Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Het algemene doel van dit experiment is om een efficiënte en gemakkelijk te interpreteren methode te bieden om de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van geëxprimeerde GPCR-fusie-eiwitten in zoogdiercellen te detecteren. Deze methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het veld van subcellulaire eiwitlokalisatie te beantwoorden, zoals receptorinternalisatie en recycling. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig en efficiënt kan worden gebruikt.

Deze methode kan dus inzicht bieden in het monitoren en lokaliseren van GPCR's. En het kan ook op andere systemen worden toegepast, zoals cytoplasmatisch en nucleair eiwit. Na het herstellen en passeren van HEK293-cellen volgens het tekstprotocol, wanneer de cellen bijna tot confluentie zijn gegroeid, gooit het geëquilibreerde groeimedium weg, voegt u twee milliliter PBS toe en draait u de schaal om de cellen te wassen.

Gooi het PBS weg en voeg een milliliter trypsine EDTA toe. Om de cellen volledig te verteren, draait u voorzichtig de schaal en zuigt u de oplossing af. Leg de schaal vervolgens drie minuten in deze CO2-incubator met een watermantel van 37 graden Celsius.

Terwijl de cellen worden geïncubeerd, bereidt u een zes-wellplaat voor door aan elke put twee milliliter geëquilibreerd groeimedium toe te voegen. Vervolgens, wanneer de cellen van de bodem van de schaal zijn opgetild, voegt u een milliliter geëquilibreerd groeimedium toe aan de schaal. Meng door te pipetteren en breng onmiddellijk 0,1 milliliter celsuspensie over in elke put van de voorbereide zes-wellplaat.

Pipetteer voorzichtig de suspensie in de putten en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Zorg er de volgende dag voor dat de cellen 85-95% confluent zijn. Voeg vervolgens aan twee steriele microcentrifugebuisjes drie microgram plasmide-DNA en 100 microliter gereduceerd serummedium toe aan één buisje.

Voeg ondertussen negen microliter reagens één en 100 microliter gereduceerd serummedium toe aan een andere buis. Incubeer de buisjes vijf minuten op kamertemperatuur. Combineer het verdunde plasmide-mengsel met verdund reagens één.

Meng vervolgens voorzichtig de oplossing en incubeer deze gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Zuig het medium van de cellen af en voeg 1,5 milliliter vers DMEM zonder FBS toe. Voeg vervolgens druppelsgewijs 215 microliter DNA-transfectiereagensmengsel toe aan elke put en meng voorzichtig door de schaal te draaien.

Incubeer de plaat gedurende vier tot acht uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Vervolgens vervangt u het medium door vers DMEM met 10%FBS. Incubeer de cellen nog eens 24 tot 48 uur voordat u experimenten uitvoert.

De transfectie-efficiëntie kan sterk variëren in verschillende cellijnen. Daarom kan de optimalisatie van de sit and stab in depositie noodzakelijk zijn, afhankelijk van het specifieke celtype dat wordt gebruikt. Verwijder het groeimedium van de zes-wellcultuurplaat.

Gebruik vervolgens één milliliter PBS om de celmonolaag te wassen. Voeg 0,5 milliliter trypsine EDTA toe, draai de schaal en zuig de oplossing af. Incubeer vervolgens de cultuurplaat gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius.

Tijdens de incubatie, plaatst u steriele deksels van 15 millimeter diameter in elke put van een 12-wellplaat. Resuspendeer de cellen in een klein volume vers compleet groeimedium en breng het vereiste aantal cellen over naar de 12-wellplaat met deksels. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 16 tot 24 uur.

Na 16 tot 24 uur incubatie, wanneer de cellen bijna tot confluentie zijn gegroeid, voegt u vijf micromolar van de membraanprobe dill toe aan elke put en plaatst u de cellen terug in de incubateur gedurende 30 minuten. Verwijder het geëquilibreerde groeimedium en gebruik koud PBS om de cellen twee keer te wassen. Voeg vervolgens een milliliter 4%PFA toe aan elke put en schud de cellen gedurende 15 minuten om de cellen te fixeren.

Was de gefixeerde cellen met PBS twee keer, voeg vervolgens 200 tot 300 microliter DAPI toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Na het wassen van de cellen met PBS twee keer, verwijdert u voorzichtig de deksels van de plaat en dekt u het overtollige buffer af. Draai de deksels om op microscoopglazen beladen met één druppel montagemedium.

Verwijder vervolgens het overtollige montagemedium van de schuiven. Gebruik cellen die bijna tot confluentie zijn gegroeid, verwijder het geëquilibreerde groeimedium en voeg vers verwarmd DMEM toe. Incubeer de cellen gedurende één uur.

Behandel de cellen gedurende 30 minuten met verschillende concentraties ligand. En behandel de cellen gedurende de verschillende hier getoonde tijden met 10 tot de zesde macht van de negatieve molariteit ligand. Was de cellen twee keer met koud PBS, voeg vervolgens een milliliter 4%PFA in PBS toe aan elke put en schud de cellen voorzichtig gedurende 15 minuten.

Na het wassen van de cellen twee keer in PBS, verwijdert u voorzichtig de deksels van de putten van de plaat en monteert u ze zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Om confocale microscopie uit te voeren, zet u de hardware van de confocale microscoop aan, inclusief de kwiklampkracht, de PC-microscoop, de scanner en de laser. Start de software en controleer vervolgens de configuratie en selecteer de laser.

Zet volgens de instructies de verschillende eenheden van het confocale microscopiesysteem aan. Plaats een voorbereide schuif op de microscoopstandaard en gebruik de stagesturing om het monster boven de objectieflens te plaatsen. Voor een oliemmergelens, brengt u één druppel cederolie op de deksel en richt u de schuif uit met een deksel die naar de lens is gericht.

Onder fluorescentie, vindt u de cellen van belang en schakelt u over naar de scanmodus en kiest u de laservermogen en spectral