Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR
27 juni 2017
Hier presenteren we een protocol voor de detectie van microRNA expressie in het peritoneale membraan van de ratten met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie-polymerase kettingreactie. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van het microRNA-expressieprofiel in het peritoneale membraan in verschillende pathologische omstandigheden.
Het algemene doel van deze procedure is om miRNA's in het peritoneale membraan van de rat met succes te zuiveren en te detecteren. Om deze procedure te beginnen, na inhalatieanesthesie met 4% isofluraangebruik. Spuit de buikhuid van de rat met 70% ethanol en monteer deze op het kurkblad, op zijn rug.
Maak vervolgens een longitudinale incisie in de buikhuid, spier en peritoneale membraan van het dier met behulp van schaar en pincetten. Pak het peritoneale membraan op met behulp van de pincetten en maak horizontale incisies in het bovenste gedeelte langs het onderste ribbenbot onder het middenrif. En aan de onderkant in het laterale gebied met behulp van de chirurgische schaar.
Maak vervolgens laterale longitudinale incisies om het peritoneale membraan van het lichaam te verwijderen, met behulp van de chirurgische schaar. Was het vervolgens met PPS in een petrischaal. Snijd 20 milligram peritoneale membraanmonster uit en trim het.
Bij deze procedure plaats je een 20 milligram peritoneale membraanmonster in een glazen homogenisator. En voeg 700 microliter fenol-guanidine-gebaseerde lyse-reagens toe. Homogeniseer vervolgens het peritoneale membraanmonster op ijs, door langzaam een stamper op het monster te drukken met draaiende bewegingen.
Herhaal dit proces enkele tientallen keren, totdat het peritoneale membraanmonster volledig is opgelost in het fenol-guanidine-gebaseerde lyse-reagens. Voor verdere homogenisatie, breng je het gehomogeniseerde lysaat over naar een bio-polymeersnippersysteem in de microcentrifuge-spinkolom in een tweeduizend milliliter verzamelbuisje. Centrifugeer het vervolgens 14.000 keer G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.
Breng vervolgens het gehomogeniseerde lysaat over naar een nieuw microcentrifugebuisje. Voeg 140 microliter chloroform toe aan het gehomogeniseerde lysaat en sluit het buisje stevig. Roer vervolgens het buisje door inversie gedurende 15 seconden.
Incubeer het monster vervolgens twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het vervolgens 12.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Breng 300 microliter van de supernatant over naar een nieuw microcentrifugebuisje, zonder het precipitaat te verstoren.
Voeg vervolgens 450 microliter 100% ethanol toe. Meng vervolgens het monster door het gedurende vijf seconden te vortexen. Pipetteer vervolgens maximaal 700 microliter van het monster in een siliconenmembraangebaseerde spinkolom, geplaatst in een tweeduizendmilliliter verzamelbuisje, en sluit het deksel.
Centrifugeer het vervolgens 15.000 keer G gedurende 15 seconden. Gooi na centrifugatie het doorstromingsmateriaal in het verzamelbuisje weg. Voeg vervolgens 700 microliter wasbuffer 1 toe aan de siliconenmembraangebaseerde spinkolom om het monster nauwkeurig te wassen en sluit het deksel.
Centrifugeer het vervolgens 15.000 keer G gedurende 15 seconden. Gooi na centrifugatie het doorstromingsmateriaal en het verzamelbuisje weg. Voeg 500 microliter wasbuffer 2 toe aan de silicamembraangebaseerde spinkolom om eventuele sporen van zout te verwijderen en sluit het deksel.
Centrifugeer het vervolgens 15.000 keer G gedurende 15 seconden. Gooi na centrifugatie het doorstromingsmateriaal en het verzamelbuisje weg en herhaal deze procedure opnieuw. Centrifugeer vervolgens de silicamembraangebaseerde spinkolom opnieuw gedurende één minuut bij 15.000 keer G.
Na centrifugatie gooi je het verzamelbuisje en eventueel doorstromingsmateriaal weg. Plaats de silicamembraangebaseerde spinkolom in een nieuw, 1,5 milliliter verzamelbuisje. Breng vervolgens 25 microliter RNAse-vrij water op de kolom aan en sluit het deksel.
Laat het monster gedurende vijf minuten op kamertemperatuur staan. Centrifugeer het vervolgens 15.000 keer G gedurende één minuut. Breng vervolgens de 25 microliter alouette met het totale RNA over naar een nieuw microcentrifugebuisje en bewaar het bij min 80 graden Celsius voor gebruik.
Bereid in deze procedure een mastermix-oplossing voor die twee microliter 10x nucleïnezuurmix, twee microliter reverse transcriptasemix en vier microliter 5x Hispec-buffer bevat, voor een totaal van 8 microliter per buisje. Verdeel vervolgens 8 microliter van de mastermix-oplossing in elk buisje. Meet de hoeveelheid van het totale RNA's met behulp van een spectrofotometer.
Voeg vervolgens één microgram van de geïsoleerde totale RNA's, gezuiverd uit het peritoneale membraanmonster, toe aan elk buisje. Voeg vervolgens RNAse-vrij water toe aan elk buisje om het tot een totaal van 20 microliter te brengen. Meng het vervolgens grondig door te pipetteren en centrifugeer het gedurende 15 seconden.
Incubeer vervolgens het monster gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Incubeer het vervolgens gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius. Breng het nieuw gegenereerde cDNA over naar een nieuw microcentrifugebuisje en verdun het 10 keer met RNAse-vrij water.
Bereid in deze procedure een mastermix voor met 12,5 microliter 2x PCR-mastermix, tweeënhalve microliter van vijf micromolar van elk miRNA-primer opgelost in nuclease-vrij water, en 1,25 microliter 10x universele primer, voor elke put. Verdeel 22,5 microliter van deze mastermix in elke put van een 96-puttenplaat. Voeg vervolgens tweeënhalve microliter template-cDNA toe aan elke put.
Versluit de 96-puttenreactieplaat met een stuk folie. Centrifugeer het vervolgens 1.000 keer G gedurende 30 seconden. Zet de plaat in het realtime PCR-instrument om het PCR-cyclusprogramma uit te voeren.
Definieer in de realtime PCR-software de experimentele eigenschappen. Wijs vervolgens namen toe aan de monsters en doel-miRNA's in elke put. Voer vervolgens in de realtime PCR-software een reactievolume van 20 microliter in en de volgende PCR-cycluscondities volgens de instructies.
Pre-incubatie bij 95 graden Celsius gedurende
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de detectie van microRNA-expressie in het peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcription polymerasekettingreactie. Het is ontworpen voor het bestuderen van microRNA-expressieprofielen onder verschillende pathologische omstandigheden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- MicroRNA-onderzoek
Achtergrond
- MicroRNA's spelen cruciale rollen in genexpressie.
- Het begrijpen van hun expressie in pathologische omstandigheden is van vitaal belang.
- Het peritoneale membraan van de rat dient als model voor het bestuderen van deze expressies.
- Kwantitatieve real-time PCR is een betrouwbare methode voor detectie.
Doel van het onderzoek
- Om miRNA's in het peritoneale membraan van de rat te zuiveren en te detecteren.
- Om microRNA-expressieprofielen in verschillende omstandigheden te analyseren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in het veld.
Gebruikte methoden
- Inhalatieanesthesie met 4% isofluraan.
- Voorbereiding van het buikgebied met 70% ethanol.
- Chirurgische incisie om toegang te krijgen tot het peritoneale membraan.
- Gebruik van schaar en pincetten voor extractie van het membraan.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle zuivering van miRNA's uit het peritoneale membraan.
- Kwantitatieve detectie van microRNA-expressie bereikt.
- Protocol gevalideerd voor gebruik in verschillende pathologische studies.
- Mogelijke toepassingen in het begrijpen van ziektemechanismen.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van microRNA in rattenmodellen.
- Het biedt inzichten in de rol van microRNA's in pathologie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methodologie voor bredere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR-based detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane enables precise interrogation of gene regulation in disease-relevant tissue models. This workflow supports early discovery teams seeking to validate mechanistic hypotheses and identify translational biomarkers in fibrotic and inflammatory pathologies. Reliable miRNA quantification in preclinical models enhances predictive confidence and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of miRNA-mediated regulatory pathways in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying miRNA changes in response to pathological stimuli.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of miRNA expression between control and disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for miRNA extraction and quantification from tissue samples.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream screening and assay development.
- Establishes assay readiness for evaluating compound effects on miRNA expression profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA expression data with disease-relevant preclinical models for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting mechanistic studies in vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical biomarker validation, supporting both hypothesis testing and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative miRNA profiling clarifies regulatory pathways and supports hypothesis-driven research.
- Screening: Standardized qRT-PCR outputs enable reproducible comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides robust quantitative measurements for statistical analysis of miRNA expression changes.
- Translational Research: Connects molecular findings in animal models to potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for diverse tissue types and disease models, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable miRNA quantification workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and translational biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, RNA handling, and qRT-PCR analysis.
- Needs access to real-time PCR instrumentation and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be necessary for different tissue types or disease models.
- Sample quality and RNA integrity are critical for reliable quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Peritoneum Sample Collection
8:29
Conclusion
8:06
Results: Upregulated miRNAs in the Peritoneal Membrane of Peritoneal Fibrosis Rats
1:54
Purifying Total RNAs from Peritoneal Membrane Samples
5:36
Reverse Transcription of Total RNA
6:44
qRT-PCR of miRNA
