Name: Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Ontdek een high-throughput screeningsmethode voor kinase-inhibitoren die embryonale stamcelpluripotentie reguleren. Deze techniek identificeert nieuwe signaalroutes met standaard laboratoriumapparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CACW wordt ondersteund door een PhD-studie van een Medisch Onderzoeksraad. GMF wordt gedeeltelijk ondersteund door een New Investigator Award van de Medische Onderzoeksraad (MR / N000609 / 1) en een onderzoeksbijdrage van Tenovus Scotland.

1. Collatie van Kinase-inhibitorbibliotheken met kleine molecuul <ol><li> Combineer remmerbibliotheken uit publiek toegankelijke kinaseremmerscollecties, bijv. Library of Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) van Harvard Medical School, een gerichte verzameling van 228 krachtige en selectieve kinaseremmers (http://lincs.hms.harvard.edu) , En de Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), een collectie van 376 samengesteld door industriële onderzoekers (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternatief, assembleer een op maat gemaakte kinaseremmer collectie uit commercieel verkrijgbare verbindingen. OPMERKING: In ons laboratorium hebben we een verzameling van 72 krachtige en selectieve gereedschapskinaseremmers samengesteld die 51 primaire doelkinasen omvatten, die allemaal uit commerciële bronnen verkrijgbaar zijn. </li><li> Kinase-remmers monteren in platen met 96 putjes voor optimale verwerking met hoge doorvoer bij meerdere concentraties (gebruik 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Inclusief in elke plaat controlebronnen die alleen DMSO bevatten en referentie controle inhibitors PD173074 (FGFRi) en Ruxolitinib (JAKi), die bekend zijn om respectievelijk naïeve en priide pluripotente staten te bevorderen. Annoteren in een spreadsheet of soortgelijke software. </li></ol> 2. MESC Cultuur Voorwaarden en Procedures voor Scherm Voorbereiding <ol><li> Bereid 0,1% gelatine gecoate 10 cm schotels door 5 ml 0,1% (w / v) gelatine aan 10 cm platen toe te voegen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Aspirateer de gelatine en laat de plaat gedurende 2 minuten drogen. </li><li> Cultuur elke standaard mESC lijn bij 37 ° C 5% CO 2 op 0,1% gelatine beklede 10 cm gerechten in standaard mESC media (zie Material Table ) die 100 ng / ml GST-LIF, 10% Fetaal Kalf Serum en 5% Knockout Serum bevat Vervanging. Vervang media elke dag en plaats de mESC&#39;s bij ongeveer 80% confluency elke tweede dag bij een verdunning van 1: 5-1: 10. </li><li> Om mESC&#39;s door te geven, aspireren media en was met 5 ml oF fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per plaat. </li><li> Voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,05% trypsine, 0,02% EDTA) per plaat mESC&#39;s toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Resuspendeerde trypsineerde cellen in 4 ml mESC media en centrifuge bij 1200 rpm gedurende 5 min. </li><li> Cellulaire pellets opnieuw resuspeneren in 5 ml mESC media, pipetteren omhoog en omlaag om een ​​enkele cel suspensie te genereren. </li><li> Tel cellen met een 10 μL cel suspensie en 10 μl Trypan Blue (0,4%). Plaats in een cel telkamer of gebruik een hemocytometer en lichtmicroscoop. </li><li> Zaad 3 x 10 3 mESCs in 0,1% gelatine gecoate 96 putjes platen, eindvolume 100 ul media, met behulp van een multikanaalspipet. </li><li> Kinase remmers toepassen bij 1: 100 verdunning (1 μL remmer toegevoegd aan 100 μL media) met behulp van een multi-channel pipet. Zachtjes pipette media om remmer en cel suspensie te mengen, laat dan toe dat cellen gedurende 1 uur in een weefselkweekhoofd komen om gelijkwaardige verdeling acro te waarborgenZoals het plating oppervlak. Cultuurcellen gedurende 48 uur zonder de media te veranderen. OPMERKING: Voorraadplaten van 1 / 0,1 / 0,01 mM geven respectievelijk een eindconcentratie van 10/1 / 0,1 μM. We raden aan om het scherm te starten bij een eindconcentratie van 1 μM om effectieve remming van primaire doelkinasen te waarborgen, terwijl de off-target effecten worden beperkt. </li></ol> 3. Kinase Inhibitor Screening Analysis <ol><li> Was 96 ml MESC platen in 200 μL PBS met behulp van meerdere kanalen aspirator en pipetten. </li><li> Maak celextracten in 150 μl lysisbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% natriumdeoxycholaat (w / v), 10 mM ß-glycerofosfaat , 10 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM NaF, 2 mM Na3VO4, Cocktail Tabletten van volledige Protease Inhibitor). </li><li> Verhelder extracten door centrifugeren bij 1.500 xg gedurende 30 minuten in V-bodemplaten met 96 putjes. </li><li> Immobiliseer 100 μl supernatanten op een nitrocelLulose membraan met behulp van een 96-putjes vacuum dot blot manifold. </li><li> Droog het membraan en vlek met 40 ml Ponceau S om de consistente overdracht te waarborgen. </li><li> Was membraan met TBST en blokkeer in TBST / 3% (w / v) melk. </li><li> Incubeer in Nanog en Dnmt3b antilichamen bij een verdunning van 1: 1000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) melkpoeder overnacht. </li><li> Was membranen in 3 x 10 minuten in TBST en incubeer in 30 ml secundaire antilichamen bij een verdunning van 1: 10.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) melk. </li><li> Ontwikkel met behulp van een digitaal immunoblottend beeldvormingssysteem. OPMERKING: Gebruik indien mogelijk kwantitatieve fluorescentie immunoblotting om Nanog en Dnmt3b te detecteren. Het achterliggende signaal voor Dnmt3b door fluorescentie immunoblotting is echter te hoog. Daarom worden secundaire antilichamen van 800 nm fluorescentie anti-konijn (Nanog) en anti-muis-HRP (Dnmt3b) gebruikt. </li></ol> 4. Analyse van schermdata en validatie van inhibitors als Bona Fide Pluripotency Regulators <p class="jove_content"&gt; OPMERKING: Dit is een kritische stap om ervoor te zorgen dat alleen bona fide pluripotencymodulatoren worden geïdentificeerd. Het is essentieel om triageren op basis van zowel de nanog: dnmt3b verhouding als het algemene signaal te verzekeren, om ervoor te zorgen dat kinase remmers die het mESC-overleving nadelig beïnvloeden, niet worden geselecteerd voor verdere analyse. <ol><li> Kwantificeer Nanog en Dnmt3b signaal met behulp van immunoblotting analyse software, en importeer waarden in een spreadsheet of soortgelijke software. Bereken Nanog: Dnmt3b verhouding voor alle monsters in vergelijking met DMSO controle. Bepaal ook het totale Nanog en Dnmt3b signaal om ervoor te zorgen dat kinaseremmers de nier- en dnmt3b-verhouding niet beïnvloeden door de mESC-levensvatbaarheid te veranderen. </li><li> Gebruik gerangschikt Nanog: Dnmt3b verhoudingen om remmers te identificeren die naïeve pluripotency (Nanog: Dnmt3b ratio hoger dan controle) en geperforeerde pluripotency (Nanog: Dnmt3b ratio lager dan controle) identificeren. Zet afsnijding bij 2x afwijking van de controlewaarden en filter kinaseremmers uit die een totaal Nanog + Dnmt3b signaal van minder dan dat produceren50% van de DMSO controle waarde om een ​​hoge vertrouwen lijst van kinase remmers te genereren die naïeve stabiliteit (hoge nanog: Dnmt3b ratio) en geperste pluripotentestanden (lage Nanog: Dnmt3b ratio) stabiliseren. </li><li> Valideer kinase remmers door mESCs te zaaien bij 2 x 10 5 cellen per 6 putjes in 2 ml media, en voeg kinase remmers bij 1 μM gedurende 48 uur toe zonder media te veranderen. </li><li> Lyse mESC&#39;s in lysisbuffer en analyseren Nanog en Dnmt3b expressie door conventionele SDS-PAGE immunoblotting. </li><li> Verdere valideren van hits door SDS-PAGE immunoblotting voor naïeve pluripotentie markers Klf2 en Klf4 en Oct4 om ervoor te zorgen dat pluripoten wordt gehandhaafd na 48 uur inhibitor behandeling. </li></ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li>
<li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li>
<li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li>
<li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li>
<li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li>
<li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+domains+of+Sos1%2FGrb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li>
<li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li>
<li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten die voortvloeien uit deze studie.

Hier tonen we een wijd toegankelijke methodologie om de rol van kinase signaalwegen te onderzoeken bij het reguleren van naïeve-primed pluripotente transitie. Dit behandelt een sleutelvraag in het ESC-veld. Hoewel de doorstromingsgenetica en transcriptomics benaderingen routinematig worden gebruikt om belangrijke transcriptie-regulatoren van naïeve en primitieve pluripotente staten te identificeren, blijkt uit te leggen dat pluripotentie-signaleringsnetwerken uitdagend zijn. We bieden nu een flexibele strategie aan die chemische remmers gebruikt om kinases te identificeren die de naïeve-primed pluripotente overgang in mESC&#39;s beheersen. Dit is gebaseerd op eenvoudige apparatuur, reagentia en materialen die beschikbaar zijn voor de meeste laboratoria die celsignalen en ESC-biologie bestuderen. Kritisch voor het succes van dit platform is onze ontwikkeling van een robuuste analyse om de overgang tussen naïeve en priide pluripotente staten te kwantificeren. Het vaststellen van deze analyse vereist significante iteratieve wijzigingen van celplatformIngedichtheid, tijd van inhibitor incubatie en immunoblottende condities. Kleine molecuulbenaderingen krijgen tractie voor rationeel gebruik in therapeutische ESC applicaties 15 , 16 . Een belangrijke kracht van screening met kleine moleculen is dat hulpmiddelenverbindingen zijn ontworpen en / of aangepast voor efficiënte cellulaire opname. Transfectie-efficiëntie is niet beperkend en het gebruik van gevaarlijke afleveringssystemen, zoals lentivirus, is niet nodig. Bovendien remmen remmers vaak meerdere isoformen in een kinasefamilie (bijvoorbeeld Fgfr1-4, Jak1-3), die functionele redundantie overwint die genetische / genomische interferentie technieken zoals RNAi en CRISPR / Cas9 voorkomt. Aangezien krachtiger en selectieve hulpmiddelverbindingen verkrijgbaar zijn bij zowel academische als farmaceutische geneesmiddelenontdekkingsprogramma&#39;s, worden ondergeschikte en slecht begrepen kinases naar de voorhoede van het ESC-onderzoek geduwd. Daarom stellen wij voor dat deze high-thRoughput screening benadering zal openstellen nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar core ESC regulerende netwerken. Een kleine beperking van deze technologie is dat zelfs de meest krachtige en selectieve kleine-molecuul-remmers in vivo meerdere onverwante kinasen induceren en remmen. Echter, steeds meer uitgebreide kinaseremmers profileringsgegevens maken het mogelijk om functionele doelen van kinaseremmers gemakkelijk te identificeren (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -remmers). Tenslotte kan ons platform in principe toegepast worden om een ​​kleine molecuulverzameling en / of cellulaire test te onderzoeken waarvoor een hoge kwaliteit immunobloterende antilichamen beschikbaar zijn. Dit zal toelaten studie van meerdere regulerende systemen in pluripotenheidsregulering en het faciliteren van identificatie van kleine moleculair remmers die diverse cellulaire processen modificeren. Specifiek, we overwegen die toepassing van opkomende collecties van kleine moleculen zoals de epigeneTic probes die worden ontwikkeld door het Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) heeft de mogelijkheid om verdere nieuwe regelgevers van pluripotente transities te ontdekken.

Embryonale stamcellen (ESC&#39;s) hebben de capaciteit om zichzelf te vernieuwen of te onderscheiden in elk celtype in het volwassen lichaam, een fenomeen dat bekend staat als pluripotentie 1 . Recent bewijzen wijzen erop dat ontwikkelingsspecifieke pluripotente staten bestaan, genaamd &quot;naïeve&quot; en &quot;primed&quot; pluripotency 2 . Naïeve ESC&#39;s vertegenwoordigen een ontwikkelingsstaat die vergelijkbaar is met die in het preimplantatieembryo 3 . In tegenstelling hiermee zijn geperforeerde pluripotente ESC&#39;s klaar om pluripoten te verlaten en te onderscheiden in gespecialiseerde embryonale afstammingen 4 , 5 . Naïve en priide pluripotente staten worden gekenmerkt door verschillende genregulerende netwerken. Naïve pluripotency wordt gekenmerkt door expressie van belangrijke pluripotentie transcriptiefactoren zoals Nanog, Krueppel-achtige transcriptiefactoren (Klfs), Rex1 2 en Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. In muis-ESC&#39;s (mESC&#39;s) wordt geperfieerde pluripotency gekenmerkt door verminderde expressie van naïeve markers en een specifieke genuitdrukkingshandtekening die de de novo DNA-methyltransferase Dnmt3b 7 omvat . In vivo expressieert de geperforeerde pluripotente postimplantatie-epiblast stamcellen (EpiSCs) 4 , 5 ook de Epiblast-marker Fgf5 en markers van lineage priming zoals Brachyury 8 . MESC&#39;s verschaffen een tracteerbaar model om mechanismen te onderzoeken die naïef-primitieve pluripotente overgangen in vitro beheersen. Bij cultuur in leukemie-remmende factor (LIF) en foetaal runder serum (FBS) ondergaan mESCs een dynamische overgang tussen naïeve en priide pluripotente staten 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3 signaleringsfuncties om een ​​naïef genregulerend netwerk te bevorderen 11 </Sup&gt;, terwijl autocrine signalering via de fibroblastgroeifactor 4 (Fgf4) Erk1 / 2-weg de overgang naar de geperforeerde toestand 12 overbrengt. Het blijft echter een uitdaging om de rol van proteïnekinasen systematisch te evalueren bij het specificeren van verschillende pluripotente staten. Hier beschrijven we een kwantitatief en schaalbaar platform waarmee doelgerichte kleine molecuulschermen kunnen worden uitgevoerd voor kinase-regelaars van de naïeve-primed pluripotente overgang. We gebruiken eenvoudige mESC-cultuuromstandigheden en standaard reagentia, materialen en apparatuur om kinase-remmers te ontdekken en te valideren met tot nu toe onverminderd vermogen om naïeve pluripoten te stabiliseren. Daarnaast bespreken we mogelijke uitgebreide applicaties voor deze technologie, inclusief voor het screenen van andere kleine molecuulcollecties zoals opkomende inhibitorbibliotheken die epigenetische regulatoren richten.

<table><tbody><tr><td>mESC media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp;SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Eindconcentratie: 2 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Eindconcentratie: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Eindconcentratie: 0,1 mM</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td><td>MRC-PPU reagents and services</td><td></td><td>Eindconcentratie: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Eindconcentratie: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Eindconcentratie: 0,1 mM</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Eindconcentratie: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Eindconcentratie: 5%</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Eindconcentratie: 10%</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>TC-materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), fenol rood</td><td>Thermo</td><td>25300054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine uit varkenshuid</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-wells microplates</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bodem 96-wells platen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Lysebuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdeoxycholaat</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerofosfaat</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrofosfaat</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoride</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Complete Protease Inhibitor Cocktailtabletten</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Melkpoeder</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Western Blotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocellulose 0,45 &micro;M&nbsp; Poregrootte (20 cm x 20 cm vellen) (25 vellen)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Laboratoriumapparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I System</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Ezel anti-Konijn</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis-HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige methode om kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonale stamcellen (ESC&#39;s) kunnen zelf vernieuwen of differentiëren in alle celsoorten, een fenomeen dat bekend staat als pluripotentie. Bepaalde pluripotente staten zijn beschreven, genaamd &quot;naïeve&quot; en &quot;primed&quot; pluripotency. De mechanismen die de naïeve-gepresteerde overgang beheersen zijn slecht begrepen. In het bijzonder blijven we slecht geïnformeerd over proteïne kinasen die naïeve en priide pluripotente staten specificeren, ondanks de toenemende beschikbaarheid van hoogwaardige gereedschapverbindingen om de kinasefunctie te onderzoeken. Hier beschrijven we een schaalbaar platform om gerichte kleine molecuulschermen uit te voeren voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie in muis-ESC&#39;s. Deze aanpak maakt gebruik van eenvoudige celcultuuromstandigheden en standaard reagentia, materialen en apparatuur om kinaseremmers te ontdekken en te valideren met tot nu toe niet-gemarkeerde effecten op pluripotentie. We bespreken potentiële applicaties voor deze technologie, waaronder het screenen van ander klein molecuulCollecties zoals steeds meer geavanceerde kinaseremmers en opkomende bibliotheken van epigenetische hulpmiddelenverbindingen.

Met behulp van de hier geplaatste procedure ( Figuur 1 ), screenen we de LINCS-bibliotheek van 228 krachtige en selectieve kinase-remmers om degenen te identificeren die mESC pluripotency moduleren. De bibliotheek wordt bereid in een concentratie van 0,1 mM voor een verdunning van 1: 100 en eindscreening van 1 uM in mESC&#39;s. 48 uur later werden mESC&#39;s gelyserd en extracten bereid voor kwantitatieve dot blot analyse van Nanog en Dnmt3b expressie ( Figuur 2 , boven). Resultaten van andere screeningsconcentraties worden hier niet voor kortheid weergegeven. Nanog: Dnmt3b verhouding wordt bepaald voor elke kinaseremmer en verbindingen gerangschikt en een 2x cut-off is toegepast ( Figuur 2 , bodem). Totaal Nanog- en Dnmt3b-signaal ten opzichte van de controle wordt overgebracht op de ranglijst van de inhibitor en onderworpen aan een 0,5x cut-off, om trimmering van remmers mogelijk te maken die significante mESC toxiciteit vertonen. Selecteer kinaseremmers die de naïeve sta stabiliserenTe worden gevalideerd met behulp van conventionele Nanog / Dnmt3b immunoblotting ( Figuur 3 ). De primaire kinase doelen van deze remmers worden weergegeven in tabel 1 . We tonen ook de toepasbaarheid van dit scherm aan om remmers te identificeren die de primed toestand 14 stabiliseren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Figuur 1: Workflow voor het screenen van kinase remmers die naïeve-primed transitie moduleren. MESC werden behandeld met een 228 samengestelde kinase-inhibitor bibliotheek bij een uiteindelijke concentratie van 1 uM. Lysaten werden bereid en overgebracht op nitrocellulosemembranen voor immuno dot-blot analyse, en nanog en Dnmt3b niveaus bepaald (Figuur aangepast van Williams et al. 14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om al te zien</a><html> Arger versie van deze figuur. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Figuur 2: Naïeve-primed pluripotencyscreen analyse en inhibitor identificatie. (Top) Representatieve Nanog en Dnmt3b immunotip-blot beelden. (Bottom) Nanog- en Dnmt3b-waarden voor elke kinaseremmer werden bepaald ten opzichte van de DMSO-controle en de nanog: Dnmt3b-verhoudingen en het totale relatieve Nanog + Dnmt3b-signaal werden bepaald en de remmers werden gerangschikt in vergelijking met DMSO-controle. Inhibitors gevonden om de nanog: Dnmt3b verhouding te veranderen na een tweevoudige drempel boven of onder DMSO controle werden geïdentificeerd als bestuurders van naïeve of priide pluripotency. Een drempel van 2x onder DMSO-controle werd ingesteld op triage-remmers die het mESC-overleving in gevaar brengen. Inhibitors geselecteerd voor verdere validatie worden gemarkeerd. (Figuur aangepast van Williams et al., 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Figuur 3: Validatie van geselecteerde trefverbindingen geïdentificeerd. MESC&#39;s werden behandeld met ofwel 1 μM AZD4547 (een selectieve FGFR-remmer) of de aangegeven remmers geïdentificeerd uit het scherm in Figuur 2. Nanog: Dnmt3b niveaus bepaald door standaard SDS-PAGE en immunoblot analyse. Numerieke waarden van relatieve Nanog: Dnmt3b en Nanog + Dnmt3b zijn aangegeven in de onderstaande tabel, en remmers die de naïeve pluripotente toestand stabiliseren die in groen worden gemarkeerd. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> samenstelling </td><td colspan="2"> Primaire doelstellingen </td><td> Andere doelstellingen </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lek </td><td> src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR en TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1: Geselecteerde hitverbindingen en hun primaire kinase target (s).

Hier presenteren we een kwantitatief en schaalbaar protocol voor het uitvoeren van gerichte kleine molecuulschermen voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie.

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Het algemene doel van dit scherm is om kleine molecuul-eiwitkinaseremmers te identificeren die de pluripotentie van embryonale stamcellen moduleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van embryonale stamcelsignalering door het identificeren van nieuwe eiwitkinase-signaleringsroutes die de pluripotentie van embryonale stamcellen reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dus dat het scherm relatief eenvoudig uit te voeren is met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en gemakkelijk beschikbare reagentia.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat de meeste onderzoeken naar pluripotentie-signaleringsroutes volledig enorme golven van het kinome hadden genegeerd. Bereid gelatine-gecoate 10 centimeter schalen voor door vijf milliliter 0,1% gelatine toe te voegen aan 10 centimeter platen. Na vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur, aspireer de gelatine en laat de plaat twee minuten drogen.Plaat vervolgens een standaard muis ES-cellijn op de gecoate schalen in standaard muis ES-celmedium dat 100 nanogram per milliliter GST-gelabelde LIF, 10% foetaal runderserum en 5% knockout serumvervanger bevat. Kweek de cellen bij 37 graden Celsius 5%CO2 en ververs het medium elke dag. Passageer de muis ES-cellen bij ongeveer 80% confluency elke tweede dag door het medium af te aspireren en te wassen met vijf milliliter fosfaatgebufferd zout oplossing per plaat.Voeg vervolgens één milliliter trypsine EDTA per plaat van muis ES-cellen toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na incubatie, re-suspendeer de trypsiniseerd cellen in vier milliliter medium en centrifugeer de cellen bij 1200 RPM gedurende vijf minuten. Re-suspendeer het resulterende celpellet grondig in vijf milliliter medium, pipet omhoog en omlaag om een enkele celsuspensie te genereren.Tel de cellen door een 10 microliter celsuspensie te combineren met 10 microliter trypanblauw. Plaats het mengsel in een celtellingskamer of gebruik een hemocytometer en lichtmicroscoop. Zaai vervolgens 3000 muis ES-cellen in 0,1% gelatine-gecoate 96-well platen in een eindvolume van 100 microliter medium met behulp van een meerkanaals pipet.Breng vervolgens kinaseremmers aan bij een verdunning van één op honderd met behulp van een meerkanaals pipet. Pipet voorzichtig het medium om de remmer en celsuspensie te mengen. Laat vervolgens de cellen een uur in een weefselkweekkap rusten om een gelijkmatige verdeling over het oppervlak te garanderen.Kweek de cellen 48 uur zonder het medium te verversen. Om de screeningsanalyse te beginnen, was 96-well muis ES-cel platen in 200 microliter PBS met behulp van een meerkanaals aspirator en pipetten. Na het wassen, meng celextracten in 150 microliter lysebuffer.Verduidelijk de extracten door centrifugatie bij 1500 keer G gedurende 30 minuten in V-gevormde 96-well platen. Immobiliseer vervolgens 100 microliter supernatanten op een nitrocellulosemembraan met behulp van een 96-well vacuüm dot plot manifold. Droog het membraan en kleur met 40 milliliter Ponceau S om een consistente overdracht te garanderen.Na het wassen van het membraan met TBST, blokkeer het in TBST plus 3% melk. Bewaar vervolgens het membraan in Nanog en Dnmt3b antilichamen bij een verdunning van één op duizend in de blokkeringsbuffer overnacht. De volgende dag, was het membraan drie keer gedurende 10 minuten in TBST.Bewaar vervolgens het in 30 milliliter secundaire antilichamen bij een verdunning van één op tienduizend in blokkeringsbuffer. Ontwikkel het membraan met behulp van een digitaal immunoblotting beeldvormingssysteem. Het is van cruciaal belang om kinaseremmers die in het scherm zijn geïdentificeerd te valideren met behulp van conventionele immunoblotting voordat u verdergaat.Dit helpt om valse positieven te verwijderen voor verdere downstream-analyse. Analyseer de schermgegevens en valideer remmers als bonafide pluripotentieregulators zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier wordt een representatieve Nanog dot plot van het uitgevoerde scherm getoond.Positieve controleremmers die geprimede of naïeve pluripotentie aandrijven, worden gemarkeerd. Ook getoond is een representatieve Dnmt3b dot plot van het uitgevoerde scherm. Positieve controleremmers die geprimede of naïeve pluripotentie aandrijven, worden opnieuw gemarkeerd.In deze plot zijn de remmers gerangschikt op de Nanog tot Dnmt3b verhouding. Er is een tweevoudige Nanog tot Dnmt3b verhoudingsdrempel ingesteld om remmers te identificeren die naïeve of geprimede pluripotentie stabiliseren. De samengestelde Nanog en Dnmt3b signalen worden ook verstrekt.Daarnaast worden kinaseremmers geselecteerd voor verdere validatie vermeld. Hier wordt een conventionele immunoblot validatie van geselecteerde kinaseremmers, Nanog en Dnmt3b immunoblots, evenals de Nanog tot Dnmt3b verhouding en het totale signaal getoond. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kleine molecuulkinaseremmers kunt identificeren die de pluripotentie van embryonale stamcellen moduleren.Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 72 uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de kinase-signaleringsroutes die pluripotentie controleren, kan deze ook worden toegepast op embryonale stamceldifferentiatie en andere regulerende systemen zoals epigenetische modificatoren. Na de procedure kunnen andere bibliotheken van kleine molecuulremmers, zoals die welke gericht zijn op epigenetische modificatoren, worden gebruikt om nieuwe spelers in pluripotentieregulatie te identificeren.Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor ons onderzoeksgroep om nieuwe pluripotentie-signaleringsroutes te verduidelijken. We gebruiken deze techniek om een nieuwe rol voor de versterkte route bij het reguleren van pluripotentie te identificeren.

a-simple-method-to-identify-kinases-that-regulate-embryonic-stem-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.

Gewijzigd muis embryonale stamcellen gebaseerde test voor het kwantificeren van Cardiogene Inductie Efficiency

We beschrijven een methodiek combineert geautomatiseerde cel kweken met een hoog-content imaging te visualiseren en te kwantificeren meerdere cellulaire processen en structuren, in een high-throughput manier. Dergelijke methoden kunnen helpen bij de verdere functionele annotatie van genomen en te identificeren ziektegen netwerken en potentiële drug targets.

Hoog gehalte Screening bij neurodegeneratieve ziekten

We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

Hier presenteren we protocollen voor de cultuur van humane pluripotente stamcellen (hPSC), gebaseerd op het groeien van gedissocieerde enkele cellen in een niet-kolonietype monolaag (NCM). Deze nieuwe methode, die gebruik maakt van Rho-geassocieerde kinase remmers of de laminine isovorm 521 (LN-521), is geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSC's, genetische manipulatie en geneesmiddelontdekking.

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.

Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Het protocol in dit onderzoek beschrijft werkwijzen voor de real-time monitoring herprogrammering progressie via de kinetische meting van positieve en negatieve pluripotente stamcel markers gebruikt flowcytometrie analyse. Het protocol bevat ook de imaging-gebaseerde beoordeling van de morfologie, en merker of reporter expressie tijdens iPSC generatie.

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een platform voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van de leverziekte. Een stapsgewijze beschrijving wordt gepresenteerd detailing how to onderscheiden iPSCs in cellen met hepatocyte kenmerken in 96-wells-platen, en gebruiken van de cellen om te screenen op kleine moleculen met potentiële therapeutische activiteit.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Ontdek een high-throughput screeningsmethode voor kinase-inhibitoren die embryonale stamcelpluripotentie reguleren. Deze techniek identificeert nieuwe signaalroutes met standaard laboratoriumapparatuur.

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening (Video) | JoVE Journal

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Meer video's verkennen