In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

Het algemene doel van deze procedure is om de effectiviteit van op GnRH gebaseerde systemen voor geneesmiddelentoediening in humane kankercelculturen te onderzoeken en te voorspellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van gerichte antikankertherapie, zoals de efficiëntie waarmee cellen van verschillende humane kankertypen GnRH-gerichte antikankermiddelen opnemen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat er gebruik wordt gemaakt van nieuwe fluorescentielabelled GnRH-analogen, waardoor gelijktijdig gebruik van confocale microscopie en flowcytometrie-analyse mogelijk is.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot anti-kankertherapie, omdat GnRH-receptoren sterk tot expressie komen op verschillende typen kankercellen, wat selectieve targeting van deze cellen mogelijk maakt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Bianka Gurbi, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het verwijderen van het kweekmedium uit elk van de zeven wells van een gezaaide microscopische slide.

Voeg vervolgens 250 µL van het voorverwarmde complete medium toe aan de negatieve controleput en 250 µL van het voorverwarmde GnRH fit seed behandelmedium aan elk van de overige zes putten. Incubeer de slide in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende vijf uur. Aspireer na vijf uur incubatie het medium uit elke put en was de cellen met 250 µL PBS.

Voeg vervolgens 250 µL fixeersolutie toe aan elke well en incubeer het objectglas gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zodra de cellen zijn gefixeerd, wordt de fixeersolutie weggegooid en worden de cellen gewassen met 250 µL PBS. Voeg 250 µL van een 5 µM fluorescente probe-oplossing, bereid in PBS, toe aan elke well en incubeer het objectglas gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Nadat de fluorescentieprobe-oplossing is verwijderd, worden de cellen voorzichtig tweemaal gewassen met 250 µL PBS. Voeg ten slotte drie tot vier druppels monteermedium toe aan elke put. Bewaar het preparaat in het donker bij kamertemperatuur tot het onder een microscoop wordt afgebeeld.

Verwijder het kweekmedium uit elk van de vijf putjes van een gezaaide microscopische slide. Voeg vervolgens 250 microliters van het voorverwarmde complete medium toe aan het putje voor de negatieve controle en aan het tweede putje met de onbehandelde cellen. Behandel de cellen in de drie overgebleven putjes voor met de voorverwarmde behandelmedia die 10 micromolar GnRH FITC bevatten.

Incubeer het objectglas in een incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende één uur. Verwijder vervolgens alleen het medium van de behandelde cellen en was de cellen met 250 µL van het voorverwarmde complete medium. Verwijder daarna het wasmedium.

Voeg vervolgens 250 µL van het voorverwarmde complete medium toe aan elk van de drie wells. Incubeer het objectglas in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende één uur. Gooi na incubatie het medium uit alle vijf de wells en was de cellen met 250 µL PBS.

Verwijder vervolgens de PBS en fixeer de cellen met 250 microliters fixeeroplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder daarna de fixeeroplossing en was de cellen met 250 microliters PBS. Voeg 250 microliters blokkeeroplossing toe aan elke put en incubeer het objectglas gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Zuig de blokkeringsoplossing af uit elke put, behalve uit de negatieve controle. Nadat de cellen zijn gewassen met 250 µL PBS, wordt er 250 µL primaire antilichaamoplossing aan elke put toegevoegd. Incubeer het objectglas gedurende één uur bij kamertemperatuur op een donkere plaats.

Verwijder de oplossingen uit elk van de vijf putjes en was de cellen met 250 microliters PBS. Verwijder vervolgens de PBS en voeg 250 microliters secundaire antilichaamoplossing toe. Incubeer het objectglas gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker.

Zuig de oplossing uit elke put en was de cellen met 250 µL PBS. Verwijder de was-PBS en voeg vervolgens 250 µL PBS met vijf µM fluorescerende probe toe aan elke put. Incubeer het objectglas gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de fluorescerende probe-oplossing uit elke put en was de cellen voorzichtig twee keer met 250 µL PBS. Voeg ten slotte drie tot vier druppels monteermedium toe aan elke put. Bewaar de slide in het donker bij kamertemperatuur totdat deze onder een microscoop wordt afgebeeld.

Beeld de cellen af met een omgekeerde confocale laserscanningmicroscoop. Schakel de 488 nanometer en de 633 nanometer lasers in. Controleer de laserversterking en de pinhole-grootte.

Maak beelden van de negatieve controlemonsters. Optimaliseer het waargenomen signaal voor de nucleus en stel het signaal van FITC en Alexa 546 zo in dat dit dicht bij nul ligt. Maak vervolgens, met behulp van dezelfde parameters, beelden van de behandelde monsters.

Verwijder het volledige medium uit alle zeven putjes van een gezaaide kweekplaat. Voeg vervolgens één milliliter voorverwarmd volledig medium toe aan het negatieve controleputje en één milliliter van het voorverwarmde behandelmedium aan de overige zes putjes. Incubeer de plaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende vijf uur.

Nadat het medium uit alle putjes is weggegooid, worden de cellen voorzichtig twee keer gewassen met twee milliliter PBS. Verwijder de PBS en voeg vervolgens 500 microliter Trypsin EDTA-oplossing toe aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius totdat de cellen loslaten, wat ongeveer 10 minuten duurt.

Neutraliseer de trypsine in elke put met één milliliter volledig medium en schud de plaat. Suspendeer de cellen vervolgens door voorzichtig te pipetteren. Breng de suspensies over naar afzonderlijke FACS-buisjes en centrifugeer de monsters bij 150 ×g bij vier graden Celsius gedurende vier minuten.

Decanteer de supernatanten voorzichtig. Voeg vervolgens 500 µL ijskoud PBS toe aan elke FACS-buis en resuspendeer de cellen voorzichtig. Bewaar de buizen op ijs tot ze via FACS worden geanalyseerd.

Hier wordt de analyse van de GnRH-opname in farynxcarcinoomcellen gepresenteerd. Een behandeling van vijf uur met één micromolair van een fluorescent complex van GnRH resulteerde in een geringe, maar onderscheidbare opname, wat zich manifesteerde als een groen fluorescent signaal gelokaliseerd in de farynxkankercellen. Een verdere verhoging van de dosis van het complex leidde tot een verhoogde opname, wat de dosisafhankelijkheid van de GnRH-opname in farynxcarcinoomcellen aantoont.

De receptorafhankelijke opname van GnRH en de cellulaire distributie van het ligand in zijn receptor in longkankercellen werden geanalyseerd door gelijktijdige behandeling met een fluorescent GnRH-complex en kleuring van de type één GnRH-receptor en kernen. De resultaten tonen aan dat de type één GnRH-receptor geassocieerd is met het celmembraan, terwijl het GnRH-eiwit in cellen wordt geïnternaliseerd en in hun cytoplasma blijft. De GnRH-opname in farynxcarcinoomcellen werd eveneens bestudeerd met behulp van FACS-analyse.

De resultaten laten zien dat de opname van GnRH, waargenomen wanneer cellen werden behandeld met 1 µM GnRH-conjugaat, sterk toenam wanneer de dosis die aan de cellen werd toegediend werd verhoogd naar 10 µM. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in acht uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de behandelde monsters en fluorescerende kleurstoffen te beschermen tegen direct licht.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals assays voor cellevensvatbaarheid of apoptose, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe efficiënt het GnRH-gerichte geneesmiddel de groei van een bepaald type kanker kan remmen. Na deze ontwikkeling baande deze techniek de weg voor onderzoekers op het gebied van kankertherapie om de effectiviteit van op GnRH gebaseerde systemen voor geneesmiddelentoediening bij hechtende kankercellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe deze fluorescentielabel GnRH-conjugaten kunnen worden gebruikt om de vatbaarheid van kankercellen voor GnRH-gerichte therapieën te onderzoeken.