Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Het algemene doel van deze procedure is om cellen of substraten te patrooneren door ze te verdelen in complexe lange en gesloten microkanalen met behulp van eenvoudige tafelwerktuigen die beschikbaar zijn in de meeste biologische laboratoria. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de biologie met betrekking tot cel-tot-cel en cel-tot-eiwit-interacties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk uit te voeren is en alleen gereedschappen vereist die in de meeste biologische laboratoria gemakkelijk beschikbaar zijn.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het een optimalisatie van de incubatiecondities voor de door de onderzoeker gekozen cellen en substraten vereist. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de juiste plaatsing van de PDMS-stempel en oplossing de reproduceerbaarheid van het experiment aanzienlijk verbetert. Begin met het tekenen van het lay-out van het microkanaal met behulp van een CAD-tekentool.

Druk vervolgens de tekening af op wit papier. Gebruik vervolgens isopropanol om een glazen plaat te reinigen die groot genoeg is om het ontwerp te herbergen. Droog vervolgens de plaat met een luchtpistool.

Bevestig plakband op de gereinigde glazen plaat, zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden vastgehouden. Plak vervolgens de zijkanten van de glazen plaat op het papier met het ontwerp, zodat de zijde met het plakband omhoog komt. Gebruik een scalpel om het plakband op de glazen plaat te snijden, gebruik het papierontwerp als referentie.

Na het snijden, verwijder het plakband van de ongewenste gebieden van de glazen plaat. Spoel vervolgens de glazen plaat met isopropanol om eventueel resterend plakmiddel te verwijderen. Gebruik vervolgens een luchtpistool om het oppervlak te drogen.

Eenmaal gepatrooneerd en gereinigd, bak de glazen plaat in een oven gedurende 30 minuten op 65 graden Celsius. Rol vervolgens voorzichtig over het plakband met een rubberen roller om luchtbellen te verwijderen en laat de plaat afkoelen tot kamertemperatuur in een petrischaal. Begin met het mengen van 10 delen van een PDMS-elastomeer met 1 deel van zijn verhardingsmiddel en roer het mengsel krachtig.

Plaats vervolgens het mengsel in een vacuümkamer om het mengsel te ontgassen tot er geen luchtbellen meer zijn. Giet een 2 mm dikke laag van het mengsel op het plakbandvorm, en ontgas de mal totdat alle luchtbellen verdwijnen. Gebruik een scalpel om de PDMS-laag minstens 5 mm van de functies te snijden, nadat deze is afgekoeld.

Vervolgens, verwijder het uitgeharde PDMS van de mal met behulp van een tang. Maak een enkele inlaatgat met een 1 mm biopsie-pons, bij voorkeur aan het einde van een netwerk van microkanalen. Reinig vervolgens het PDMS-afgietsel met plakband om stofdeeltjes uit het apparaat te verwijderen.

Steriliseer het PDMS-microkanaalapparaat door het te spoelen met een oplossing van 70% ethanol, gevolgd door steriele gedeïoniseerde water, en stel het bloot aan UV-licht gedurende 30 minuten. Gebruik een pincet om het steriele PDMS-afgietsel op een steriele glazen dekselplaat te plaatsen en oefen lichte druk uit met de punt van de pincet. Plaats vervolgens een druppel poly d lysine in natriumtetraboraatbuffer op de inlaat van de microkanalen.

Plaats de petrischaal gedurende 10 minuten onder vacuüm. Gedurende deze tijd, observeer lucht die uit het kanaal komt in de vorm van bellen. Laat het vacuüm los en observeer de substratenoplossing die in het microkanaal stroomt. Incubeer de schaal gedurende een uur op 37 graden Celsius.

Vervolgens, verwijder voorzichtig de PDMS-stempel met behulp van steriele pincet, en was het patroon drie keer met gedeïoniseerd water. Voeg een 1% BSA-oplossing toe aan het glazen deksel om niet-specifieke hechting te verminderen en incubeer het monster een nacht op 37 graden Celsius. De volgende dag, zuig de BSA-oplossing op.

Om het indirecte patroon van cellen te starten, bereid een celsuspensie in serumvrij kweekmedium voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Voeg de celsuspensie toe aan de gepatroonde petrischaal, waarbij het gepatroonde gebied volledig in celsuspensie wordt ondergedompeld. Vervolgens, incubeer de petrischaal gedurende 15 minuten op 37 graden Celsius in een incubator om cellen te laten hechten aan het gepatroonde substraat.

Na incubatie, zuig de overtollige celsuspensie uit de petrischaal en was de gepatroonde cellen drie keer met PBS, terwijl u zachtjes gedurende tien seconden schudt om de niet-bevestigde cellen te verwijderen. Voeg vervolgens het juiste kweekmedium toe aan de gepatroonde celculturen en incubeer de gepatroonde cellen op 37 graden Celsius in een koolzuurgas gebufferde incubator. Voor het directe patroon van cellen, steriliseer eerst het microfluïdische apparaat door het te spoelen met een oplossing van 70% ethanol gevolgd door gedeïoniseerd water.

Vervolgens, week het apparaat een nacht in een oplossing van 1% BSA om niet-specifieke celhechting aan het PDMS te voorkomen. Droog het apparaat op kamertemperatuur en bevestig het vervolgens aan de bodem van de weefselcultuur behandelde petrischaal. Plaats 4 tot 8 microliters van de celsuspensie, voldoende om de microkanalen te vullen, op de inlaat en bedek het gat volledig.

Plaats vervolgens de petrischaal gedurende 10 minuten in een vacuümkamer. Laat het vacuüm los en observeer de celsuspensie die in het microkanaal stroomt. Incubeer de petrischaal gedurende maximaal een uur op 37 graden Celsius in een koolzuurgas gebufferde incubator.

Vervolgens, verwijder de schaal uit de incubator en gebruik een paar pincet om voorzichtig het PDMS van de schaal te verwijderen. Was het patroon met PBS en voeg vervolgens celkweekmedium toe aan de petrischaal. Wann