Name: Turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: Het effect van de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF op collageen geïnduceerde aggregatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer turbidimetrie voor aggregatiemetingen van gewassen menselijke bloedplaatjes met de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF. Deze methode onderzoekt collageen-geïnduceerde aggregatie en helpt bij het begrijpen van bloedstollingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (310030_162579 / 1 tot Brenda Renata Kwak en 320030_144150 Pierre Fontana), alsmede door een subsidie ​​van de Zwitserse Hartstichting.

Vijf ongerelateerde gezonde vrijwilligers werden gerekruteerd voor het nemen van bloedmonsters voor bloedplaatjes isolatie en aggregatie testen. Schriftelijke informed consent werd verkregen en het protocol werd goedgekeurd door de centrale ethische commissie van de Universiteit van Genève Ziekenhuizen. Alle vrijwilligers gecertificeerd om gezond te zijn en hebben geen bloedplaatjes storende drugs genomen tijdens ten minste de 10 dagen voorafgaand aan de experimenten. 1. Buffer Voorbereiding voor Human Collection Blood and Gewassen bloedplaatjes Isolation <ol><li> Bereid een 100 ml waterige oplossing van zuur-citraat-dextrose (ACD) door het oplossen van 1,4 g citroenzuurmonohydraat (C 6 H 8 O 7 • H2O, 66,6 mmol), 2,5 g trinatriumcitraat dihydraat (Na 3C 6H 5 7 O • 2 H2O, 85 mM) en 2 g watervrij D (+) - glucose. De pH van de oplossing is ongeveer 4,5. </li><li> Bereid voorraad oplossingen voor buffer Tyrode als volgt<ol><li> Bereid voorraadoplossing 1 door oplossen van 80 g NaCl, 2 g KCI, 10 g NaHCO3 en 0,58 g NaH 2PO 4 * H2O in 500 ml gedestilleerd H2O De respectievelijke eindconcentraties zijn 2,73 M, 53,6 mmol, 238 mM en 8,4 mM. Bewaar de oplossing bij 4 ° C. </li><li> Bereid voorraadoplossing 2 door het oplossen van 10,15 g MgCl2 * 6 H2O (100 mmol) in 500 ml gedestilleerd H2O Bewaar oplossing bij 4 ° C. </li><li> Bereid voorraadoplossing 3 door het oplossen van 10,95 g (100 mmol) CaCl2 * 6 H2O in 500 ml gedestilleerd H2O Bewaar oplossing bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereid Tyrode-buffer door verdunning van 2,5 ml voorraadoplossing 1 in een eindvolume van 50 ml met gedestilleerd H2O Dit correspondeert met eindconcentraties van 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mmol NaHCO3 en 0,42 mM NaH 2PO 4 * H2O een pH 7,35 en steriliseer filtering met 0,22 um filters. </li><li> Bereid Tyrode-albumine 0,35% buffer (TA buffer 7) door het verdunnen 5 ml voorraadoplossing 1, 1 ml voorraadoplossing 2, 2 ml voorraadoplossing 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml 200 g / l humaan serumalbumine en 0,1 g watervrij D (+) - glucose in een eindvolume van 100 ml gedestilleerd H2O <ol><li> Breng de pH op 7,35 met 1 N HCl ingesteld en de osmolariteit tot 295 mOsm / l door toevoeging van gedestilleerd H2 O (10% van het totale volume). Eindconcentraties in deze oplossing zijn: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCI, 10,82 mmol NaHCO3, 0,38 mM NaH 2PO 4 * H2O, 0,91 mM MgCl2 * 6 H2O, 1,82 mM CaCl2 * 6 H2O . Houd TA buffer bij 37 ° C gedurende het gehele experiment. </li></ol></li></ol> 2. Bloedafname <ol><li> Verzamel 45-50 ml veneus bloed uit de antecubitale ader met behulp van een 19 G naald en geen of lage tourniquet, in 50 ml buizen conTaining ACD anticoagulant (1 volume ACD 6 volumina bloed). Gooi de eerste 1-2 ml bloed op de aanwezigheid van thrombine en weefselfactor voorkomen. <ol><li> Na het verzamelen, meng het bloed met de ACD door voorzichtig omkeren van de buis. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Bereiding van menselijke Gewassen bloedplaatjes <ol><li> Verwarm de centrifuge tot 37 ° C. Alle centrifugatiestappen hieronder worden uitgevoerd bij deze temperatuur. </li><li> Verzending van de verzamelde bloed in buizen van 15 ml (5 ml per buis) en gecentrifugeerd bij 250 xg gedurende 13 min PRP verkrijgen. Opmerking: Deze centrifugatiestap resulteert in de productie van drie lagen in de steekproef: 1) De bovenlaag, bestaande uit plasma, bloedplaatjes, en een klein deel van de witte bloedcellen. 2) De tussenlaag een deel rijk aan witte bloedcellen. 3) De onderste laag, die in hoofdzaak bestaat uit rode bloedcellen. </li><li> Verzamel de PRP door pipetteren de bovenste layer voorzichtig in een nieuwe buis van 15 ml tot maximaal verontreiniging te voorkomen met rode en witte bloedcellen, en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Centrifugeer de PRP bij 2200 xg gedurende 12 min (5 ml PRP). Opmerking: Deze centrifugatiestap worden uitgevoerd met lage rem of zonder rem. </li><li> Verwijder het supernatant (bloedplaatjes-arm plasma) en voorzichtig resuspendeer de pellet met 10 ml TA buffer met 2 pl / ml heparine (5000 U / ml) en 2,5 pl / ml 25 uM PGI2 met een plastic Pasteur pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 1900 xg (met lage rem of zonder rem). </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 5 ml TA buffer die 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 met een plastic Pasteur pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Gedurende de incubatieperiode Pipetteer 150 ul van de suspensie in bloedplaatjeseen 1,5 ml buis en tel plaatjes, onder toepassing van een geautomatiseerde celteller (die detecteert de grootte van bloedcellen door het meten van de veranderingen in de gelijkstroom weerstand). </li><li> Na 10 min incubatie, voeg 2,5 ul / ml 25 uM PGI2 de bloedplaatjessuspensie en onmiddellijk gecentrifugeerd bij 1900 xg gedurende 8 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet tot een concentratie van 250.000 bloedplaatjes / ul met een adequaat volume van TA buffer (dat wil zeggen als het celgetal 500.000 per uL, resuspendeer in 10 ml TA buffer) met 32 ul / ml apyrase 0.01 U / mL (uiteindelijke concentratie 0,32 U / ml). OPMERKING: Hoge concentratie van apyrase wordt gebruikt voor de desensibilisatie van P2X1 receptoren geïnduceerd door spontane afscheiding van ATP 10, 11 bij afwezigheid van agonisten te voorkomen. Dit is belangrijk omdat collageen geïnduceerde responsen geïnduceerd door snelle paracriene / autocriene activering van P2X1 door ATP vrijgegeven frOM geactiveerde bloedplaatjes. Indien de plaatjes signaleringsroute behoud van P2X1 functie niet kritisch vereist, gebruikt 0,02 U / ml apyrase. Verschillende studies (besproken in Mahaut-Smith et al. 10) toonde dat 0,02 U / ml apyrase vermijdt ADP receptor P2Y1 desensitisatie met verwaarloosbare P2X1 reacties. </li><li> Incubeer de celsuspensie gedurende ten minste 30 minuten bij 37 ° C alvorens de aggregometric metingen. Het preparaat is stabiel gedurende 5-8 uur. </li></ol> 4. aggregometrie <ol><li> Bereid fibrinogeen (56 mg / ml) in Tyrode&#39;s buffer. </li><li> Pipet 260 pi bloedplaatjes suspensie in glazen cuvetten (figuur 1A; links cuvet) bevattende 10 pl van fibrinogeen (56 mg / ml) en een magnetische roerstaaf, daarna incubeer de suspensie gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C in incubatie onderhavige putjes in de aggregometer (figuur 1B en 1C). </li><li> Pre-incubeer met de Panx1remmer Brilliant Blue FCF door toevoeging van 10 pi van een 2,8 mM of 28 mM voorraadoplossing (eindconcentratie 100 pM en 1 mM, respectievelijk) gedurende 7 minuten bij 37 ° C. </li><li> Kalibreer de aggregometer een assumptive 100% aggregatiewaarde door meten van de OD van een cuvette die 10 pi fibrinogeen (56 mg / ml), 10 pl Brilliant Blue FCF (2,8 mM of 28 mM) en TA buffer zonder bloedplaatjes. <ol><li> Plaats de cuvette in een combinatie goed onder automatisch roeren en op de betreffende toets op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer (dwz druk op F1 als aggregatie put 1 wordt gebruikt). LET OP: Deze hieronder beschreven experiment omvat Brilliant Blue FCF. De verbinding voor kalibratie moet worden aangepast aan de experimentele conditie. </li></ol></li><li> Kalibreer de aggregometer een assumptive 0% aggregatiewaarde door hetzelfde monster bloedplaatjes die wordt gebruikt voor het experiment onder automatische Stirring. <ol><li> Plaats de cuvette in de aggregatie goed en druk op de bijbehorende knop op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer. Wacht ongeveer 20-30 s voordat u verder gaat. Deze vertraging dient om ervoor te zorgen dat er geen aggregatie gebeurt voordat u de agonisten. OPMERKING: Aangezien verschillen in aantal plaatjes van invloed op de gemeten OD kan hebben, 0% ijkingsstap moet worden herhaald voor iedere afzonderlijke meting. </li></ol></li><li> Voeg 20 ul van gewenste agonist, bijvoorbeeld 15 ug / ml collageen (1 ug / ml eind) en 1,125 mM arachidonzuur (75 pM uiteindelijk) in de cuvette. Onmiddellijk start de opname onder voortdurend roeren automatisch door op de betreffende knop op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer. LET OP: De toevoeging van de agonist induceert activering van bloedplaatjes. Bloedplaatjes aggregaten kan duidelijk worden onderscheiden in het glas cuvet aan het einde van het experiment (figuur 1A; right cuvet). </li><li> De opname stopt automatisch na 6 min. Op dit punt, de gegevens opslaan door te klikken op het icoon te redden van de computer. Opmerking: De berekening van de snelheid van aggregatie wordt uitgevoerd door de computer, die de eindresultaten van het aggregatie proces als een percentage uitdrukt. </li><li> Analyseer de gegevens. <ol><li> Voor meer uitgebreide informatie over protocollen voor de bereiding van gewassen bloedplaatjes suspensies en turbidimetrische bepaling van bloedplaatjesaggregatie, verwijzen naar andere documenten geschreven door deskundigen op het gebied 12, 13. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+of+platelets+from+megakaryocyte+proplatelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets.</a> J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).</li>
<li>Andrews, R. K., Berndt, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15507277">Platelet physiology and thrombosis.</a> Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).</li>
<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li>
<li>Creager, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+the+CAPRIE+trial%3A+efficacy+and+safety+of+clopidogrel.+Clopidogrel+versus+aspirin+in+patients+at+risk+of+ischaemic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events.</a> Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).</li>
<li>Born, G. V., Cross, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14056485">The Aggregation of Blood Platelets.</a> J Physiol. 168, 178-195 (1963).</li>
<li>Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BPlatelet+aggregation%3A+a+tool+for+clinical+investigation+and+pharmacological+study+Methodology%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biol+Clin+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">[Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology].</a> Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).</li>
<li>Molica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+a+polymorphism+in+the+Pannexin1+gene+in+collagen-induced+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).</li>
<li>Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+human+platelet+activation+by+surface+pannexin-1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels.</a> J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).</li>
<li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+food+dye+FD%26C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).</li>
<li>Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2X1+receptor+and+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">The P2X1 receptor and platelet function.</a> Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).</li>
<li>Hechler, B., et al. <a target="_blank" href="http://jpet.aspetjournals.org/content/314/1/232">Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt].</a> J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Jarvis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation%3A+turbidimetric+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation: turbidimetric measurements.</a> Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).</li>
<li>Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+volume+changes+associated+with+light+transmittance+changes+in+the+platelet+aggregometer%3A+dependence+upon+aggregating+agent+and+effectiveness+of+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus.</a> Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).</li>
<li>Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+turbidity+to+the+stages+of+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation.</a> Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).</li>
<li>Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+platelet+aggregation+in+whole+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood.</a> Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).</li>
<li>Hayward, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+methods+for+determining+reference+intervals+for+light+transmission+platelet+aggregation+tests+on+samples+with+normal+or+reduced+platelet+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts.</a> Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).</li>
<li>Frelinger, A. L. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+function+tests%2C+independent+of+platelet+count%2C+are+associated+with+bleeding+severity+in%5BTitle%5D)+AND+%22ITP.+Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in.</a> ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).</li>
<li>Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+spontaneous+aggregation+in+platelet-rich+plasma+is+increased+in+habitual+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers.</a> Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).</li>
<li>Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+and+exercise+conditioning+on+blood+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).</li>
<li>Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregometry+detects+platelet+hyperreactivity+in+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals.</a> Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry%3A+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2013).</li>
<li>Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel+and+pannexin+channel+electrophysiology%3A+how+do+they+differ%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?</a> FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).</li>
<li>European Food Safety Authority. <a target="_blank" href="https://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/1853">Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive.</a> EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).</li>
<li>Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gel-filtered+human+platelets%3A+isolation+and+characterization+in+a+medium+containing+no+added+Ca2%2B%2C+Mg2%2B%2C+or+K%2B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+.</a> J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er is veel belangstelling voor het vinden van nieuwe geneesmiddelen in staat tot het moduleren van de functie van bloedplaatjes om trombose te voorkomen, zonder het verhogen van het risico van bloeden. Hiertoe kunnen in vitro laboratoriumtests die betrouwbaar en reproduceerbaar kunnen controleren aggregatie reacties bij menselijke bloedplaatjes absoluut noodzakelijk. Turbidimetrische aggregometrie is een eenvoudige techniek uit te voeren. Echter, moet een aantal voorzorgsmaatregelen in acht te worden gehouden. ...

Bloedplaatjes zijn essentiële bestanddelen van het bloed en hun belangrijkste functie-met-stollingsfactoren te stoppen met bloeden na bloedvat letsel. Bloedplaatjes zijn kleine (2-3 um) kernloze fragmenten verkregen van megakaryocyten van het beenmerg 1. Trombocyten circuleren in niet-geactiveerde toestand, waarbij ze als lensvormig structuren. Bij onderbreking van het endotheel, bloedplaatjes verzamelen op de site van bloedvat letsel aan het gat, een proces genaamd primaire hemostase plug. Aanvankelijk bloedplaatjes hechten aan sub-endotheliale moleculen zoals collageen en von Willebrand factor, die blootgesteld zijn als gevolg van de schade-adhesie stap 2. Vervolgens zij vorm veranderen en uitscheiden chemische boodschappers-activeringsstap. Tot slot hebben ze met elkaar te verbinden door het overbruggen van receptoren-aggregatie stap. Primaire hemostase wordt gevolgd door een secundair proces waarbij activering van de stollingscascade met fibrine depositie, welke stabiliserenTussen de eerste trombus 2. Acute ischemische gebeurtenissen zoals myocardinfarct 3 meestal het gevolg van trombi die worden gevormd door fysische verstoring (breuk) van een atherosclerotische plaque. Huidige anti-bloedplaatjes geneesmiddelen zijn de hoeksteen van de behandeling van deze wijdverspreide ziekte, maar hun klinisch voordeel wordt beperkt door een verhoogd risico op bloedingen. De meest voorgeschreven medicijnen cardiovasculaire patiënten, aspirine en anti-P2Y12 verbindingen, richten de tromboxaan A2 en ADP paden 4 getoond, die de belangrijkste routes die tot bloedplaatjes activering. Echter, innovatief onderzoek naar nieuwe targets die optimaal antitrombotische effecten en hemorragische risico zou in evenwicht te brengen is nog steeds noodzakelijk. Vanaf de jaren 1960 5 tot vandaag, heeft turbidimetrische aggregometrie een cruciale rol in het onderzoek gespeeld, het verbeteren van onze kennis van bloedplaatjes reactiviteit en in de monitoring van de potentie van anti-trombotische reagentia bij de mens. Turbidimetrie werd aanvankelijk toegevoerd aan PRP geëxtraheerd uit bloedmonsters. Inderdaad, bloedafname uitgevoerd in buisjes die citraat maakt een snelle en grote productie van PRP zonder enig effect op bloedplaatjes integriteit en functie. De stabiliteit op korte termijn (ongeveer 3 h) van PRP en de resterende plasmatische enzymen, zoals trombine, en de lage calciumconcentratie in verband met mogelijk artefact aggregatie profielen van groot ongemak voor de toepassing van PRP. Een belangrijke stap voorwaarts is de ontwikkeling van een methode voor bloedplaatjes isoleren met extra centrifugeren en wassen stappen 6 geweest. Kortom, PRP geïsoleerd uit volbloed on zuur-citraat-dextrose (ACD) en bloedplaatjes worden geïsoleerd na seriële centrifugatiestappen alvorens opnieuw gesuspendeerd in een iso-osmotische fosfaatbuffer (Tyrode&#39;s buffer) bevattende glucose, humaan serumalbumine en tweewaardige caties (Ca 2+ en Mg 2+). Om veranderingen in de bloedplaatjes reactiviteit te vermijden, wordt de pH van buffer Tyrode zorgvuldig bewaard bij 7,35-7,4. Bovendien wordt ongewenste activering van bloedplaatjes voorkomen door toevoeging van prostacycline (PGI2) vóór sommige centrifugatiestappen. Tenslotte toevoeging van apyrase gewassen plaatjes verhindert van resistent tegen de werking van ATP / ADP. De verkregen suspensie van bloedplaatjes mist coagulant factoren en de stabiliteit van bloedplaatjes met ten minste twee maal in vergelijking met PRP oplossingen. Bovendien, het feit dat bloedplaatjes inactief maar intact garandeert de reproduceerbaarheid van turbidimetrische metingen en biedt de mogelijkheid om de werking van agonisten of antagonisten van bloedplaatjesaggregatie optimaal bestuderen. Met deze methode, hebben we in een recent onderzoek dat remmen van de vorming van Panx1 kanalen van een genetische benadering (knock-out-muizen) of verlagen Panx1 kanaalactiviteit met farmacologischebenaderingen verlaagde collageen-geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie 7. Panx1 vormt ATP-afgifte kanalen, die alom tot expressie worden gebracht op vele celtypen waaronder menselijke bloedplaatjes 7, 8. In feite hebben we gedemonstreerd door turbidimetrie menselijke gewassen bloedplaatjes dat een 7 min voorincubatie met een panel van meer of minder specifieke chemische blokkers (probenecide, mefloquine en 10 Panx1 peptiden) voor de toevoeging van verschillende agonisten, remde het bijzonder collageen geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes terwijl bloedplaatjes reacties op AA en ADP niet werden getroffen. We hebben aangetoond dat ATP de afvoer via Panx1 kanalen specifiek ingrijpt in de GPVI signaleringsroute die leidt tot collageen-geïnduceerde aggregatie. Interessant meerdere FDA goedgekeurde verbindingen met toepassingen in andere ziekten (probenecid, mefloquine) invloed op de activiteit van Panx1 kanalen in bloedplaatjes. Aan de ene kant is dit opent nieuwe therapeutische perspectieven te selecterenively wijzigen bloedplaatjes reactiviteit. Aan de andere kant moet men mogelijke secundaire effecten van deze verbindingen te overwegen. In dit verband heeft de veilige voedselkleurstof Brilliant Blue FCF gebruikt op diverse snoep en energiedranken is beschreven als een selectieve remmer van Panx1 9. We beschrijven hier een protocol voor de isolatie van menselijke gewassen bloedplaatjes en turbidimetrische metingen van bloedplaatjesaggregatie ingericht om het effect van Brilliant Blue FCF kleurstof als een antagonist van plaatjesaggregatie onderzocht.

<table><tbody><tr><td>citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)</td><td>Roth</td><td>5949-29-1</td><td>gevaar voor oogbeschadiging/oogirritatie</td></tr><tr><td>trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td>-</td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>-</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>-</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>-</td></tr><tr><td>Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442909</td><td>gevaar voor oogbeschadiging/oogirritatie</td></tr><tr><td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>15630</td><td>-</td></tr><tr><td>human serum albumin</td><td>CSL Behring</td><td>00257/374</td><td>-</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Corrosiefd en irriterend voor de luchtwegen. Kan ernstige huid- en oogbeschadigingen veroorzaken.</td></tr><tr><td>Eppendorf 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>heparin</td><td>Drosspharm AG/SA</td><td>20810</td><td></td></tr><tr><td>prostacyclin I2 (PGI2)</td><td>Cayman</td><td>18220</td><td>-</td></tr><tr><td>apyrase from potatoes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td>-</td></tr><tr><td>fibrinogen (Haemocomplettan)</td><td>CSL Behring</td><td>HS 73466011</td><td>-</td></tr><tr><td>thrombo-aggragometer SD-Medical</td><td>SD-Innovation</td><td>TA8V</td><td>-</td></tr><tr><td>Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80717</td><td>Schadelijk voor aquatisch leven met langdurige effecten (Mijd vrijlating in het milieu)</td></tr><tr><td>collagen</td><td>Horm, Nycomed</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>arachidonic acid</td><td>Bio/Data corporation</td><td>C/N 101297</td><td>-</td></tr><tr><td>cell counter Sysmex KX-21N</td><td>Sysmex Digitana&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>-</td></tr><tr><td>glass cuvettes</td><td>SD-Innovation</td><td>THCV1000</td><td>-</td></tr><tr><td>magnetic stirrers</td><td>SD-Innovation</td><td>THA100</td><td>-</td></tr></tbody></table>

turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: het effect van de pannexin1-remmer brilliant blue fcf op collageen geïnduceerde aggregatie

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetrie is een laboratorium techniek die wordt toegepast op de aggregatie van bloedplaatjes gesuspendeerd in hetzij plasma (bloedplaatjes-rijk plasma, PRP) of in buffer (gewassen bloedplaatjes) meten met behulp van een of een combinatie van agonisten. Het gebruik van gewassen bloedplaatjes gescheiden van hun plasma omgeving en in de afwezigheid van anticoagulantia zorgt voor het bestuderen van de intrinsieke bloedplaatjes eigenschappen. Onder het grote paneel agonisten, arachidonzuur (AA), adenosine di fosfaat (ADP), trombine en collageen zijn de meest gebruikte. De aggregatie respons wordt gekwantificeerd door meting van de relatieve optische dichtheid (OD) in de tijd van bloedplaatjes suspensie onder voortdurend roeren. Bloedplaatjes in homogene suspensie beperking van de doorgang van licht na de toevoeging van een agonist, treedt bloedplaatjes vormverandering produceren een kleine tijdelijke stijging van OD. Na deze eerste activeringsstap bloedplaatjes stolsels vormen geleidelijk, waardoor de doorgang van licht door de suspensie als een result verminderde OD. De aggregatie uiteindelijk uitgedrukt als een percentage ten opzichte van de OD van bloedplaatjes-arm plasma of buffer. Strenge kalibratie is dus essentieel bij het begin van elk experiment. In het algemeen: 0% kalibratie wordt door meting van de OD van niet-gestimuleerde bloedplaatjes suspensie tijdens het meten van de OD van het suspensiemedium dat geen bloedplaatjes een waarde van 100% ingesteld. Plaatjesaggregatie wordt meestal voorgesteld als een real-time aggregatie curve. Turbidimetrie is een van de meest gebruikte laboratoriumtechnieken voor het onderzoek van de bloedplaatjes functie en wordt beschouwd als de historische gouden standaard en gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe farmaceutische middelen die gericht zijn op het remmen van de aggregatie van bloedplaatjes. We beschrijven gedetailleerde protocollen 1) Bereiding van humane plaatjes gewassen en 2) turbidimetrische analyse van door collageen geïnduceerde aggregatie van menselijke bloedplaatjes gewassen voorbehandeld met de voedselkleurstof Brilliant Blue FCF die onlangs identiteit wastificeerd als een remmer van Pannexin1 (Panx1) kanalen.

De aggregometer software produceert automatisch de aggregatie rondingen en geeft de waarden voor maximale aggregatie in percentage. De waarden kunnen met het oog op statistische analyses uit te voeren en te visualiseren maximale aggregatie waarden in de vorm van staafdiagrammen worden gekopieerd naar een data-analyse software. Eventueel kan elk individueel punt van de aggregatie krommen achtereenvolgens worden uitgevoerd in een spreadsheet software en statistische software (GraphPad ...

We beschrijven een eenvoudige methode voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, gevolgd door agonist-geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes metingen door turbidimetrie. Als voorbeeld passen we deze methode voor het bestuderen van aggregatie van humane bloedplaatjes aan collageen na voorincubatie met Pannexin1 kanaal remmer Brilliant Blue FCF.

Turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: Het effect van de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF op collageen geïnduceerde aggregatie

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een eenvoudige methode voor de isolatie van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, gevolgd door metingen van agonist-geïnduceerde plaatjesaggregatie via turbidimetrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de biologie van menselijke bloedplaatjes, zoals de effecten van pannexine-1-inhibitie op agonist-geïnduceerde plaatjesaggregatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel en eenvoudig uit te voeren is, terwijl het een betrouwbare en reproduceerbare monitoring van aggregatiereacties mogelijk maakt.Lichttransmissie-aggregometrie wordt niet alleen voor onderzoeksdoeleinden gebruikt, maar ook voor het onderzoek van de plaatjesfunctie bij patiënten met bloedingsstoornissen. Los eerst 1,4 gram citroenzuurmonohydraat, 2,5 gram trisodiumcitraatdihydraat en twee gram watervrije D-glucose op in gedestilleerd water om 100 milliliter van een ACD-oplossing met een pH van ongeveer 4,5 te bereiden. Bereid vervolgens Tyrode-buffer door 2,5 milliliter van de stokoplossing te verdunnen tot een eindvolume van 15 milliliter gedestilleerd water.Stel de pH in op 7,35 door toevo

turbidimetry-on-human-washed-platelets-effect-pannexin1-inhibitor

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De hechting van bloedplaatjes cascade vindt plaats in het bijzijn van shear flow, een factor niet goed voor in conventionele (statisch) goed-plaat assays. In dit artikel wordt verslag gedaan van een bloedplaatjes-aggregatie assay gebruik maakt van een microfluïdisch goed plaat formaat om fysiologische afschuifstroming omstandigheden na te bootsen.

Bloedplaatjes adhesie en aggregatie Onder Flow met behulp van Microfluïdische Flow Cellen

This video demonstrates the method to assess the impact of shear stress on platelets. Antibody treatment induces dissociation and conformational changes in mechanoreceptor complexes, activating the platelets and expressing markers on the surface. These markers are observed via immunostaining and flow cytometry.

The Effects of Shear Stress on Platelets Treated with Antibodies Against Mechanosensory Receptors

This video demonstrates turbidimetric analysis to assess collagen-induced platelet aggregation in pre-treated, washed human platelets. Control wells show collagen-induced aggregation, whereas a high concentration of inhibitors blocks Pannexin-1 channels, thereby inhibiting collagen-induced platelet aggregation,  evident from unchanged turbidity.

A Turbidimetric Analysis to Monitor Collagen-Induced Aggregation of Pretreated Human Platelets

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

We beschrijven een in-oplossing methode om uniforme shear toe te passen op bloedplaatjes oppervlak receptoren met behulp van Cone-plate viscosimeter. Deze methode kan ook breder worden gebruikt om shear toe te passen op andere cel types en cel-fragmenten en hoeft niet te richten op een specifieke ligand-receptor paar.

Een uniform shear assay voor menselijke bloedplaatjes en cel oppervlakte receptoren via Cone-plate viscosimeter

Er wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor het in beeld brengen van enkelvoudig migrerende bloedplaatjes met behulp van RGD-gefunctionaliseerde avidine-biotinebindingen met instelbare dichtheid, waaruit blijkt dat bloedplaatjes voldoende kracht genereren om de avidine-biotinebinding te verbreken.

Een in vitro test om de migratie van bloedplaatjes te bestuderen met behulp van RGD-gefunctionaliseerde avidine-biotine-tethers

De vorming van procoagulerende bloedplaatjes is gecorreleerd met een verhoogd risico op trombose. Hier wordt een nauwkeurig protocol gepresenteerd voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, bedoeld om de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels te kwantificeren, die onderscheidende kenmerken zijn van procoagulerende bloedplaatjes.

Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes door meting van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes uit menselijke gezuiverde bloedplaatjes

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Het metabolisme van bloedplaatjes is van belang, vooral omdat het betrekking heeft op de rol van hyper- en hypoactiviteit van bloedplaatjes bij bloedingen en trombotische aandoeningen. Het isoleren van bloedplaatjes uit plasma is noodzakelijk voor sommige metabole testen; Hier wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van intracellulaire metabolieten uit gewassen bloedplaatjes.

Preparaat van gewassen menselijke bloedplaatjes voor kwantitatieve metabole fluxstudies

Meerkleurige flowcytometrie voor bloedplaatjes kan nieuwe subtypes van bloedplaatjes identificeren binnen klassieke subpopulaties van bloedplaatjes, zoals rust-, aggregatoire, procoagulerende en apoptotische bloedplaatjes. Dit maakt het mogelijk om verschillende subpopulatiepatronen te vergelijken die worden geïnduceerd door verschillende bloedplaatjestagonisten. Hier wordt een procedure voor het opstellen van een meerkleurig flowcytometriepaneel in detail beschreven.

Analyse van subpopulaties van bloedplaatjes door middel van meerkleurige flowcytometrie

Het huidige protocol biedt een uitgebreide reeks procedures die nodig zijn om procoagulerende bloedplaatjes te analyseren, die overlappende kenmerken van necrose, apoptose en activering van bloedplaatjes vertonen.

Uitgebreide analyse van procoagulerende bloedplaatjes die kenmerken van necrose, apoptose en activering van bloedplaatjes vertonen

Leer turbidimetrie voor aggregatiemetingen van gewassen menselijke bloedplaatjes met de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF. Deze methode onderzoekt collageen-geïnduceerde aggregatie en helpt bij het begrijpen van bloedstollingsmechanismen.

Turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: Het effect van de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF op collageen geïnduceerde aggregatie (Video) | JoVE Journal

Turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: Het effect van de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF op collageen geïnduceerde aggregatie

Meer video's verkennen