Name: zebravis In Situ Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer elektrofysiologische registraties van spinale zenuwcellen in zebravisembryo's en larven. Deze methode maakt in situ-studie van sensorische en motorische neuronen mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (F32 NS059120 naar RLM en R01NS25217 en P30NS048154 te ABR).

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De hier beschreven werkwijzen maken de elektrische en morfologische karakterisering van sensorische en motorische neuronen van zebravis embryo&#39;s na een minimale dissectie van het ruggenmerg. Neuronen gezond blijven gedurende ten minste 1 uur, de tijdslimiet opgelegd aan deze opnames. Neuronen werden opgenomen met de standaard whole-cell configuratie, alsmede uit kernhoudende pleisters; deze methode kunnen space-clamp problemen die een gedetailleerde studie van biofysische ionenstromen 9 kunne...

<html> George Streisinger pionier in het gebruik van Danio rerio, beter bekend als de zebravis als een modelsysteem voor de genetische analyse van gewervelde ontwikkeling 10. Het model biedt verscheidene voordelen waaronder: (1) betrekkelijk eenvoudige en goedkope veeteelt; (2) externe bevruchting, waardoor u gemakkelijk toegang tot de embryo&#39;s uit de vroegste ontwikkelingsfasen; en (3) een transparante embryo, die rechtstreeks en herhaalde waarnemingen van cellen, weefsels en organen zij vormen. In de daaropvolgende decennia verschillende ontwikkelingen verder vergroot de kracht van de zebravis model. In het bijzonder naar voren genetische screens en hele genoom sequencing inspanningen speelden een belangrijke rol in de identificatie van mutaties en genen van cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15 16. Gateway klonering werkwijzen kon de routinematige toepassing van transgene benaderingen 17, 18. Recente vooruitgang in genoom uitgeven, met als voorbeeld transcriptie-activator-achtige (Talens) en geclusterde regelmatige afstand van elkaar korte palindroom herhalingen (CRISPR) -Cas9 nucleasen, zorgen voor de beoogde invoering van mutaties, evenals knock-out en knock-in benadert 19, 20, 21, 22. Gecombineerd, deze methoden maken zebravis een krachtig model voor de studie van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan specifieke gedragingen en verschillende ziekten bij de mens 23, 24, 25, 26, 27. Dit werk richt zich op de ontwikkeling vanmentale regelgeving en de rol van de elektrische activiteit in neuronale ontwikkeling. De nadruk ligt op het ruggenmerg, waarbij de zebravismodel verschaft verscheidene voordelen. Ten eerste is het relatief eenvoudig om toegang te krijgen tot de zebravis op de embryonale en larvale stadia; Daarom kan men ruggenmerg functie te bestuderen tijdens ontwikkelingsstadia die minder neuronen en eenvoudigere circuits 28, 29 hebben. Bovendien is de zebravis ruggenmerg heeft een diverse set van neuronen, vergelijkbaar met andere gewervelde dieren, zoals gedemonstreerd door karakteristieke en kenmerkende patronen van transcriptiefactoren 30, 31, 32, 33, 34, 35. De meeste studies in zebravis die gericht zijn op de mechanismen die de functie van het ruggenmerg ten grondslag liggen bloot circuits, met nameDegenen die voortbeweging ondersteunen, zijn begrijpelijkerwijs gericht op larvale stadia 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Veel van de neuronen die het ruggenmerg loc netwerken vormen initiëren hun differentiatie in vroege embryonale stadia ~ 9-10 uur na bevruchting (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Met het oog hierop, begrijpen hoe de morfologische en elektrische eigenschappen van spinale neuronen ontstaan ​​en verandering tussen de embryonale en larvale stadia is belangrijk voor een overall kennis van de vorming en functie bewegingsapparaat circuit. De dissectie hier beschreven methoden mogelijk patch clamp opnamen van spinale neuronen en met succes toegepast op embryonale stadia (~ 17-48 HPF) en larvale stadia (~ 3-7 dagen na de bevruchting [DPF]). Deze aanpak beperkt de hoeveelheid dissectie die nodig is om de toegang tot de neuronen van belang. Het protocol verschilt van de meeste andere gepubliceerde methoden voor het registreren van zebravis spinale neuronen doordat dierenarts hechting lijm wordt toegepast, in plaats van een fijne wolfraamstift, het embryo of larven hechten aan de registratiekamer. De beschikbaarheid van twee verschillende benaderingen (dwz hechtdraad lijm ten opzichte van de wolfraam pin) voor het monteren van de zebravis embryo&#39;s of larven voor elektrofysiologische analyse geeft onderzoekers met alternatieve mogelijkheden om hun specifieke experimentele doelen te bereiken. Ten eerste, de procedures voor het openen en het opnemen van een pop<html> ulatie primaire sensorische neuronen, Rohon Beard-cellen beschreven. De cellichamen van deze neuronen liggen in de dorsale ruggenmerg. Rohon-Beard cellen bestaan in diverse gewervelde species, differentiëren vroeg in de ontwikkeling en ten grondslag aan de embryonale aanslagreactie 6, 44, 47, 48. Ten tweede, procedures voor het openen en het opnemen van spinale motorische neuronen gedetailleerd. Zebravis spinale motorische neuronen voordoen bij twee golven van neurogenese. De eerder geboren primaire motorische neuronen ontstaan eind van gastrulatie (~ 9-16 HPF), met slechts 3-4 primaire motorische neuronen onderhavige per hemisegment 45, 46, 49. Daarentegen De latere populatie van secundaire motorische neuronen talrijker en ontstaat gedurende langere tijd, te beginnen bij ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45 50. secundaire motor neuron genesis midden bundelsegmenten wordt meestal afgesloten met 51 HPF 50. Secundaire motorneuronen worden beschouwd als de tegenhanger van motorneuronen in amnioten zijn 46. Interessant supraspinale neuronen, via dopamine reguleren motoriek in de larve en secundaire motor neuron ontstaan in het embryo en jonge larven 50, 51. Primaire en secundaire motorische neuronen bevatten elk verschillende subtypes. elke primaire motorische neuron subtype projecteert een perifere axon dat een kenmerk spiergroep innerveert, leidt tot een stereotype, identificeren axonale traject. In het algemeen, secundaire motorneuronen volgen axonale trajecten eerder bij primaire motorische neuronen. Aldus opzichte van axonale trajecten, primaire en secundaire motorische neuronen vergelijkbaar, behalve dat axonale dikte en grootte een somatare groter voor primaire motorische neuronen 45. Ten derde, werkwijzen voor het opnemen van enkele soorten interneuronen besproken. In deze gevallen beperkt verwijdering van andere ruggenmerg cellen is vereist, om zo het ruggenmerg meer intact dan bij opnamen van Rohon-Beard cellen of motorneuronen.

<table><tbody><tr><td>Vacuum filter/Opslagfles, 0.22 mm poriën</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter 0.2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Ethyl 3-aminobenzoate methaansulfonaat zout&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;-bugarotoxin</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 hydrazine zout</td><td>Molecular Probes</td><td>A-10438</td><td>fluorescent kleurstof</td></tr><tr><td>Spin-X centrifugebuisfilter</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Glazen microscoopglas</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicon elastomeer kit</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>silicon elastomeer</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillairen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>inner en outer diameters van 0,78 en 1,0 mm (dunwandige glas capillairen)</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillairen</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>inner en outer diameters van 1,13 en 1,55 mm (dikwandige glas capillairen)</td></tr><tr><td>Miniatuur baarspolypropyleen fitting&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond weefselkleefstof&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Micro-elektrode puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp;Model P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Head stage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde micromanipulator&nbsp;&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon buis</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN en WALL 1/32 IN (flexibele laboratoriumbuis)</td></tr><tr><td>Elektrodehouder</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Drieweg Stopcocks&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan objectief</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dataverwerving en analyse software&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex en Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipet puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td colspan="4">Dissectie en opnameoplossingen (in mM)</td></tr><tr><td>Alle oplossingen, behalve de intracellulaire, zijn stabiel gedurende ~2-3 maanden wanneer gefilterd (0,22 mm filtercups) en bewaard bij kamertemperatuur (RT).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>De intracellulaire oplossing wordt gefilterd (0,2 mm spuitfilters) en bevroren bewaard (-20 &deg;C) in kleine aliquoten die afzonderlijk worden ontdooid op de dag van gebruik.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie/Ringer&rsquo;s oplossing</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (met NaOH)</td></tr><tr><td>Pijpje (intracellulair) opnameoplossing</td><td></td><td></td><td>135 KCl, 10 EGTA-zuur, 10 HEPES; pH 7,4 (met KOH).</td></tr><tr><td>Bath (extracellulair) opnameoplossing/voltage en stroom-clamp</td><td></td><td></td><td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7,4 (met NaOH).</td></tr><tr><td>Alexa-594 hydrazine zout stockoplossing.&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bereid een 13,2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 &micro;l) en bewaar bij -20 &deg;C. Voor gebruik, verdun de stockoplossing 132 keer met pijpje oplossing tot een eindconcentratie van 100 mM. Na verdunning, filter de Alexa-594 bevattende pijpje oplossing&nbsp; met een centrifugebuisfilter.</td></tr><tr><td>Immobiliserende agentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4% ethyl 3-aminobenzoate methaansulfonaat zout (Tricaine)</td><td></td><td></td><td>Bereid een 0,4% stockoplossing in 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricaine/100 mL 0,2 M Tris</td></tr><tr><td colspan="4">Pas pH aan op 7 met NaOH en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Voor gebruik, verdun de stockoplossing ~25 keer in embryomedia</td></tr><tr><td>250 mM &alpha;-bungarotoxin</td><td></td><td></td><td>Bereid een 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), bereid 100 &micro;L aliquoten, en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Voor gebruik, verdun 2.500-voudig met extracellulaire oplossing tot een eindconcentratie van 100 nM.</td></tr><tr><td>1 mM Tetrodotoxin</td><td></td><td></td><td>Bereid een 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), bereid 100 &micro;L aliquoten, en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Voor gebruik, verdun 2.000-voudig met extracellulaire oplossing tot een eindconcentratie van 500 nM.</td></tr></tbody></table>

zebravis<em&gt; in situ</em&gt; spinal cord voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van spinal sensorische en motorische neuronen

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebravis, voor het eerst geïntroduceerd als een ontwikkelingsmodel, hebben opgedaan populariteit in vele andere gebieden. Het gemak van het houden van grote aantallen snel ontwikkelende organismen, gecombineerd met de embryonale optische helderheid, diende als de eerste overtuigende kenmerken van dit model. In de afgelopen twee decennia is het succes van dit model verder voortgestuwd door zijn ontvankelijkheid voor grootschalige mutagenese schermen en door het gemak van transgenese. Meer recent zijn gen-editing benaderingen van de kracht van het model uitgebreid. Voor neurologische studies, de zebravis embryo en larven kunnen dus model waaraan meerdere methoden kunnen worden toegepast. Hier richten we ons op methoden die de studie van een essentiële eigenschap van neuronen, elektrische prikkelbaarheid mogelijk te maken. De voorbereiding van de elektrofysiologische studie van zebravis spinale neuronen omvat het gebruik van lijm dierenarts hechting aan het preparaat een opnamekamer garanderen. Alternatieve methoden voor het opnemenvan zebravis embryo&#39;s en larven omvatten de hechting van het preparaat aan de kamer met een fijne wolfraamstift 1, 2, 3, 4, 5. Een wolfraamstift wordt meestal gebruikt om het preparaat in een zijdelingse richting zet, al is gebruikt om larven dorsale zijde omhoog 4 monteren. De hechting lijm is gebruikt om embryo&#39;s en larven in beide richtingen te monteren. Gebruik van de lijm kan een minimale dissectie worden uitgevoerd, waardoor de toegang tot spinale neuronen zonder toepassing van een enzymatische behandeling, waardoor schade geen vermijden. Voor larven, is het noodzakelijk een korte enzymbehandeling toepassing op het spierweefsel rond het ruggenmerg verwijderd. De hier beschreven methoden zijn toegepast om de intrinsieke elektrische eigenschappen van motorneuronen, interneuronen en sensorische neuronen op verschillende developmentÃ bestuderenl trappen 6, 7, 8, 9.

We hebben met succes opgenomen van Rohon-Beard neuronen in 17 HPF embryo tot 7 DPF larven (figuur 5A en 5B). Wanneer Rohon-Beard cellen werden opgenomen, werd de bereiding gemonteerd dorsale kant naar boven. Dergelijke bevestiging maakt de ondubbelzinnige identificatie van Rohon-Beard cellen op basis van hun oppervlakkige dorsale positie en grote soma maten. De identificatie wordt bovendien bevestigd door de stereotiepe gehyperpolariseerde rust membraanp...

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo&#39;s en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Het algemene doel van deze preparatie is om de elektrofysiologische studie van spinale neuronen van zebravis in situ mogelijk te maken in het embryonale en larvale stadium. De elektrofysiologische analyses vullen de krachtige genetische en imaging-benaderingen aan die ook met het zebravismodel mogelijk zijn. Hoewel de methode oorspronkelijk is ontwikkeld om rohon-baardneuronen te bestuderen, hebben we de aanpak in de loop van de tijd eenvoudig aangepast en kunnen we nu verschillende typen spinale neuronen bestuderen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Rosa Moreno, een research associate, met wie ik al vele jaren het genoegen heb om samen te werken. Om deze procedure te starten, verwijdert u de zwarte peer uit een glazen boring en vervangt u deze door een witte rubberen adapter uit een andere glazen boring. Snijd vervolgens een stuk flexibele slang op een lengte van ongeveer 38 centimeter.Bevestig vervolgens de flexibele slang via een kleine, rechte polypropyleenkoppeling. Om het siliconen elastomeer voor te bereiden, voegt u de basis en het uithardingsmiddel in een verhouding van vier op één toe aan een plastic conische buis. Meng daarna de elastomeerbasis en het uithardingsmiddel grondig.Giet het mengsel in twee Petri-schalen van 100 millimeter, tot een diepte van ongeveer 1 millimeter in de ene schaal en ongeveer 2,5 millimeter in de andere. Laat het siliconen elastomeer vier tot vijf dagen aan de lucht uitharden. Indien het uitgeharde elastomeer sneller nodig is, kan het worden geïncubeerd bij 60 °C.Snijd vervolgens een rechthoek van 3,8 centimeter bij 6,3 centimeter uit het uitgeharde elastomeer van één millimeter dik om als bodem van de kamer te dienen. Snijd uit het uitgeharde silicone van 2,5 millimeter dik een rechthoek van 3,8 centimeter bij 6,3 centimeter. Snijd daar vervolgens een binnenrechthoek van 2,5 centimeter bij vijf centimeter uit om een frame voor de bovenkant van de kamer te maken.Om de dissectiekamer te maken, plaatst u de dunne rechthoek van silicone direct op het glazen dekglas, waarbij u er zeker van bent dat alle luchtbellen tussen de silicone en het glas zijn verwijderd. Plaats vervolgens het rechthoekige silicone frame bovenop de dunne onderste laag silicone. Plaats in deze procedure een embryo in een dissectiekamer die twee tot drie milliliter Ringer-oplossing bevat.Immobiliseer het embryo door 100 µL van een 0,4% tricaine-oplossing aan de kamer toe te voegen. Trek vervolgens injectiemicropipetten met lange, dunne tips uit dunwandig glas met een micropipetten-trekker. Bevestig een getrokken glazen micropipet aan de glazen bodem van de lijmdispenser.Gebruik onder de dissectiemicroscoop een pincet om de punt van de glazen micropipet af te breken, zodat er een punt ontstaat met een diameter van ongeveer 75 µm. Vul de glazen micropipet nu met drie tot vijf µL lijm door zuiging via het mondstuk toe te passen. Breng de met lijm gevulde punt naar de dissectiekamer.Breng vervolgens de punt van de micropipet, die met lijm is gevuld, dicht bij de kop van het embryo terwijl via de mondbuis een lichte positieve druk op de micropipet wordt gehouden. Zodra de punt zich bij de kop van het embryo bevindt, wordt er voldoende positieve druk uitgeoefend om een kleine druppel lijm op de bodem van de kamer te brengen. Gebruik een dissectiepen om het embryo naar de lijmdruppel te bewegen, zodat de kop contact maakt met de lijm.Positioneer het embryo met de dorsale zijde naar boven en druk op de kop om een goed contact met de lijm te waarborgen. Terwijl de lijm langzaam uithardt, gebruikt u de dissectie-naald om het embryo opnieuw te positioneren zodat het met de ventrale zijde naar beneden en de dorsale zijde naar boven ligt. Dip de dissectie-naald in de druppel lijm en trek een paar lijmdraden over de kop van het embryo om de positie verder te fixeren.Zodra de kop stevig aan het siliconen is bevestigd en de lijm is gestold, wordt het embryo opgeofferd door middel van een doorsnede ter hoogte van de rhombencephalon met een andere glazen micropipet. Gebruik een nieuwe glazen micropipet om de huid meerdere keren oppervlakkig in te snijden op een positie caudaal van de rhombencephalon. Doorboor de huid oppervlakkig door de pipet loodrecht op de rostro-caudale as te bewegen aan beide zijden van de romp voor dorsaal gemonteerde specimens, of aan de blootgestelde zijde van de romp voor lateraal gemonteerde specimens.Om een huidflap te creëren die met de pincet kan worden vastgegrepen, schraapt u meerdere keren over de huid met de micropipet, op het niveau van en loodrecht op de initiële incisie. Til de huidflap geleidelijk op met een pincet en trek de huid caudaal. Breng daarna een kleine druppel lijm aan nabij de staart van het embryo.Gebruik deze lijm om de staart aan de bodem van de dissectiekamer te bevestigen. Terwijl de lijm uithardt, wordt de positie van de romp met de dissectienaald aangepast om ervoor te zorgen dat de romp dorsaal georiënteerd blijft en stevig aan de kamer is bevestigd. Na deze initiële dissectie wordt het preparaat uitgebreid gespoeld met Ringer-oplossing om de tricainaïne en debris te verwijderen, waarna het preparaat vijf minuten rust krijgt.Vervang vervolgens de dissectie-oplossing door extracellulaire registratie-oplossing. Voeg indien nodig een immobiliserend middel toe aan het preparaat. Verplaats daarna de dissectiekamer met het gemonteerde embryo naar de tafel van een rechtopstaande compoundmicroscoop, uitgerust met een 40 X waterimmersie-objectief met een lange werkafstand.Bevestig vervolgens een lege boring van een glazen micropipet met dikke wanden van silicaat aan de elektrodehouder van de headstage. Bevestig de slang aan de ene zijde aan de luchtafvoer van de elektrodehouder en aan de andere zijde aan een driewegkraan. Plaats daarna een mondstuk aan het ene uiteinde van een ander stuk slang en bevestig dit aan de andere zijde aan de driewegkraan.Breng vervolgens de tip van de micropipet naar het meest dorsale deel van het ruggenmerg en doorboor voorzichtig de meninges. Maak daarna snelle, korte, zijwaartse bewegingen om de meninges los te maken. Nadat de tip van de micropipet door de meninges is gegaan, wordt de micropipet verder bewogen en omhoog getrokken om de meninges van het ruggenmerg weg te trekken.Beweeg de micropipet vervolgens naar rostraal, waarbij u één tot twee hemisegmenten verder gaat om de rohon-baardscellen bloot te leggen. Op basis van onze ervaring zijn rohon-baardneuronen fragieler dan andere spinale neuronen. Om ze gezond te houden, leggen we telkens één of twee rohon-baarden bloot.Voltage-clamp-registraties van uitgaande en ingaande stromen werden verkregen uit de rohon-baardneuronen in embryo's en larven één, twee en zeven dagen na bevruchting. Het rustpotentiaal bedroeg -80 millivolt en de stromen werden opgewekt door een depolarisatiestap naar +20 millivolt. In current-clamp-modus wekt een stroominjectie van 0,35 nano amp gedurende één milliseconde een enkel actiepotentiaal op vanuit de rohon-baardneuronen in zowel embryo's als larven.In afwezigheid van elektrische stimulatie vertonen rohon-baardneuronen geen spontane spiking. Het rustpotentiaal van de rohon-baardneuronen wordt steeds negatiever naarmate de ontwikkeling vordert. Zodra deze methode onder de knie is, kunnen embryo's binnen 10 minuten worden gemonteerd en gedisseceerd om de rohon-baarden bloot te leggen.Zoals vermeld in het protocol is het belangrijk om de factoren te begrijpen die bepalen hoe snel de lijm uithardt. Deze video belicht de cruciale stappen voor het registreren van spinale neuronen in zebravisjes.

zebrafish-situ-spinal-cord-preparation-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan ​​van een spinale motor-neuron en target skeletspieren. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een ​​segmentale CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren.

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

This video demonstrates a non-invasive assay to study electrophysiology of motor neurons in zebrafish embryos. Upon measuring tail coiling in the embryos as a result of spontaneous depolarization of the spinal cord motor neurons, a sodium channel blocker is applied to reduce the coiling frequency. Next, the embryos are immobilized in agarose and placed under a fluorescence microscope. The genetically engineered motor neurons express a voltage-sensing biosensor with a donor and an acceptor...

A Non-invasive Approach to Study the Electrophysiology of Motor Neurons in Zebrafish Embryos

This video demonstrates the recording of electrical signals from the afferent neurons in a paralyzed zebrafish larva by positioning a micropipette near the lateral line ganglion and forming a loose seal for signal capture. The extracellular solution maintains neuronal viability during this process.

Monitoring Electrical Signals from the Afferent Neurons in an Immobilized Zebrafish Larva

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een...

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

We beschrijven een protocol om veranderingen in de activiteit van het afferente neuron te volgen tijdens motorische commando's in een model gewerveld haarcelsysteem.

Activiteit van Posterior Lateral Line Afferent Neurons tijdens het zwemmen in Zebrafish

De neuromusculaire overgang van de zebravislarve is een aantrekkelijk model voor het bestuderen van synaptische fysiologie. Het is vatbaar voor vele experimentele technieken, waaronder elektrofysiologie en optische beeldvorming. Hier beschrijven we een protocol voor het in beeld brengen van synaptische transmissie met behulp van een op pHluorin gebaseerde sonde onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.

Live beeldvorming van het recyclen van synaptische blaasjes in de neuromusculaire overgang van ontlede larvale zebravissen

Leer elektrofysiologische registraties van spinale zenuwcellen in zebravisembryo's en larven. Deze methode maakt in situ-studie van sensorische en motorische neuronen mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

zebravis

Meer video's verkennen