Name: Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer GPCR-internalisatie detecteren in zoogdiercellen met confocale microscopie. Deze methode visualiseert subcellulaire lokalisatie van receptoren in HEK293-cellen voor signaaltransductieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs van dit artikel willen prof. Jiayan Xie bedanken voor technische assistentie en het gebruik van apparatuur. Dit werk werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (41406137).

1. Celbereiding <ol><li> Cell herstel <ol><li> Breng de gecryopreserveerde menselijke embryonische nier 293 (HEK293) cellen van een vloeibare stikstof tank naar een 37 ° C waterbad en schud continu gedurende 1-2 min. </li><li> Voeg 10 ml geëquilibreerd kweekmedium (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing) tot 10 cm celkweekschaal. Voorzichtig de ontdooide cellen toe te voegen aan de geëquilibreerde groeimedium. </li><li> Incubeer de cellen in een 37 ° C watermantel CO2 incubator met een vochtige atmosfeer die 95% lucht en 5% CO2 gedurende 2-4 uur. </li><li> Na 2-4 h, controleer dat de cellen gevoegd. Vervang de geëquilibreerde groeimedium en cultuur voor een ander 24-48 uur. LET OP: Het veranderen van de geëquilibreerde groeimedium is nuttig omdat het verwijdert dimethylsulfoxide (DMSO) en beschermt tegen celbeschadiging. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; Cell passage <ol><li> Na 24-48 uur, wanneer de cellen zijn gegroeid tot bijna confluentie, gooi de geëquilibreerde groeimedium en was de cellen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zwenk de schaal voorzichtig. </li><li> Gooi de PBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA (saline, 0,25% trypsine en 0,02% EDTA). Om de cellen volledig te verteren, wervelen de schotel voorzichtig en zuig van de trypsine-EDTA-oplossing. Zet de schaal in de 37 ° C watermantel CO2 incubator gedurende 3 min. LET OP: Tijdens deze periode, voor te bereiden drie nieuwe 10-cm celkweekschaaltjes en voeg 10 ml in evenwicht gebracht groeimedium aan elk. </li><li> Met behulp van een lichtmicroscoop, bepalen of de cellen van de bodem van de schaal zijn opgeheven. Voeg 2 ml in evenwicht gebracht groeimedium aan het gerecht. Meng door pipetteren en direct pipet 0,6 ml van de celsuspensie aan elk van de nieuwe gerechten. Meng door pipetteren en de cellen te laten incuberen bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol></li&gt; </ol> 2. Cel zaaien <ol><li> Na 24-48 uur, wanneer de passage onderworpen cellen gekweekt tot bijna confluentie, gooi de geëquilibreerde groeimedium en was de cellen met 2 ml PBS. Zwenk de schaal voorzichtig. </li><li> Gooi de PBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA. Om de cellen volledig te verteren, wervelen de schotel voorzichtig en zuig van de trypsine-EDTA. Zet de schaal in de 37 ° C watermantel CO2 incubator gedurende 3 min. Opmerking: In deze periode stelt een 6-wells plaat door toevoeging van 2 ml geëquilibreerd kweekmedium aan elke well. </li><li> Voeg 1 ml geëquilibreerd groeimedium om de schotel, indien onder microscopische waarneming, de cellen hebben de schaalbodem opgeheven. Meng door pipetteren en direct pipet 0,1 ml celsuspensie (het volume is aangepast aan de groei celdichtheid) aan elk putje van de bereide 6-well plaat (cell-less 6-wells plaat met 2 ml geëquilibreerd kweekmedium). Meng door pipetteren en laten de cellenincuberen bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 3. Cel Transfectie <ol><li> Transfectiemethode 1, met liposoomformuleringen OPMERKING: Zie de tabel van materialen voor transfectiereagens 1. <ol><li> De volgende dag, ervoor te zorgen dat de cellen 85 zou moeten zijn - 95% confluent. </li><li> Voeg 3 ug plasmide DNA (500 ng / ul) en 100 ui gereduceerd serum medium in een steriele microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid 9 pl reagens 1 en 100 pl verminderde serum media in een microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Combineer het verdunde plasmide mengsel verdund Reagens 1 (totaal volume = 215 ul). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Aspireren medium uit cellen gekweekt plaat en voeg 1,5 ml vers DMEM zonder FBS. </li><li> Voeg 215 ul van DNA-transfectie reagensmengsel aan elk putje druppelsgewijs en meng voorzichtig door zwenken de plaat. </li><li> Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 4-8 uur. Vervang met verse DMEM met 10% FBS. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende nog 24-48 uur voordat u enige experimenten. </li></ol></li><li> Transfectiemethode 2, met liposoomformuleringen OPMERKING: Zie de tabel van materialen voor transfectiereagens 2. <ol><li> Voeg 2 ug plasmide DNA (500 ng / pl), 4 pi van Reagens 2, en 100 ul gereduceerd serum medium in een steriele microcentrifugebuis. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg het transfectiemengsel aan de cellen op druppelsgewijze wijze. </li><li> Na transfectie incubeer cellen voor 24-48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, voordat u enige experimenten. </li></ol></li></ol> 4. Cell Culture on Cover Slips <ol><li> Opnieuwbeweegt het groeimedium uit de kweek 6-wells plaat. </li><li> Was de celmonolaag met 1 ml PBS zonder calcium en magnesium. </li><li> Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA. Swirl de schotel voorzichtig en zuig off trypsine-EDTA. Incubeer de kweekplaat gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. De werkelijke incubatietijd afhankelijk van de gebruikte cellijn. Opmerking: In deze periode stelt een nieuwe 12-wells plaat en voeg 15 mm diameter steriele dekglaasjes aan elk putje. Dekglaasjes bedekt met lysine, laminine of collageen kan celhechting te HEK293 cellen die gemakkelijk los te verbeteren. </li><li> Wanneer de cellen losgemaakt, voeg 1 ml voorverwarmd compleet kweekmedium aan elke well. Meng door pipetteren en geeft de vereiste aantal cellen dragen aan de 12-well plaat met dekglaasjes. Voeg vers compleet kweekmedium aan elke put om het totale volume op 1 ml te passen </li><li> Incubeer de cellen gedurende 16-24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. NB: Na 30 -60 min, zal de meerderheid van de cellen gehecht zijn aan de steriele dekglaasjes. </li></ol> 5. confocale microscopie Detection <ol><li> cellulaire lokalisatie <ol><li> Na 16-24 uur, wanneer de cellen op steriele dekglaasjes in de 12-well plaat tot bijna confluentie gegroeid, voeg het membraan probe, Dil, aan elk putje, hetgeen een uiteindelijke concentratie van 5 uM. Laat de cellen te incuberen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na 30 minuten, verwijder het geëquilibreerd kweekmedium en was de cellen tweemaal in koude PBS (2-8 ° C). </li><li> Fixeer de cellen door toevoeging van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud gedurende 15 minuten. Voorzichtig: paraformaldehyde matig toxisch bij contact met de huid of inhalatie, en aangeduid als mogelijk carcinogeen. Chemische afzuigkappen, geventileerde kasten balans of andere beschermende maatregelen tijdens het wegen en behandeling van paraformaldehyde worden toegepast. &lt;/ Li&gt; <li> Was de gefixeerde cellen tweemaal in PBS. Voeg 200-300 ui DAPI (4&#39; , 6-diamino-2-fenylindool) (0,5 ug / ml) aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de plaat en lont overtollige PBS. Inverteer op microscoopglaasjes geplaatst met een druppel montage medium (50% v / v glycerol / water). Verwijder overtollige montage medium van de dia&#39;s. </li></ol></li><li> Cellular internalisatie <ol><li> Na 16-24 uur, wanneer de cellen op steriele dekglaasjes in de 12-well plaat tot bijna confluentie gegroeid, verwijder de geëquilibreerde kweekmedium vervangen door vers, warm DMEM-medium (37 ° C). Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Behandel de cellen met verschillende concentraties (0, 10 -12, -9 10 en 10 -6 M) van ligand gedurende 30 minuten en te behandelen met 10 -6 M ligand voor verschillende tijdstippen (0,10, 30 en 60 min). </li><li> Was de cellen tweemaal met koud PBS (2-8 ° C). Fixeer de cellen door toevoeging van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud gedurende 15 minuten. </li><li> Was de cellen tweemaal in PBS. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de plaat en de pit van de overmaat PBS. Inverteer op microscoopglaasjes geplaatst met een druppel montage medium (50% v / v glycerol / water). Verwijder overtollige montage medium van de dia&#39;s. </li></ol></li><li> Confocale microscopie <ol><li> Zet de hardware van de confocale microscoop, met inbegrip van de kwiklamp macht, PC microscoop, scanner en laser. Meld u aan besturingssysteemaccount, start u de software, controleert u de configuratie en selecteer laser. Zet de verschillende eenheden van confocale microscopie systeem in de volgorde volgens de instructies. </li><li> Plaats de voorbereide dia&#39;s op de microscoop podium. Plaats het monster via objectieflens via de platformbesturing. Voeg een druppel van cederhout olie opmet dekglaasje als de olie immersielens is geselecteerd. Plaats het deksel slips op dia&#39;s met uitzicht op de lens. </li><li> Vind de cellen van belang in het kader van de fluorescentie microscopie. </li><li> Schakelen naar de scanmodus. Kies het laservermogen en het spectrale gebied van de emissie fluorofoor. Leg de hoge kwaliteit confocale beelden door tuning intensiteit van de laser en andere parameters. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+molecular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and molecular sorting.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).</li>
<li>Hausott, B., Klimaschewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+turnover+and+receptor+trafficking+in+regenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons.</a> Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).</li>
<li>Kallal, L., Benovic, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+fluorescent+proteins+to+study+G-protein-coupled+receptor+localization+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking.</a> Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).</li>
<li>Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+the+Aequorea+victoria+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.</a> Gene. 111, 229-233 (1992).</li>
<li>Spector, D. L., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+Expressing+GFP+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins.</a> CSH protocols. 2006, (2006).</li>
<li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).</li>
<li>von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+vectors+for+the+expression+of+green+fluorescent+protein+fusion+proteins+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants.</a> Gene. 221, 35-43 (1998).</li>
<li>Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+green+fluorescent+protein+for+visualization+of+cell-specific+gene+expression+and+subcellular+protein+localization+during+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).</li>
<li>Kain, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+of+gene+expression+and+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization.</a> BioTechniques. 19, 650-655 (1995).</li>
<li>Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+ligand-mediated+internalization+of+G+protein-coupled+receptor+as+a+novel+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach.</a> Life Sci. 80, 17-23 (2006).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-Activated+Bombyx+Corazonin+Receptor+Is+Internalized+via+an+Arrestin-Dependent+and+Clathrin-Independent+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway.</a> Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).</li>
<li>Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+G+protein-coupled+receptor+kinases+and+arrestins+during+receptor+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization.</a> Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).</li>
<li>Ferguson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+beta-arrestin+in+mediating+agonist-promoted+G+protein-coupled+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization.</a> Science. 271, 363-366 (1996).</li>
<li>Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+receptors%3A+structure+and+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways.</a> Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).</li>
<li>Yan, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Expression+Profile+of+the+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De hier gepresenteerde protocol verschaft een efficiënte en eenvoudig te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van tot expressie gebracht GPCR fusie-eiwit in HEK293-cellen te detecteren. De techniek kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende genen en celtypes, zoals de cellulaire lokalisatie en internalisatie van de receptor corazonin van Bombyx mori in HEK293 cellen 16 en BMN. De succesvolle toepassing van deze kracht...

Cellen bezitten lading handel machines te transporteren materialen extracellulaire-liganden zoals, micro-organismen, nutriënten en transmembraaneiwitten-in de cel informatie, energie en andere doelen 1, 2. Het is van cruciaal belang voor de cellulaire homeostase, de functie weefsel, en de algehele overleving cel. De cellen gebaseerde expressie van fluorescente fusieproteïnen is een krachtige manier om de lokalisatie en de internalisering van transmembraan receptoren zoals G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR), studeren signaalroutes 3. De expressie van fusie-eiwitten gelabeld met groen fluorescent eiwit (GFP) vanaf kwal Aequorea Victoria, gecombineerd met directe fluorescentie detectie technieken is algemeen geaccepteerd in proteïnerichtsignaalsequentie onderzoek 4, 5, 6. -GFP gebaseerde detectiOp heeft het voordeel dat de real-time beeldvorming van levende cellen met vermijding fixatie artefacten 7. Een reeks veelzijdige kloneringsvectoren is geconstrueerd om de expressie van eiwit fusies met GFP in verschillende cellen 8 te vergemakkelijken, 9. De pEGFP-N1 vector is een veel gebruikte en in de handel plasmidevector die codeert voor een versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP), die is geoptimaliseerd van wildtype GFP voor helderdere fluorescentie en hogere expressie in zoogdiercellen. Waarnemen het fluorescentiesignaal van EGFP expressie in zoogdiercellen dient de fluorescentiemicroscopie verricht met excitatie bij 488 nm en emissie bij 507 nm, bij voorkeur met confocale microscopie. Bewaken van de subcellulaire lokalisatie en ligand-gemedieerde internalisatie van receptoren is een gebruikelijke techniek om de signaaltransductie en functie van GPCRs 10 onderzoeken </sup&gt;, 11. In de meeste gevallen leidt tot internalisatie desensitisatie van de GPCR (de verzwakking van de stimulusresponsie ondanks de aanwezigheid van agonisten) 12, 13. De geïnternaliseerde receptoren kunnen in het lysosoom worden opgenomen en afgebroken, of ze kunnen naar het celoppervlak worden gerecycleerd, afhankelijk van de aard van de receptoren en de cellijnen gebruikt in de experimenten. Het gonadotropine afgevende hormoon receptoren (GnRHRs) behoren tot de GPCR-familie en een typische GPCR eiwitstructuur, met een extracellulair aminoterminaal, een intracellulaire -COOH terminal, zeven transmembraan (TM) domeinen 14. De transfectie van de recombinante plasmide Sj GnRHR-EGFP (met GnRHR gen uit Sepiella japonica) en confocale microscopie detectie van EGFP gelabeld Sj GnRHR (tot expressie gebracht in HEK293-cellen) gemeld Previously en GFP fluorescentie werd vastgesteld als een reporter voor transmembraan eiwit lokalisatie 15 assays. Nu, de internalisatie van Sj GnRHR, geactiveerd door S. japonica gonadotropine afgevende hormoon (GnRH Sj), werd aangetoond in tijd- en dosisafhankelijke manieren met confocale microscopie.

<table><tbody><tr><td>HEK293 cellijn&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hoge glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Hoge glucose 4,0 mM L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetaal runderserum (FBS)</td><td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Genom</td><td>GNM10010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Genom</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsine &amp; 0,02% EDTA</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>medium met verminderd serum</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectiereagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Reagens 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfectiereagens</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Reagens 2</td></tr><tr><td>DAPI-kleuringsoplossing</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>Antifade montagemedium</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>100 mm celcultuur</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>6-well plaat&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>12-well plaat&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma CO2 Incubator</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II laser scanning confocal microscope</td><td>Leica&nbsp;</td><td>5100001311</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van ligand-geactiveerde g-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

Confocale laserscanningmicroscopie (CLSM) is een optische beeldvormingstechniek voor beeldvorming met hoog contrast. Het is een krachtige benadering om fluorescente fusie-eiwitten, zoals groen fluorescent eiwit (GFP), te visualiseren om hun expressie, lokalisatie en functie te bepalen. De subcellulaire lokalisatie van doeleiwitten is belangrijk voor identificatie, karakterisering en functionele analyses. Internalisatie is een van de overheersende mechanismen die G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR)-signalering regelen om de juiste cellulaire reacties op stimuli te garanderen. Hier beschrijven we een experimentele methode om de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van GPCR in HEK293-cellen met confocale microscopie te detecteren. Bovendien biedt dit experiment enkele details over celcultuur en transfectie. Dit protocol is compatibel met een verscheidenheid aan algemeen beschikbare fluorescente markers en is toepasbaar voor de visualisatie van de subcellulaire lokalisatie van een meerderheid van eiwitten, evenals van de internalisatie van GPCR. Deze techniek zou onderzoekers in staat moeten stellen de GPCR-genexpressie in zoogdiercellijnen efficiënt te manipuleren en studies over subcellulaire lokalisatie en internalisatie van GPCR moeten vergemakkelijken.

Figuur 1 toont een voorbeeld van een confocale microscoop systeem. Figuur 2 toont de expressie van pEGFP-N1 in HEK293 cellen. Het GFP-signaal werd gedetecteerd in het cytoplasma en de kern. Figuur 3 toont de subcellulaire lokalisatie van GnRHR van S. japonica in HEK293-cellen, consistent met onze eerder gepubliceerde resultaten 15. De fusie-eiwit met de EGFP tag aan het C-uiteinde van Sj GnRHR <e...

Dit protocol beschrijft confocale microscopie detectie van G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) internalisatie in zoogdiercellen. Het omvat de basis-celkweek, transfectie, en confocale microscopie procedure en zorgt voor een efficiënte en gemakkelijk te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en de internalisering van-fusion uitgedrukt GPCR detecteren.

Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

Het algemene doel van dit experiment is om een efficiënte en gemakkelijk interpreteerbare methode te bieden voor het detecteren van de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van tot expressie gebrachte GPCR-fusie-eiwitten in zoogdiercellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van subcellulaire eiwitlokalisatie, zoals receptorinternalisatie en recycling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig en efficiënt kan worden toegepast.Deze methode kan dus inzicht bieden bij het monitoren en lokaliseren van GPCR's. Bovendien is deze toepasbaar op andere systemen, zoals cytoplasmatische en nucleaire eiwitten. Nadat de HEK293-cellen zijn hersteld en overgezet volgens het tekstprotocol en de cellen bijna confluent zijn gegroeid, wordt het geëquilibreerde groeimedium weggegooid, worden twee milliliter PBS toegevoegd en wordt de schaal geschud om de cellen te wassen.Verwijder de PBS en voeg één milliliter trypsine EDTA toe. Om de cellen volledig te laten detacheren, schudt u de schaal voorzichtig en aspireert u de oplossing. Plaats de schaal vervolgens gedurende drie minuten in deze CO2-incubator met watermantel van 37 °

detection-ligand-activated-g-protein-coupled-receptor-internalization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Dit protocol maakt gebruik van agarose zwelling als een krachtige en generaliseerbare techniek voor het opnemen van integrale membraaneiwitten (GMP's) in gigantische unilamellaire lipide blaasjes (GUVs), zoals hier beschreven voor de reconstructie van het menselijke 1A serotoninereceptoreiwit (5-HT1AR), een van de klassen van farmacologisch belangrijke G-eiwit-gekoppelde receptoren.

Constructie van modellipidenmembranen met G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Leer GPCR-internalisatie detecteren in zoogdiercellen met confocale microscopie. Deze methode visualiseert subcellulaire lokalisatie van receptoren in HEK293-cellen voor signaaltransductieonderzoek.

Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Meer video's verkennen