Name: CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer de CAPRRESI-methode voor het efficiënt fuseren van eiwitcoderende genen via restrictie-enzymsites in synonieme DNA-sequenties. Dit protocol biedt een snelle en kosteneffectieve aanpak voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia en Tecnología, CONACYT, México (subsidie ​​nummer 154833) en Universidad Nacional Autónoma de México. De auteurs bedanken Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos en Soledad Juárez voor hun administratief en technisch advies.

1. CAPRRESI Protocol OPMERKING: Figuur 1 staat voor het algemene CAPRRESI protocol. Deze techniek is gebaseerd op een silico- ontwerp en de daaropvolgende constructie van de gewenste chimeras. <ol><li> Selectie van het kloneringsplasmide, pUC18 of pUC19. <ol><li> Selecteer de pUC vector die het beste past bij de technische eisen. OPMERKING: Beide vectoren hebben dezelfde volgorde, behalve de oriëntatie van de meervoudige kloneringsplaats. Dit is belangrijk voor het ontwerpen van oligonucleotiden en de PCR plasmidestoring. </li></ol></li><li> In silico analyse van de wildtype genen en pUC18 / 19 sequenties. <ol><li> Verkrijg de DNA sequenties van de wildtype genen en sla ze op in een FASTA formaat bestand ( bv genes.fas). OPMERKING: De sequenties van pUC18 / 19 vectoren bevinden zich in het pUC.fas bestand ( Figuur 1 , stap 1). </li><li> Bepaal welke beperking enzYmes snijd de wildtype genen en pUC18 / 19 sequenties niet door het script REsearch.pl te draaien. Alternatief, voer een zoekopdracht met restrictie-enzym site uit met een online tool ( Figuur 1 , stap 2). <ol><li> Typ het volgende in een terminal: Perl REsearch.pl genes.fas Perl REsearch.pl pUC.fas OPMERKING: Deze commando&#39;s maken de volgende uitvoerbestanden: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas en pUC_re.fas. </li><li> Selecteer de juiste restrictie-enzymen voor het klonen van de wildtype genen in de meerdere kloneringsplaats van de gekozen pUC18 / 19-vector door de genes_re.fas- en pUC.fas-bestanden te vergelijken. Kies de oriëntatie van het inzetstuk in relatie tot het ampicilline resistentie gen ( ampR ) van de pUC18 / 19 vector. </li></ol></li><li> Ontwerp voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden om het coderende gebied van de wildtype genen (externe oligonucleotiden) te amplificeren. Inclusief de juiste restrictie-enzymplaats bij elk 5&#39;-uiteindeVan de oligonucleotiden; Hiermee wordt de invoeghoek geformuleerd. <ol><li> Inclusief een functionele ribosoom bindingsplaats in de voorwaartse oligonucleotiden. </li><li> Leg beide wildtype genen in dezelfde richting in de vector in. </li></ol></li></ol></li><li> Selectie van de breekgebieden voor chimera assemblage en plasmid ontwrichting. <ol><li> Verkrijg de aminozuursequentie van de wildtype en de ampR genen door het translate.pl script te gebruiken ( Figuur 1 , stap 3). <ol><li> Typ het volgende in een terminal: Perl translate.pl genes.fas Perl translate.pl ampR.fas OPMERKING: dit script creëert de volgende uitvoerbestanden: genes_aa.fas en ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> Globaal uitlijnen de twee wildtype aminozuursequenties met een passende software ( bijvoorbeeld MUSCLE) 9 . </li><li> Selecteer de gewenste pauze gebieden (3-6 aminozuren) voor chimera asMbly op basis van de volgorde uitlijning. Sla ze op in een bestand in FASTA-formaat ( bijv . , Regions.fas). </li><li> Bepaal de DNA sequenties die codeert voor het geselecteerde aminozuur op beide wildtype genen. </li></ol></li><li> In silico generatie van synoniem DNA sequenties die restrictie-enzym sites bevatten. <ol><li> Verkrijg alle synoniem-DNA-sequenties die codeert voor elke aminozuursequentie die is geselecteerd als breekstreken ( Figuur 1 , stap 4); Deze sequenties werden opgeslagen in het regions.fas bestand. <ol><li> Typ het volgende in een terminal: Perl synonym.pl regions.fas OPMERKING: dit script zal het output_bestand regions_syn.fas maken. </li></ol></li><li> Zoek naar restrictie-enzymplaatsen die gevonden worden op synoniem-DNA-sequenties. <ol><li> Typ het volgende in een terminal: perl REsynonym.pl regions_syn.fas OPMERKING: dit script zal het output_bestand regions_syn-re.fas maken. </li></ol></li><li> Kies een restrictie-enzym dat wordt gedeeld tussen synonieme sequenties van beide wildtype genen; Deze site zal worden gebruikt om chimeren te construeren via restrictie enzym digestie. Controleer dat het gekozen restrictie-enzym geen van de wildtype genen noch de pUC18 / 19 vectorsequenties snijdt. <ol><li> Vergelijk de restrictie-enzymen die gevonden zijn in de genes_re.fas-, pUC_re.fas- en regions_syn-re.fas-bestanden. </li></ol></li><li> In silico vervangt de originelen voor hun synoniem DNA sequenties op de overeenkomstige loci op beide wildtype genen. Voeg synoniem-DNA-sequenties toe in het wildtype sequentiebestand (genes.fas). </li><li> Krijg de aminozuursequentie van genen die aanwezig zijn op het genes.fas bestand ( perl translate.pl genes.fas ). </li><li> Richt de aminozuursequenties die zijn vertaald van wildtype- en synoniem-DNA-sequenties uit. Controleer of beide sequenties hetzelfde zijn. </li><li> Herhaal alle stappen van dit gedeelte met het aanwezige ampR- gen op de pUC18 / 19 vector. OPMERKING: Het doel is om het ampR- gen (bestand ampR.fas) te verstoren in twee complementaire onderdelen. Het restrictie-enzym dat is geselecteerd om het ampR- gen te verstoren, moet verschillen van die welke gebruikt wordt voor chimera-assemblage. </li></ol></li><li> Onafhankelijke kloning van de twee wildtype genen in de geselecteerde pUC18 / 19 vector (Figuur 1, stap 3). <ol><li> Zuiver het gekozen pUC18 / 19 plasmide DNA met behulp van een plasmide DNA zuiveringsset. <ol><li> Bijvoorbeeld transformeer E. coli DH5a met pUC18 plasmide en groei de transformanten &#39;s nachts bij 37 ° C op vaste LB-0,3 mg / ml ampicilline (Amp). Kies een transformantkolonie, injecteer een nieuwe LB-0.3 mg / mL Amp-plaat, en groei het overnacht bij 37 ° C. </li><li> Neem deel uit van de vorige cultuur en groei het in vloeibare LB-0.3 mg / mL Amp gedurende 6-8 uur bij 37 ° C. Extracteer het plasmide-DNA met behulp van een kit. </li></ol></li><li> PCR amplificeert wildtype genen uit het totale genomische DNA met behulp van de appropRiate externe oligonucleotiden. Gebruik zo mogelijk een hoogwaardig DNA-polymerase. Selecteer het DNA-polymerase dat de opbrengst maximaliseert. Voer PCR uit volgens de richtlijnen van de fabrikant en de smeltemperatuur van de oligonucleotiden. <ol><li> Run PCR cycli, afhankelijk van het DNA polymerase, amplicon grootte, template en oligonucleotiden gebruikt. Om bijvoorbeeld rpoD DNA te amplificeren, berekent u een 50 μL reactie: 5 μl 10x buffer, 2 μl 50 mM MgS04, 1 μl 10 mM dNTP-mix, 2 μl van elk 10 μM oligonucleotide (tabel 2), 2 ΜL template DNA ( E. coli DH5a totaal DNA), 35,8 μl ultrazuiver water en 0,2 μl hoogwaardig DNA-polymerase. Voer de volgende PCR cycli uit: 1 minuut bij 94 ° C voor de initiële denaturatie gevolgd door 30 cycli van amplificatie (30 s bij 94 ° C tot denaturatie, 30 s bij 60 ° C om de oligonucleotiden te ontlasten en 2 min bij 68 ° C uit te breiden). </li><li> Oplossen 1,2 g vanAgarose in 100 ml dubbel gedestilleerd water door ze te verwarmen in de magnetron. Monteer een gelbak en kam en zet ze in de horizontale gelaster. Vul de gelbak met de gesmolten agaroseoplossing en laat het stollen. Verwijder de kam. </li><li> Plaats de gel in de elektroforese kamer. Vulkamer met 1x Tris-acetaat-EDTA buffer. Laad 50 μl PCR-producten in de gelputten. Elektroforeseer de monsters ( bijv . Bij 110 V gedurende 1 uur). </li><li> Na elektroforese vlek de gel in 100 ml dubbel gedestilleerd water met 100 μl 1 mg / ml ethidiumbromide oplossing gedurende 10 minuten met langzaam schudden. Was de gel in tweedestilleerde water gedurende nog eens 10 minuten in trage schudden; Gebruik een horizontale shaker. Let op: Ethidiumbromide is een giftige verbinding; Draag beschermende handschoenen en een katoen laboratoriumjas. </li><li> Reinig wildtype gen DNA uit de overeenkomstige banden van de gel met behulp van een kit. Visualiseer de bands door de gekleurde gel in een UV-kamer te plaatsen (Aanbevolen golflengte: 300 nm). Bewaar de blootstelling van de gel tot een minimum. Gebruik een DNA-zuiveringsset en volg de instructies van de fabrikant. Let op: UV-straling is gevaarlijk; Draag een beschermend schild, een bril en een katoenlaboratoriumjas. </li></ol></li><li> Digest gezuiverde wildtype genen en pUC18 / 19 plasmide DNA met de restrictie enzymen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik zo snel mogelijk spijsverteringsenzymen. Bijvoorbeeld verteer 6 μL pUC18 DNA (300 ng / μL) in 10 μl ultrauw water, 2 μl 10X buffer, 1 μl Kpn I restrictie enzym en 1 μl Xba I restrictie enzym. Laat de reactie gedurende 30 minuten bij 37 ° C achter. <ol><li> De restrictie-enzymen inactiveren volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bijvoorbeeld, de dubbele spijsvertering reactie Kpn I- Xba I bij 80 ° C gedurende 5 minuten inactiveren. </li></ol></li><li> Mix insert: vector DNA bij een volumetrische ratiO van 3: 1. Volg de instructies van de fabrikant voor een ligatie reactie. Gebruik zo snel mogelijke ligatie enzymen (laat de reactie bij 25 ° C gedurende 10 minuten). OPMERKING: Typisch is de DNA-concentratie na zuivering met behulp van de kits goed genoeg voor spijsvertering en ligatie reacties. Voeg bijvoorbeeld 6 μL rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 3 μl pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 10 μl 2x buffer, 1 μl ultrapure Water en 1 μl T4 DNA ligase. Laat de ligatie reactie bij 25 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Transformeer de E. coli DH5a met 2-4 μl van de ligeringsreactie, zoals beschreven in het Aanvullende Materialen. Platte de getransformeerde cellen in solide LB / Amp / X-gal / IPTG platen. Laat de platen overnacht bij 37 ° C. </li><li> Selecteer witkleurige transformant E. coli kolonies en streep ze op een nieuwe LB / Amp plaat. Laat de borden overnacht bij 37 ° C liggen. &lt;/ Li&gt; <li> Voer een koloniale PCR uit om kandidaten te kiezen voor het sequentiëren van de reactie, zoals beschreven in het Aanvullende Materialen. Extracteer plasmide DNA uit kandidaten. Alternatief verteer kandidaat plasmide DNA met dezelfde restrictie enzymen gebruikt voor het klonen van de inserts. </li><li> Sequentie kandidaat constructies met een sequencing service provider 10 . Monteer de sequentie in silico met behulp van een DNA assembler 11 ( Figuur 1 , stap 5). </li></ol></li><li> Plasmidafbreking door PCR, gevolgd door restrictie-enzymvertering. <ol><li> Ontwerp in silico voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden bij pauze gebieden voor respectievelijk wildtype en ampR genen. Vervang in silico het wildtype fragment voor de overeenkomstige synoniem-DNA-sequentie (verkregen in stap 1.4). OPMERKING: Deze synoniem-DNA-sequentie bevat een restrictie-enzymplaats. Voorwaartse en omgekeerde oligonucleotiden overlappen bij tHij restrictie enzym site. Oligonucleotiden moeten variëren van 21-27 nucleotiden, eindigen met een cytosine of guanine, en bevatten een restrictie-enzymplaats. Een voorwaartse oligonucleotide heeft dezelfde sequentie als zijn doelgebied op het template DNA. Een omgekeerd oligonucleotide is de omgekeerde complementaire sequentie van het doelgebied op het template DNA. </li><li> Gebruik de twee wildtype genconstructies als het DNA-sjabloon voor PCR-reacties ( bijv. PUC18 rpoD en pUC18 sigA ). Verkrijg twee complementaire delen van elke constructie (pUC18 rpoD σ1 -σ2, pUC18 rpoD σ3 -σ4, pUC18 sigA σ1 -σ2 en pUC18 sigA σ3-σ4) ( Figuur 1 , stap 6). </li><li> Laad DNA-monsters in een agarosegel 1-1,2% [w / v]. De PCR-producten scheiden van de DNA-sjabloon door elektroforese ( bijv. 110 V gedurende 1 uur). Alternatief, verteer de PCR-reacties met Dpn I om de DNA-sjabloon te breken. OPMERKING: DpnIk enzym herken slechts gemethyleerde DNA sequenties (5&#39;-GATC-3 &#39;). <ol><li> Zuiver de monsters met behulp van een DNA zuiveringsset. Volg de richtlijnen van de fabrikant. </li></ol></li><li> Dubbele verteer alle complementaire DNA-fragmenten met de juiste restrictie-enzymen volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik, indien mogelijk, snel-verterende restrictie-enzymen. Dubbele verteer het pUC18rpoDσ1-σ2 DNA fragment met Afl II en Spe I met behulp van het protocol van de fabrikant. Laat de spijsverteringsreactie bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> De restrictie-enzymen inactiveren volgens de richtlijnen van de fabrikant. Bijvoorbeeld, inactiveer Afl II- Spe I bij 80 ° C gedurende 20 minuten. </li></ol></li><li> Plasmideherstel met behulp van DNA-ligatie en bacteriële transformatie. <ol><li> Meng de juiste DNA-fragmenten in een volumetrische verhouding van 1: 1 om het gewenste chimere gen te assembleren ( Figuur1, stap 7). OPMERKING: Op deze manier wordt de integriteit van het ampR- gen hersteld, waardoor een functioneel eiwit wordt geproduceerd. <ol><li> Meng bijvoorbeeld 4 μL pUC18 rpoD σ1 -σ2 DNA (verteerd met Afl II- Spe I, 150 ng / μl), 4 μl pUC18 sigA σ3-σ4 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μl), 10 μl 2x buffer, 2 μl ultrapure water en 1 μl T4 DNA ligase; De DNA-concentratie na de zuivering van de kit is goed genoeg voor de spijsvertering en de daaropvolgende ligatie. Laat de ligeringsreactie bij 25 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol></li><li> Transformeer E. coli DH5a met 3-5 μl van de chimera assemblage ligatie reactie (Aanvullende Materialen). Groei de transformantcellen in LB / Amp / X-gal / IPTG-platen overnacht bij 37 ° C overnacht. </li><li> Selecteer witkleurige transformant E. coli kolonies en streep ze op een nieuwe LB / Amp plaat. Laat de borden overnacht op 37° C. </li><li> Voer een kolonie-PCR uit om kandidaten te kiezen voor een sequentierespons, zoals beschreven in de aanvullende materialen. Visualiseer bands in een 1-1,2% (w / v) agarosegel door elektroforese te verrichten (beschreven in stap 2.3.2.1). </li><li> Kweek culturen van positieve kandidaten. Extract plasmide DNA van hen met behulp van een plasmide DNA zuivering kit. </li></ol></li></ol> 2. Sequence Kandidaat Chimere Constructies <ol><li> Zorg ervoor dat de kwaliteit van het plasmide-DNA goed genoeg is voor de sequentiereactie door richtlijnen van de sequentie dienstverlener te volgen. Extract DNA met behulp van zuiverings kits. Bijvoorbeeld, op de internetpagina van de sequentieverlener, speciale aandacht besteden aan de aanbevolen DNA-concentratie voor de monsters. Verkrijg de concentratie van monsters met behulp van een DNA-kwantificeringsinstrument. </li><li> Sequentie kandidaat chimere constructies met een sequencing service provider 10 . </li><li> Assemble se<html> Quencing leest met een in silico DNA assembler 11 . </li><li> Uitgelijnd gemonteerd versus in silico- ontworpen chimere sequenties met behulp van sequentie-uitlijngereedschappen 9 , 12 . Controleer of het chimere gen succesvol is gesmolten. </li></ol> 3. Voorbereidingen maken OPMERKING: Alle stappen die levende cellen betreffen, dienen in een schone laminarstroomkap met de Bunsen-brander te worden uitgevoerd. <ol><li> Het produceren van E. coli DH5a-bevoegde cellen. <ol><li> Om E. coli -competente cellen te produceren, volgt u gepubliceerde protocollen 13 of zie de aanvullende materialen . Alternatief gebruik commercieel beschikbare bevoegde cellen. </li></ol></li><li> Transformeren van E. coli DH5a-bevoegde cellen. <ol><li> Voor de chemische transformatie van E. coli culturen, volg de gepubliceerde protocollenClass = &quot;xref&quot;&gt; 13 of zie de aanvullende materialen . Alternatief gebruik elektroporatie voor bacteriële transformatie. Als er gebruik wordt gemaakt van commercieel beschikbare bevoegde cellen, volg de richtlijnen van de fabrikant. </li></ol></li><li> Het zuiveren van genomisch en plasmide DNA van E. coli DH5a. <ol><li> Voer nucleïnezuurxtractie uit, zoals vermeld in de aanvullende materialen , met gebruik van commercieel verkrijgbare kits of volgende gepubliceerde protocollen 13 . </li></ol></li><li> Voer kolonie-PCR uit. <ol><li> Gebruik deze techniek om kandidaat-transformantkolonies te identificeren voor de volgende sequentiereactie. OPMERKING: Deze methode vertegenwoordigt geen definitieve verificatie van de integriteit van de sequenties. Een gedetailleerde beschrijving van deze techniek is beschikbaar in de aanvullende materialen . </li></ol></li><li> De oplossingen voorbereiden. <ol><li> Zien <sTrong&gt; Tabel 1 voor meer informatie over het oplossen van de oplossing. </li></ol></li><li> Download de scripts en volgordebestanden die nodig zijn voor het CAPRRESI-protocol. <ol><li> Download genbank bestanden die de volledige genoomsequentie van de gewenste soort bevatten, verwijder de DNA sequentie van het gekozen gen met behulp van een genoom browser en sla het op in fasta bestandsformaat. Download de Perl-scripts die nodig zijn voor het CAPRRESI-protocol. Bewaar de scripts en de volgordebestanden in dezelfde map. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Vos, M. J., Kampinga, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR+amplification+strategy+for+unrestricted+generation+of+chimeric+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes.</a> Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).</li>
<li>Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Precise+GFP+Fusions+in+Plasmids+Using+Yeast+Homologous+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination.</a> Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+The+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+improved+M13+vectors+using+oligodeoxynucleotide-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.</a> Gene. 26 (1), 101-106 (1983).</li>
<li>Gruber, T. M., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sigma+subunits+and+the+partitioning+of+bacterial+transcription+space%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space.</a> Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li>
<li>Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp">http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp</a> (2016).</li>
<li>Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.chevreux.org/thesis/index.html">http://www.chevreux.org/thesis/index.html</a> 1-161 (2005).</li>
<li>Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+alignment+using+ClustalW+and+ClustalX%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.molecularcloning.com/">Molecular Cloning: A laboratory manual.</a> CSHLP. , (2001).</li>
<li>Rutherford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artemis%3A+sequence+visualization+and+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Artemis: sequence visualization and annotation.</a> Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

CAPRRESI is ontworpen als een alternatief voor de PRM 2 . De originele PRM is een krachtige techniek; Het maakt het mogelijk de DNA-sequenties te combineren langs elk deel van de geselecteerde genen. Voor PRM moeten wildtype genen in hetzelfde plasmide worden gekloneerd. Daarna worden oligonucleotiden ontworpen binnen wildtype en antibiotica resistentie genen gevonden op het plasmide. Plasmidafbreking wordt bereikt door PCR met behulp van stompe, hoogwaardige DNA-polymerasen en eerder ontworpen o...

Chimerische gensamenstelling is veel gebruikt in moleculaire biologie om eiwitfunctie en / of biotechnologische doeleinden te verklaren. Verschillende methoden bestaan ​​voor het smelten van genen, zoals overlappende PCR product amplificatie 1 , plasmide recovery 2 , homologe recombinatie 3 , CRISPR-Cas9 systemen 4 , site gerichte recombinatie 5 en Gibson assemblage 6 . Elk van deze biedt verschillende technische voordelen; Bijvoorbeeld de flexibiliteit van overlappende PCR-ontwerpen, de in vivo selectie van constructies tijdens plasmideherstel, of het hoge efficiëntie van CRISPR-Cas9 en Gibson systemen. Aan de andere kant kunnen sommige moeilijkheden optreden tijdens het uitvoeren van sommige van deze methoden; Bijvoorbeeld zijn de eerste twee benaderingen gebaseerd op stompe DNA-fragmenten, en ligatie van deze typen producten kan technisch uitdagend zijn in vergelijking met sticKy-ended ligatie. Site-gerichte recombinatie kan sporen van extra DNA-sequenties (littekens) op het origineel achterlaten, zoals in het CrexloP-systeem 5 . CRISPR-Cas9 kan in aanvulling op de doelplaats 4 soms andere genoomgebieden wijzigen. Hier introduceren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinvoeging (CAPRRESI), een protocol voor het smelten van proteïne-coderende genen die de plasmideherstelmethode (PRM) combineren met de insertie van restrictie-enzymplaatsen op synoniem-DNA-sequenties, het verbeteren van de ligatie-efficiëntie . Om de aminozuursequentie integriteit te waarborgen, worden restrictie-enzymplaatsen ingevoegd op synoniem-DNA-sequentiestrektes. Onder de voordelen van CAPPRESI is dat het kan worden uitgevoerd met behulp van gewone laboratoriumreagentia / gereedschappen ( bijv . Enzymen, bevoegde cellen, oplossingen en thermocycler) en dat het snelle resultaten kan geven (wanneer de juiste enzymen worden gebruikt). Vertrouwen op beperkingEnzym sites die voortkomen uit synonieme DNA sequenties kunnen de selectie van de exacte fusiepunten binnen de eiwitten van belang beperken. In dergelijke gevallen moeten doelgenen worden gefuseerd met behulp van overlappende oligonucleotiden, en restrictie-enzymplaatsen moeten op het weerstandgen van de vector worden ingebracht. CAPRRESI bestaat uit zeven eenvoudige stappen ( Figuur 1 ): 1) selectie van de kloningsvector, pUC18 of pUC196; 2) in silico analyse van de wildtype sequenties die gefuseerd moeten worden; 3) selectie van breekgebieden voor chimera assemblage en plasmid ontwrichting; 4) in silico generatie van synoniem-DNA sequenties die restrictie-enzym sites bevatten; 5) onafhankelijk klonen van de wildtype genen in het geselecteerde plasmide; 6) plasmidestoring door PCR, gevolgd door restrictie-enzymvertering; En 7) plasmideherstel met behulp van DNA-ligatie en bacteriële transformatie. Chimerische genen geproduceerd door deze techniek moeten worden gecontroleerd wIn sequentiebepaling. De vectoren pUC18 / 19 bieden technische voordelen voor het klonen en chimera assemblage, zoals kleine grootte ( dwz 2,686 basisparen), hoge kopieën, voordelige sequentie-reactie-eigenschappen en commerciële beschikbaarheid 7 . Hier werd een Escherichia coli gastheer gebruikt om de chimera&#39;s te monteren en te behandelen, omdat bacteriële culturen goedkoop zijn en snel groeien. Gezien dit, zal verdere cloning van de fusiefragmenten in de uiteindelijke doelplasmiden nodig zijn ( bijv. Expressievectoren als pRK415 in bacteriën of pCMV in zoogdiercellen). CAPRRESI werd getest op het fuseren van twee primaire sigma-factor genen: E. colirpoD en Rhizobium etlisigA . Primaire sigma factoren zijn RNA polymerase subunits die verantwoordelijk zijn voor transcriptie initiatie, en bestaan ​​uit vier domeinen ( dwz σ1, σ2, σ3 en σ4) 8 . De aminozuursequentie verlengtH van eiwitten gecodeerd door rpoD en sigA zijn respectievelijk 613 en 685. RpoD en SigA delen 48% identiteit (98% dekking). Deze primaire sigma factoren werden gesplitst in twee complementaire fragmenten tussen regio&#39;s σ2 en σ3. Twee chimere genen werden samengesteld volgens dit ontwerp: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) en chimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA-fusieproducten werden geverifieerd door sequencing.

<table><tbody><tr><td>Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>Produces een mix van blunt/3&rsquo;-A overhang ended PCR producten</td></tr><tr><td>High pure plasmid isolation kit</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Gebruikt voor alle plasmide zuiveringsreacties</td></tr><tr><td>High pure PCR product purification kit</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Gebruikt voor alle PCR zuiveringsreacties uit agarose gels</td></tr><tr><td>AflII restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>Herkent sequentie 5&rsquo;-CTTAAG-3&rsquo; en snijdt bij 37 &deg;C</td></tr><tr><td>KpnI-HF restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>Herkent sequentie 5&rsquo;-GGTACC-3&rsquo; en snijdt bij 37 &deg;C</td></tr><tr><td>SpeI-HF restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>Herkent sequentie 5&rsquo;-ACTAGT-3&rsquo; en snijdt bij 37 &deg;C</td></tr><tr><td>XbaI restrictie-enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>Herkent sequentie 5&rsquo;-TCTAGA-3&rsquo; en snijdt bij 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Ampicilline natriumzout</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Nalidixinezuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Bacteriecultuur</td></tr><tr><td>Caseïne pepton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Bacteriecultuur</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>Natriumchloride</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>Bacteriecultuur</td></tr><tr><td>XbaI restrictie-enzym</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Snel verteerd XbaI enzym</td></tr><tr><td>KpnI restrictie-enzym</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td><td>Snel verteerd KpnI enzym</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Snel DNA ligatiekit</td></tr><tr><td>AflII restrictie-enzym</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>Snel verteerd AflII enzym</td></tr><tr><td>SpeI restrictie-enzym</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>Snel verteerd SpeI enzym</td></tr></tbody></table>

caprresi: chimera assembly door plasmide recovery en restriction enzyme site insertion

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Hier presenteren we chimera assemblage door plasmide recovery en restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI profiteert van vele sterke punten van de oorspronkelijke plasmide herstel methode en introduceert restrictie enzym digestie om DNA ligatie reacties te vereenvoudigen (vereist voor chimera assemblage). Voor dit protocol, klonen gebruikers wildtype genen in hetzelfde plasmide (pUC18 of pUC19). Na de in silico selectie van aminozuursequentie gebieden waar chimera&#39;s moeten worden samengesteld, krijgen gebruikers alle synoniem-DNA-sequenties die ze coderen. Adhoc Perl scripts stellen gebruikers in staat om alle synonieme DNA sequenties te bepalen. Na deze stap zoekt een ander Perl-script naar restrictie-enzymplaatsen op alle synoniem-DNA-sequenties. Dit in silico analyse wordt ook uitgevoerd met behulp van het ampicilline resistentie gen ( ampR ) gevonden op pUC18 / 19 plasmiden. Gebruikers ontwerpen oligonucleotiden in synoniemregio&#39;s om wildtype- en ampR- genen door PCR te verstoren. Na obtAining en zuiverende complementaire DNA-fragmenten, wordt het verteren van restrictie-enzym verwezenlijkt. Chimera assemblage wordt bereikt door gelijke complementaire DNA fragmenten te ligeren. PUC18 / 19-vectoren worden geselecteerd voor CAPRRESI omdat ze technische voordelen bieden, zoals kleine grootte (2,686 basisparen), hoge kopieën, voordelige sequentie-reactie-eigenschappen en commerciële beschikbaarheid. Het gebruik van restrictie-enzymen voor chimera-assemblage elimineert de noodzaak van DNA-polymerasen die stompe producten leveren. CAPRRESI is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.

Figuur 1 toont CAPRRESI. Met behulp van deze methode werden twee chimere genen samengesteld door de domeinen van twee bacteriële primaire sigma factoren ( dwz E. coli RpoD en R. etli SigA) uit te wisselen. De DNA sequenties van de rpoD- en sigA- genen werden verkregen met behulp van de Artemis Genome Browser 14 van respectievelijk GenBank genoombestanden NC_000913 en NC_007761. De DNA sequentie van de pUC18 vect...

Hier presenteren we chimera assemblage door plasmideherstel en restrictie-enzymplaatsinzending (CAPRRESI), een protocol gebaseerd op de invoeging van restrictie-enzymplaatsen in synoniem-DNA-sequenties en functioneel plasmideherstel. Dit protocol is een snelle en goedkope methode voor het smelten van proteïne-coderende genen.

CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Deze video demonstreert een procedure genaamd Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion of CAPRRESI, waarbij twee chimeere genen worden gegenereerd door specifieke restrictie-enzymplaatsen te introduceren in synoniem DNA en vervolgens de DNA-sequenties te knippen en uit te wisselen. Bij CAPRRESI worden de wild-type genen van belang eerst ingebracht in de multiple cloning sites van dezelfde vector. Vervolgens worden voor elk gen breekregio's met dezelfde aminozuursequentie geselecteerd, en wordt de breekregio voor het ampicillineresistentiegen geselecteerd.Perl-scripts worden gebruikt om synonieme sequenties te bepalen die restrictieplaatsen bevatten voor elke breekregio. Met speciaal ontworpen oligos wordt PCR uitgevoerd om vier complementaire delen te produceren die synoniem DNA bevatten met de gewenste restrictie-enzymplaatsen. De resulterende PCR-producten worden gezuiverd, gedigesteerd en vervolgens geligeerd om een chimerische sequentie te produceren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het genfusies vergemakkelijkt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de moleculaire biologie, zoals wat de functies van ons proteïne-enzym zijn. Begin deze procedure met de genen van belang die al zijn ingevoegd in de multiple cloning sites van de vectoren.Hier zijn de rpoD- en sigA-genen, die coderen voor bacteriële signaalfactoren die nodig zijn om RNA-synthese te initiëren, elk gekloneerd in pUC18 zoals gedetailleerd in de begeleidende tekst. Om het oligonucleotide voor de productie van het chimerisch eiwit te ontwerpen, voert u eerst het translate.pl perl-script uit om de aminozuursequentie van de rpoD-, sigA- en ampR-genen te verkrijgen.Gebruik vervolgens de Muscle-webserver om de aminozuursequenties van rpoD en sigA uit te lijnen. Selecteer voor elke sequentie een breekregio met dezelfde sequentie van drie tot zes aminozuren. Sla de sequenties op in het bestand regions.fas.Select vervolgens een sequentie van drie tot zes aminozuren binnen het ampR-gen en sla deze sequentie op in het bestand regions.fas. Om alle synonieme DNA-sequenties te bepalen, voert u het perl-script synonym.pl uit. Voer vervolgens het script resynonym.pl uit om vast te stellen welke restrictie-enzymen de synonieme sequenties knippen.Gebruik vervolgens de synonieme DNA-sequenties om oligonucleotiden te ontwerpen die dezelfde restrictie-enzymplaats in de breukregio's van rpoD en sigA inbouwen. Ontwerp een oligonucleotide om het ampR-gen te verstoren waarbij een andere restrictie-enzymplaats wordt ingebouwd. De forward- en reverse-oligonucleotiden zullen overlappen bij de restrictie-enzymplaats.Oligonucleotiden moeten een lengte hebben van 21 tot 27 nucleotiden, eindigen met cytosine of guanine en een restrictie-enzymplaats bevatten. Een forward-oligonucleotide heeft dezelfde sequentie als de doelregio op het template-DNA. Een reverse-oligonucleotide is de reverse-complementaire sequentie van de doelregio op het template-DNA.Bestel de oligos bij een DNA-syntheseleverancier. Gebruik de oligonucleotiden bij ontvangst om PCR uit te voeren met de rpoD- en sigA-pUC18-constructen als template-DNA. Dit levert twee complementaire delen op voor elk construct.Voer na de PCR agarosegelelektroforese uit om de PCR-producten te scheiden van het DNA-sjabloon. De zuivering van complementaire plasmidedelen is cruciaal om contaminatie door ouderplasmiden te voorkomen. De ouderplasmiden kunnen worden geëlimineerd door gelzuivering, zoals we hier demonstreren, of door digestie met het restrictie-enzym dpn1, dat kan worden gebruikt om de ouderplasmiden op te knippen.Kleur de gel na elektroforese met een ethidiumbromide-oplossing. Visualiseer de buigingen door de gekleurde gel in een UV-kamer bij 300 nanometer te plaatsen. Houd de blootstelling van de gel tot een minimum beperkt.Snijd vervolgens de banden met de PCR-producten uit en plaats deze in microcentrifugebuisjes. Gebruik een kit om de DNA-monsters te zuiveren en voer vervolgens een dubbele digestie uit op alle complementaire DNA-fragmenten met de juiste fast digest restrictie-enzymen. AFL2 en SPE1 worden gebruikt om de complementaire delen van het plasmide te fuseren.Incubeer de digestiereactie bij 37 degree celsius gedurende 15 minuten. Inactiveer vervolgens de restrictie-enzymen volgens de richtlijnen van de fabrikant. Inactiveer bijvoorbeeld AFL2, SPE1 bij 80 degree celsius gedurende 20 minuten.Combine vervolgens de juiste DNA-fragmenten met ligatiebuffer, water en T4 DNA-ligase. Laat de ligatiereactie 10 minuten bij 25 °C rusten. Op deze manier wordt de integriteit van het ampR-gen hersteld, waardoor een functioneel eiwit wordt geproduceerd.Transformeer na de ligatie E.Coli DH5 alpha met drie tot vijf µL van de ligatiereactie van de chimeerasamenstelling. Plaats de getransformeerde cellen op LB ampicilline x-gal IPTG-platen en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. Selecteer de volgende dag de witgekleurde getransformeerde E.Coli-koloniën en ent deze uit op een nieuwe LB ampicilline-plaat.Incubeer de platen overnacht bij 37 °C. Voer een kolonie-PCR uit om kandidaten voor sequencing te selecteren. Visualiseer de banden op een 2% agarosegel door, zoals eerder beschreven, elektroforese uit te voeren.Selecteer kandidaatkolonies die een DNA-band van de juiste grootte vertonen om culturen te inoculeren. Extraheer de volgende dag het plasmid-DNA uit deze kolonies met behulp van een kit. Stuur de monsters na plasmidzuivering op voor sequencing.Chimere rpoD sigA-constructen werden gegenereerd zoals gedetailleerd in deze video. Na sequencing werd de uitlijning van wild-type en chimere genen uitgevoerd met muscle-software. De chimere gensequenties werden vervolgens geassembleerd met mura-software, zoals hier wordt getoond.Synonieme sequenties worden in het zwart weergegeven en de AFL2-site is onderstreept. Deze sequentiegegevens tonen het succesvolle gebruik van de CAPRRESI-methode aan voor het genereren van chimerische constructen. Na het bekijken van deze video heeft u een goede optie voor het fuseren van gensegmenten.

caprresi-chimera-assembly-plasmid-recovery-restriction-enzyme-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode...

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Gene targeting-methodologieën kunnen worden gebruikt om transgene muizen te genereren met knockout-, knock-in- en getaggede allelen. Hier beschrijven we een verbeterde methode van recombineren in E. coli, die we 'subklonen plus invoegen' noemen, en die kan worden gebruikt om snel aangepaste gene targeting-vectoren te genereren.

Subkloning Plus Insertion (SPI) - A Novel recombineering Methode voor de snelle bouw van gene targeting vectoren

De synthese van aangepaste plasmiden is arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol beschrijft het gebruik van Gibson-assemblage-klonering om de werk en duur van de procedure voor aangepaste DNA-klonering te verminderen. Het beschreven protocol produceert ook betrouwbare getagde eiwitconstructies voor zoogdierexpressie tegen vergelijkbare kosten als de traditionele cut-and-paste DNA-klonering.

Generatie van plasmide vectoren die-FLAG tagged eiwitten onder de verordening van de Mens elongatiefactor-1α Promoter Met behulp van Gibson Vergadering

Het introduceren van meerdere genomische veranderingen in cyanobacteriën is een essentieel hulpmiddel bij de ontwikkeling van stammen voor industrieel en fundamenteel onderzoek. We beschrijven een systeem voor het genereren van ongemarkeerde mutanten in de model cyanobacteriënsoort Synechocystis sp. PCC6803 en gemarkeerde mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Generatie van Marked en markerless Mutanten in Model cyanobacteriën Species

Structureel verwante proteïnen oefenen vaak verschillende biologische functies. De uitwisseling van gelijkwaardige gebieden van deze proteïnen te creëren chimeer eiwitten vormt een innovatieve aanpak ter identificatie van de kritische eiwit-regio's die verantwoordelijk voor hun functionele verschillen zijn.

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten werden geïntegreerd in het schema van Booleaanse poorten in Saccharomyces cerevisiae. De nieuwe kleine logische circuits toonden goede prestaties en verdiepten het begrip van zowel op dCas9/dCas12a gebaseerde transcriptiefactoren als de eigenschappen van anti-CRISPR-eiwitten.

Gene digitale circuits op basis van CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

In vivo assemblage is een ligatie-onafhankelijke kloneringsmethode die berust op intrinsieke DNA-reparatie-enzymen in bacteriën om DNA-fragmenten te assembleren door homologe recombinatie. Dit protocol is zowel tijd- als kosteneffectief, aangezien er weinig reagentia nodig zijn en de kloonefficiëntie kan oplopen tot 99%.

Gebruik van in vivo assemblage voor zeer efficiënte plasmideconstructie

Leer de CAPRRESI-methode voor het efficiënt fuseren van eiwitcoderende genen via restrictie-enzymsites in synonieme DNA-sequenties. Dit protocol biedt een snelle en kosteneffectieve aanpak voor genetisch onderzoek.

CAPRRESI: Chimera Assembly Door Plasmide Recovery En Restriction Enzyme Site Insertion

Meer video's verkennen