Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR

Het algemene doel van deze procedure is het succesvol zuiveren en detecteren van miRNA's in het peritoneale membraan van de rat. Om met deze procedure te beginnen, wordt de rat onder narcose gebracht via inhalatie met 4% isofluraan. Spuit de buikhuid van de rat in met 70% ethanol en fixeer het dier op de rug op een kurkplaat.

Maak vervolgens met een schaar en een pincet een longitudinale incisie in de abdominale huid, spieren en het peritoneale membraan van het dier. Pak het peritoneale membraan vast met het pincet en maak horizontale incisies aan de bovenzijde langs het onderste ribbenbot onder het diafragma, en aan de onderzijde in de laterale regio met de chirurgische schaar.

Maak vervolgens met de chirurgische schaar laterale longitudinale incisies om het peritoneale membraan uit het lichaam te verwijderen. Was het membraan daarna met PPS in een petrischaal. Snijd een monster van 20 milligram van het peritoneale membraan uit en trim dit.

Plaats in deze procedure een peritoneummembraanmonster van 20 milligram in een glazen homogenisator. Voeg vervolgens 700 microliters lysisreagens op basis van fenolguanidine toe. Homogeniseer daarna het peritoneummembraanmonster op ijs door de stamper langzaam draaiend op het monster te drukken.

Herhaal dit proces enkele tientallen keren, totdat het monster van het peritoneale membraan volledig is opgelost in het lysisreagens op basis van fenolguanidine. Voor verdere homogenisatie wordt het gehomogeniseerde lysaat overgebracht naar een bio-polymeershreddingsysteem in de microcentrifuge-spincolumn in een opvangbuis van 2 mL. Centrifugeer dit vervolgens gedurende drie minuten bij 14,000 ×g bij 4 °C.

Breng vervolgens het gehomogeniseerde lysaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 140 µL chloroform toe aan het gehomogeniseerde lysaat en sluit de buis stevig af. Meng de buis daarna 15 seconden door deze om te keren.

Incubeer het monster vervolgens gedurende twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het daarna 15 minuten bij 12.000 ×g bij vier graden Celsius. Breng 300 µL van het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis, zonder het precipitaat te verstoren.

Voeg vervolgens 450 µL 100% ethanol toe. Meng het monster daarna vijf seconden door te vortexen. Pipetteer vervolgens tot 700 µL van het monster in een spincolumn met een silicone membraan, geplaatst in een opvangbuisje van 2 mL, en sluit de dop.

Centrifugeer dit vervolgens bij 15,000 ×g gedurende 15 seconden. Gooi na centrifugatie het filtraat in het opvangbuisje weg. Voeg daarna 700 µL wasbuffer 1 toe aan de spincolumn met siliciummembraan om het monster grondig te wassen en sluit de dop.

Centrifugeer dit bij 15,000 ×g gedurende 15 seconden. Gooi na centrifugatie het filtraat in het opvangbuisje weg. Voeg 500 µL wasbuffer 2 toe aan de spincolumn op basis van een silica-membraan om alle resten zout te verwijderen, en sluit de dop.

Centrifugeer het vervolgens bij 15.000 ×g gedurende 15 seconden. Gooi na centrifugatie de doorloop en de opvangbuis weg en herhaal deze procedure opnieuw. Centrifugeer daarna de spincolumn op basis van silicamebranen opnieuw bij 15.000 ×g gedurende één minuut.

Gooi na centrifugatie de opvangbuis en alle doorstroomvloeistof weg. Plaats de spinzuil met silicamebraan in een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml. Breng vervolgens 25 µL RNase-vrij water aan op de zuil en sluit de dop.

Laat het monster vijf minuten op kamertemperatuur staan. Centrifugeer het gedurende één minuut bij 15,000 ×g. Draag vervolgens het aliquoot van 25 µL met het totale RNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis en bewaar dit bij -80 °C tot gebruik.

Bereid in deze procedure een mastermix-oplossing voor die twee microliters 10x nucleic acid mix, twee microliters reverse transcriptase mix en vier microliters 5x Hispec buffer bevat, voor een totaal van 8 microliters per buis. Verdeel vervolgens 8 microliters van de mastermix-oplossing over elke buis. Meet de hoeveelheid van de totale RNA's met behulp van een spectrofotometer.

Voeg vervolgens één microgram van de geïsoleerde totale RNA's, gezuiverd uit het peritoneale membraanmonster, toe aan elke buis. Voeg daarna RNase-vrij water toe aan elke buis om een totaalvolume van 20 microliters te bereiken. Meng dit vervolgens grondig door te pipetteren en centrifugeer het gedurende 15 seconden.

Incubeer het monster vervolgens 60 minuten bij 37 °C. Incubeer het daarna vijf minuten bij 95 °C. Breng het nieuw gegenereerde cDNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis en verdun dit 10 keer met RNase-vrij water.

Bereid in deze procedure voor elke put een mastermix bestaande uit 12,5 µL 2x PCR-mastermix, 2,5 µL van 5 µM van elke miRNA-primer opgelost in nucleasevrij water en 1,25 µL 10x universele primer. Verdeel 22,5 µL van deze mastermix over elke put van een 96-wells plaat. Voeg vervolgens 2,5 µL template-cDNA toe aan elke put.

Afdicht de 96-well reactieplaat met een stuk folie. Centrifugeer deze vervolgens bij 1 000 ×g gedurende 30 seconden. Plaats de plaat in het real-time PCR-instrument om het PCR-cyclusprogramma uit te voeren.

Definieer de experimentele eigenschappen in de real-time PCR-software. Ken vervolgens namen toe aan de monsters en de doel-miRNA's in elke well. Voer daarna in de real-time PCR-software een reactievolume van 20 µL en de volgende PCR-cycluscondities in, overeenkomstig de instructies.

Pre-incubatie bij 95 °C gedurende 15 minuten. Daarna 40 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 15 seconden, annealing bij 55 °C gedurende 30 seconden en extensie bij 70 °C gedurende 30 seconden. Op basis van miRNA-microarrayscreening is met behulp van qRT-PCR, volgens het in dit manuscript gepresenteerde protocol, vastgesteld dat de niveaus van zes miRNA's significant verhoogd zijn in het peritoneummembraan van ratten met peritoneale fibrose, vergeleken met die in mock-ratten en controle-ratten.