieel om een celtype op te nemen dat als positieve controle kan dienen. Vergeet niet dat het werken met TCDD extreem gevaarlijk kan zijn en dat er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van volledige persoonlijke beschermingsmiddelen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het gebruik van geschikte in vitro-modellen voor de preklinische evaluatie van nieuwe geneesmiddelen en de risicobeoordeling van chemicaliën en ingrediënten die worden gebruikt in consumentenproducten.

mass-spectrometry-luminogenic-based-approaches-to-characterize-phase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

We worden stappen beschreven waarmee snel in situ bemonstering van een klein gedeelte van een afzonderlijke cel met hoge precisie en minimale invasie met behulp van capillaire gebaseerde micro-sampling, ter vergemakkelijking van chemische karakterisering van een momentopname van de metabole activiteit in levende embryo's met behulp van een custom-built eencellige capillaire elektroforese en massaspectrometrie platform.

Microprobe capillaire elektroforese massaspectrometrie voor eencellige metabolomica in Live kikker (Xenopus laevis) embryo 's

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Een geïntegreerde cel manipulatie platform is ontwikkeld voor gebruik in combinatie met een single-probe massaspectrometrie Setup voor de on-line analyse van individuele schorsing cellen onder omgevingsomstandigheden.

Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen

Hier presenteren we een robuust protocol voor het kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij het centrale koolstof-en energiemetabolisme in celvrije eiwitsynthese reacties. Het celvrije synthese mengsel wordt met aniline gekwantificeerd voor effectieve scheiding met behulp van omgekeerde-fase vloeistofchromatografie en vervolgens door massaspectrometrie met behulp van isotopisch gelabelde interne normen.

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Hier presenteren we een protocol om metabolieten in zeldzame celtypen nauwkeurig en betrouwbaar te meten. Technische verbeteringen, waaronder een gemodificeerde mantelvloeistof voor het sorteren van cellen en het genereren van relevante blanco monsters, maken een uitgebreide kwantificering van metabolieten mogelijk met een input van slechts 5000 cellen per monster.

Gerichte metabolomics op zeldzame primaire cellen

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Leer hoe u CYP-activiteit beoordeelt in gekweekte cellen met behulp van massaspectrometrie en luminogene probes. Deze methode verbetert de relevantie van in vitro-modellen voor farmacologisch en toxicologisch onderzoek.

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van In Vitro Cell Cultures (Video) | JoVE Journal

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van

Meer video's verkennen