Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Het algemene doel van dit scherm is om kleine molecuul-eiwitkinaseremmers te identificeren die de pluripotentie van embryonale stamcellen moduleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van embryonale stamcelsignalering door het identificeren van nieuwe eiwitkinase-signaleringsroutes die de pluripotentie van embryonale stamcellen reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dus dat het scherm relatief eenvoudig uit te voeren is met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en gemakkelijk beschikbare reagentia.

We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat de meeste onderzoeken naar pluripotentie-signaleringsroutes volledig enorme golven van het kinome hadden genegeerd. Bereid gelatine-gecoate 10 centimeter schalen voor door vijf milliliter 0,1% gelatine toe te voegen aan 10 centimeter platen. Na vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur, aspireer de gelatine en laat de plaat twee minuten drogen.

Plaat vervolgens een standaard muis ES-cellijn op de gecoate schalen in standaard muis ES-celmedium dat 100 nanogram per milliliter GST-gelabelde LIF, 10% foetaal runderserum en 5% knockout serumvervanger bevat. Kweek de cellen bij 37 graden Celsius 5%CO2 en ververs het medium elke dag. Passageer de muis ES-cellen bij ongeveer 80% confluency elke tweede dag door het medium af te aspireren en te wassen met vijf milliliter fosfaatgebufferd zout oplossing per plaat.

Voeg vervolgens één milliliter trypsine EDTA per plaat van muis ES-cellen toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na incubatie, re-suspendeer de trypsiniseerd cellen in vier milliliter medium en centrifugeer de cellen bij 1200 RPM gedurende vijf minuten. Re-suspendeer het resulterende celpellet grondig in vijf milliliter medium, pipet omhoog en omlaag om een enkele celsuspensie te genereren.

Tel de cellen door een 10 microliter celsuspensie te combineren met 10 microliter trypanblauw. Plaats het mengsel in een celtellingskamer of gebruik een hemocytometer en lichtmicroscoop. Zaai vervolgens 3000 muis ES-cellen in 0,1% gelatine-gecoate 96-well platen in een eindvolume van 100 microliter medium met behulp van een meerkanaals pipet.

Breng vervolgens kinaseremmers aan bij een verdunning van één op honderd met behulp van een meerkanaals pipet. Pipet voorzichtig het medium om de remmer en celsuspensie te mengen. Laat vervolgens de cellen een uur in een weefselkweekkap rusten om een gelijkmatige verdeling over het oppervlak te garanderen.

Kweek de cellen 48 uur zonder het medium te verversen. Om de screeningsanalyse te beginnen, was 96-well muis ES-cel platen in 200 microliter PBS met behulp van een meerkanaals aspirator en pipetten. Na het wassen, meng celextracten in 150 microliter lysebuffer.

Verduidelijk de extracten door centrifugatie bij 1500 keer G gedurende 30 minuten in V-gevormde 96-well platen. Immobiliseer vervolgens 100 microliter supernatanten op een nitrocellulosemembraan met behulp van een 96-well vacuüm dot plot manifold. Droog het membraan en kleur met 40 milliliter Ponceau S om een consistente overdracht te garanderen.

Na het wassen van het membraan met TBST, blokkeer het in TBST plus 3% melk. Bewaar vervolgens het membraan in Nanog en Dnmt3b antilichamen bij een verdunning van één op duizend in de blokkeringsbuffer overnacht. De volgende dag, was het membraan drie keer gedurende 10 minuten in TBST.

Bewaar vervolgens het in 30 milliliter secundaire antilichamen bij een verdunning van één op tienduizend in blokkeringsbuffer. Ontwikkel het membraan met behulp van een digitaal immunoblotting beeldvormingssysteem. Het is van cruciaal belang om kinaseremmers die in het scherm zijn geïdentificeerd te valideren met behulp van conventionele immunoblotting voordat u verdergaat.

Dit helpt om valse positieven te verwijderen voor verdere downstream-analyse. Analyseer de schermgegevens en valideer remmers als bonafide pluripotentieregulators zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier wordt een representatieve Nanog dot plot van het uitgevoerde scherm getoond.

Positieve controleremmers die geprimede of naïeve pluripotentie aandrijven, worden gemarkeerd. Ook getoond is een representatieve Dnmt3b dot plot van het uitgevoerde scherm. Positieve controleremmers die geprimede of naïeve pluripotentie aandrijven, worden opnieuw gemarkeerd.

In deze plot zijn de remmers gerangschikt op de Nanog tot Dnmt3b verhouding. Er is een tweevoudige Nanog tot Dnmt3b verhoudingsdrempel ingesteld om remmers te identificeren die naïeve of geprimede pluripotentie stabiliseren. De samengestelde Nanog en Dnmt3b signalen worden ook verstrekt.

Daarnaast worden kinaseremmers geselecteerd voor verdere validatie vermeld. Hier wordt een conventionele immunoblot validatie van geselecteerde kinaseremmers, Nanog en Dnmt3b immunoblots, evenals de Nanog tot Dnmt3b verhouding en het totale signaal getoond. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kleine molecuulkinaseremmers kunt identificeren die de pluripotentie van embryonale stamcellen moduleren.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 72 uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de kinase-signaleringsroutes die pluripotentie controleren, kan deze ook worden toegepast op embryonale stamceldifferentiatie en andere regulerende systemen zoals epigenetische modificatoren. Na de procedure kunnen andere bibliotheken van kleine molecuulremmers, zoals die welke gericht zijn op epigenetische modificatoren, worden gebruikt om nieuwe spelers in pluripotentieregulatie te identificeren.

Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor ons onderzoeksgroep om nieuwe pluripotentie-signaleringsroutes te verduidelijken. We gebruiken deze techniek om een nieuwe rol voor de versterkte route bij het reguleren van pluripotentie te identificeren.