Name: In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Leer fluorescerende GnRH-analogen gebruiken voor in vitro beeldvorming en kwantificering van celopname in humane kankercellijnen. Deze methode combineert confocale microscopie met flowcytometrie voor gerichte kankertherapie-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het project werd ondersteund door National Research Fund OTKA (K 104045).

1. Bereiding van celkweken en reagentia <ol><li> Handhaaf de celkweken de fabrikant aanbevolen medium, aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en antibiotica (zogenaamde volledig medium). Houd de celcultuur kolf in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C. Volg de proliferatie en samenvloeiing van de cellen door omgekeerde microscoop (met behulp van 10X fase objectieve contrast). </li><li> Wanneer de cellen voldoende samenvloeiing bereiken, verwijder het medium, en was de cultuur met 2-3 ml, steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 0,5 ml steriel 0,25% trypsine-EDTA oplossing aan de celkweek en incubeer bij 37 ° C tot cellen los (ongeveer 10 min). </li><li> Hang de cellen in 3-4 ml steriel compleet medium om trypsine te stoppen en zet ze in een steriele centrifugebuis. Centrifugeer de cellen bij 150 g gedurende 4 min bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het supernatant voorzichtig op te schorten en de pEllet in 2-3 ml steriel compleet medium. </li><li> Haal 100 pi van de celsuspensie en meng met 100 pl 0,4% (m / V) trypan blauwe oplossing, om de dode cellen te kleuren. Belasting 10 pi van dit mengsel in een hemocytometer en het bepalen van het aantal levensvatbare cellen door omgekeerde microscoop. </li><li> Verdun de vereiste hoeveelheid celsuspensie bereid in stap 1,3-10 ml met steriel compleet medium, bevattende 4 x 10 4 cellen / ml. </li><li> Voeg 250 ul van celsuspensie (bereid in stap 1.5) per putje (10 4 cellen / putje) in zeven putjes van de eerste glazen bodem 8-well microscopische slide. Gebruik deze dia in de GnRH opname methode. </li><li> Voeg 250 ul van celsuspensie (bereid in stap 1.5) per putje (10 4 cellen / putje) in vijf putjes van de tweede 8-well microscopische slide. Deze dia wordt gebruikt in de GnRH-IR methode expressie. </li><li> Voeg 1 ml celsuspensie (bereid in stap 1.5) per putje (4 x 10 4 cellen / putje) in zeven wells van een 12-wells plaat. Deze plaat wordt gebruikt in de GnRH kwantificeringsmethode. </li><li> Laat de cellen hechten aan de twee microscoopglaasjes en de plaat. Incubeer ze in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Na de incubatie controleren de cellen door omgekeerde microscoop (met behulp van 10X fase objectieve contrast). Als de cellen gezond zijn en aangesloten, gaat u verder met de volgende stappen. </li><li> Bereid 10 mM GnRH-FITC voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) van elk van de drie conjugaten 18. (Gebruik deze verdunningen: 16,43 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 ug / ul [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II en 16,47 ug / ul [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Houd deze voorraad oplossingen in een donkere plaats bij kamertemperatuur en gebruik ze binnen een paar weken. </li><li> Verdun 1,7 pi elk van de drie 10 mM GnRH-FITC voorraadoplossingen in 1,7 ml compleet medium. Schud deze oplossingen. (These zijn de 10 pM GnRH-FITC behandelen media.) Verdun 150 pi elk van de drie 10 uM GnRH-FITC behandelen medium in 1,35 ml compleet medium. Schud deze oplossingen en (dit zijn de 1 uM GnRH-FITC behandelen medium). LET OP: Alle GnRH-FITC met de behandeling van medium dient te worden beschermd tegen licht en gebruik binnen een paar uur. </li><li> Verwarm de zes GnRH-FITC behandelen medium (bereid in stap 1,12) en 4 ml volledig medium tot 37 ° C. </li><li> Verdun 3 pl van 5 mM fluorescente probe oplossing (nucleaire tegenkleuring in de lijst genoemde materialen) in 3 ml PBS tot 5 uM. Deze oplossing moet worden beschermd tegen licht, houd het bij kamertemperatuur en gebruik het binnen een paar uur. </li></ol> 2. confocale laser scanning microscopie (CLSM) <ol><li> GnRH opname methode <ol><li> Neem de eerste microscopische dia bereid in stap 1.6 en pipet het compleet medium uit elk van die zeven. Voeg 250 ul van voorverwarmd volledige medium in het eerste putje. Gebruik dit als een negatieve controle. Voeg 250 pi van de voorverwarmde GnRH-FITC behandelen media (van 1,13) aan elk van de volgende zes putjes (3 putjes met 1 uM en 3 met 10 uM). Incubeer de schuif in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 5 uur. </li><li> Pipet uit het medium uit elk putje en was de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 pl fixeeroplossing (10% neutraal gebufferde formaline) in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 10 min. </li><li> Pipetteer uit de vaststelling oplossing uit elk putje en was de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 ul PBS bevattende 5 uM fluorescerende probe bereid in stap 1,14 in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 10 min. </li><li> Pipetteer uit de fluorescerende probe-oplossing van elk putje, en was de cellen tweemaal met 250 pi PBS voorzichtig. Voeg 3-4 druppels montage medium in elk putje, eindelijk. Houd de glijbaan in het donker bij kamertemperatuur, totdat de beeldvorming. </li&gt; </ol></li><li> GnRH-IR expressie methode <ol><li> Neem de tweede 8-well microscopische slide bereid in stap 1.7 en pipet het compleet medium uit elk van de vijf putten. </li><li> Voeg 250 ul van voorverwarmde compleet medium in de eerste put, gebruik dit als negatieve controle. Voeg 250 ul van voorverwarmde compleet medium in de tweede ook goed, en dit gebruiken om GnRH-IR expressie te onderzoeken alvorens de behandeling GnRH. </li><li> Voeg 250 pi elk van de drie voorverwarmde 10 uM GnRH-FITC behandelen medium in de komende drie putjes. Gebruik deze bronnen om de cellen met GnRH-FITC conjugaten voorbehandelen alvorens de GnRH-IR expressie. Incubeer de schuif in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Pipetteer de behandeling van medium uit elk van de drie putjes die zal worden gebruikt om GnRH-IR expressie na behandeling GnRH onderzoeken en was deze putjes met 250 ul voorverwarmde compleet medium. Voeg 250ui voorverwarmd compleet medium in elk van de drie putjes. Incubeer de schuif in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Pipetteer het medium uit elk van de vijf putjes en spoel de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 pl fixeeroplossing in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 10 min. </li><li> Pipetteer uit de vaststelling oplossing uit elk putje en was de cellen met 250 ul van PBS. Voeg 250 ul PBS die 5% runderserumalbumine (BSA) blokkeeroplossing in elk putje en incubeer de schuif bij KT gedurende 1 uur. </li><li> Verdun 10 pi van GnRH-IR primair antilichaam in 1 mL PBS (1: 100 ratio). Hou het bij kamertemperatuur en gebruik het binnen een paar uur. </li><li> Pipetteer de BSA blokkerende oplossing uit elk putje met uitzondering van de negatieve controle (eerst ook). Was de cellen met 250 pi PBS (met uitzondering van de negatieve controle well). Voeg 250 ul PBS dat GnRH-IR primair antilichaam werd bereid in stap 2.2.7 in each goed (met uitzondering van de negatieve controle). Incubeer de glijbaan bij KT, gedurende 1 uur, op een donkere plaats. </li><li> Verdun 2,5 pl Alexa 546 gelabelde secundaire antilichaam in 1,25 ml PBS (1: 500 ratio). LET OP: Deze oplossing moet worden beschermd tegen licht, houd het bij kamertemperatuur en gebruik het binnen een paar uur. </li><li> Pipet uit oplossingen van elk van de vijf putjes en spoel de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 ul PBS dat AF 546 gelabeld secundair antilichaam werd bereid in stap 2.2.9 in elk putje. Incubeer de schuif bij KT gedurende 1 uur in het donker. </li><li> Pipet uit de oplossing uit elk putje en was de cellen met 250 pi PBS. Voeg 250 ul PBS bevattende 5 uM fluorescerende probe bereid in stap 1,14 in elk putje en incubeer de glijbaan voor 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Pipetteer uit de fluorescerende probe-oplossing van elk putje en was de cellen tweemaal met 250 pi PBS voorzichtig. Voeg 3-4 druppels montage media in elk putje, na afloop. Houd de glijbaan in het donkerbij KT totdat de microscopische beeldvorming. </li></ol></li><li> In beeld brengen <ol><li> Het imago van de cellen door omgekeerde confocale laser scanning microscoop (met behulp van 63x olie-immersie objectief) <ol><li> Gebruik de volgende excitatie / emissie-golflengten. GnRH conjugaten: 488/514 nm, Alexa 546 gemerkt antilichaam: 488/546 nm (alleen gebruiken voor het GnRH-IR expressie methode), DRAQ5 fluorescente probe: 633/680 nm. </li><li> Stel de imaging parameters met de negatieve controle cellen. Gebruik deze parameters om het behandelde cellen (figuur 3). Bijstellen beeldparameters op elk microscopisch preparaat aan het begin van de analyse. Fine-tunen en export beelden met de software die door de fabrikant als dat nodig is. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) <ol><li> GnRH kwantificeermethode <ol><li> Neem de plaat bereid in stap 1.8 en pipet het compleet medium van EAch van zeven putjes. Voeg 1 ml voorverwarmde compleet medium in het eerste putje. Gebruik dit als een negatieve controle. Voeg 1 ml elk van de zes voorverwarmd behandelen media (3 putjes met 1 uM en 3 putjes met 10 uM) in de volgende zes putjes. Incubeer de plaat in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C gedurende 5 uur. </li><li> Pipet uit het medium uit elk putje. Was de cellen tweemaal met 2 ml PBS zorgvuldig. Voeg 500 pi van trypsine-EDTA-oplossing in elk putjes. Incubeer de plaat bij 37 ° C tot cellen los (ongeveer 10 min). </li><li> Voeg 1 mL volledig medium in elk putje om trypsine te stoppen. Schud de plaat. Hang de cellen voorzichtig met een pipet en overdracht van de schorsing uit elk putje in FACS buizen. Centrifugeer de buizen bij 150 g gedurende 4 min bij 4 ° C. </li><li> Giet de bovenstaande vloeistoffen voorzichtig, met één beweging. Voeg 500 ul van ijskoude PBS in elk FACS buis en voorzichtig resuspendeer de cellen. Houd de buizen op ijs tot het eindevan het experiment. </li></ol></li><li> Analyse en berekening <ol><li> Analyseer de cellen door flowcytometrie. Voor excitatie, 488 nm gebruikt argon laser golflengte en voor detectie gebruiken 530 nm golflengte. Stel de flowcytometer parameters door uitvoering van de negatieve controlecellen. Gebruik deze parameters behandelde cellen (Figuur 4A) geanalyseerd. Evalueer de data software van de fabrikant Bepaal gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) waarden en berekent de relatieve MFI waarden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2227-9059/4/2/11">Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells.</a> Biomedicines. 4 (2), 11(2016).</li>
<li>Majumdar, S., Siahaan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated targeted drug delivery.</a> Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).</li>
<li>Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH+in+non-hypothalamic+reproductive+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues.</a> Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).</li>
<li>Schally, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+hormones+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic hormones and cancer.</a> Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).</li>
<li>Limonta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH+receptors+in+cancer%3A+From+cell+biology+to+novel+targeted+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies.</a> Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).</li>
<li>Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/286798220_Targeting_drug_delivery_system_based_on_gonadotropin-releasing_hormone_analogs_Research_advances">Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances.</a> J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).</li>
<li>Manea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+antitumour+effect+of+daunorubicin-GnRH-III+derivative+conjugates+on+colon+carcinoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice.</a> Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).</li>
<li>Argyros, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-Drug+conjugate+gnrh-sunitinib+targets+angiogenesis+selectively+at+the+site+of+action+to+inhibit+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth.</a> Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).</li>
<li>Karampelas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-Gemcitabine+conjugates+for+the+treatment+of+androgen-independent+prostate+cancer%3A+pharmacokinetic+enhancements+combined+with+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery.</a> Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).</li>
<li>Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+actions+of+GnRHs+mediated+by+ligand-induced+selective+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling.</a> Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).</li>
<li>Millar, R. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15082521">Gonadotropin-releasing hormone receptors.</a> Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).</li>
<li>Olberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+in+vitro+evaluation+of+small-molecule+%5B18F%5D+labeled+gonadotropin-releasing+hormone+%28GnRH%29+receptor+antagonists+as+potential+PET+imaging+agents+for+GnRH+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression.</a> Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).</li>
<li>Zoghi, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/ract.2016.104.issue-4/ract-2015-2443/ract-2015-2443.xml">Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging.</a> Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).</li>
<li>Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+indium-111-labeled+gonadotropin-releasing+hormone+peptide+for+human+prostate+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging.</a> Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).</li>
<li>Nederpelt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+12+GnRH+peptide+agonists+-+A+kinetic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective.</a> Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).</li>
<li>Szabo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+in+vitro+biological+evaluation+of+daunorubicin+containing+GnRH-I+and+GnRH-II+conjugates+developed+for+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting.</a> J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).</li>
<li>Leurs, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-III+based+multifunctional+drug+delivery+systems+containing+daunorubicin+and+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate.</a> Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).</li>
<li>Murányi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization+and+systematic+comparison+of+FITC-labelled+GnRH-I%2C+-II+and+-III+analogues+on+various+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells.</a> J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Experimenten hierin beschreven gebruiken selectief gelabeld GnRH analogen voor screening hechtende celculturen in vitro. Confocale microscopie en flowcytometrie werkwijzen zijn geschikt voor het volgen en kwantificeren van de cellulaire opname van deze GnRH-FITC-conjugaten in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Deze experimenten hebben de volgende belangrijke stappen: 1) handhaven van een steriele, gezonde celkweek; 2) GnRH-peptiden moet van hoge kwaliteit zijn; 3) redelijke concentraties en...

<html> Peptide-gebaseerde gerichte toediening van medicijnen systemen zijn uitgegroeid tot een snelle ontwikkeling en veelbelovend gebied in de behandeling van kanker in de afgelopen jaren 1, 2. Menselijke gonadotropin-releasing hormone receptor type I (GnRH-IR) is voornamelijk in de hypofyse, maar is ook aanwezig in verschillende andere weefsels die verantwoordelijk zijn voor zelfreproductie 3 zijn. GnRH-IR zich ook in een aantal kankerweefsels, al dan niet verbonden met het voortplantingssysteem 4, 5. De hoge expressie van GnRH-IR verschillende kwaadaardige tumorcellen in vergelijking met gezonde weefsels biedt een gelegenheid voor gerichte therapie 5, 6. Veel gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogen ontwikkeld in de afgelopen decennia, die kunnen worden gebruikt als richtende delenf &quot;&gt; 7, 8, 9. Deze peptiden kunnen antikankermiddelen met hoge selectiviteit geven in kwaadaardige tumorcellen die overexpressie GnRH-IR 6. Verscheidene GnRH geconjugeerd anti-tumor geneesmiddelen met hogere selectiviteit en hoger rendement dan de corresponderende niet-geconjugeerde vrije geneesmiddel gerapporteerd 7, 8, 9. Vorige publicaties over GnRH-peptiden en hun receptoren gemeld dat de GnRH-IR verschillende conformaties die verschillende selectiviteit hebben voor GnRH analogen 10 kan aannemen. De sterk wisselende GnRH-IR is complex en diverse signaalwegen zijn begiftigd met verschillende activiteiten tegen hun natuurlijke en kunstmatige liganden 11. Deze feiten maken onderzoek naar GnRH-gebaseerde systemen uitdagend. Anderzijds, de<html> y bezitten veelbelovende therapeutisch potentieel. Verschillende experimenten met gelabeld GnRH peptiden werden eerder gemeld 12, 13, 14, 15, maar experimenten waarbij fluorescent gelabelde GnRH analogen werden nog beperkt. Terwijl radioactief merken biedt een hoge gevoeligheid, fluorescente labeling heeft een aantal andere voordelen, zoals de eenvoudige bediening en de mogelijkheid om tegenkleuring met verschillende fluoroforen. Drie gemeenschappelijke GnRH-analogen die met succes zijn gebruikt voor geneesmiddelafgifte zijn [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II en GnRH-III, maar de doeltreffendheid van deze peptiden als doelgerichte eenheden is zelden vergeleken 16, 17. Aan de andere kant, resultaten van afzonderlijke experimenten waarin verschillende kankercellen en GnRH analogen werden gebruikt divers. ntent &quot;&gt; Op basis van deze overwegingen hebben we ons gericht op de tumor targeting en geneesmiddelafgifte potentieel van deze GnRH peptiden en daardoor gesynthetiseerd en gekarakteriseerd het [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II en [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III peptideconjugaten 18 Deze analogen worden selectief gelabeld met FITC aan de zijketen van hun Lys of D-Lys (peptide-FITC verhouding 1: 1 naar elkaar. conjugaat). het idee was dat de selectieve fluorescentielabelling nieuwe informatie over deze peptiden kunnen bieden, en maakt hun goede tracking en betrouwbare kwantificatie. deze conjugaten veilig hanteren en betrouwbaar detecteerbaarheid, die het gemakkelijker om hun tumor targeting efficiëntie te vergelijken, en de screening van verschillende typen kwaadaardige tumorcellen. We hopen dat up-to-date experimenten met deze peptide-conjugaten kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe kanker gericht GnRH-geneesmiddel conjugaten en helpen nieuwe therapeutische tar identificerenkrijgt ook. De huidige manuscript toont een aantal goed reproduceerbare en snelle experimenten met GnRH-FITC conjugaten. Het celoppervlak expressie van GnRH-R bepalende voorwaarde van GnRH opname dus we gelijktijdig onderzocht het celoppervlak niveau van GnRH-IR van de geteste cellijnen. We gevisualiseerd de GnRH-IR en GnRH-FITC conjugaten van confocale laser scanning microscopie (CLSM) en gekwantificeerd de cellulaire opname van GnRH-FITC conjugaten middels fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).

<table><tbody><tr><td>EBC-1</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0820</td><td>Menselijk longkwaadaardig plaveiselcelcarcinoom</td></tr><tr><td>BxPC-3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td>Menselijk pancreasadenocarcinoom</td></tr><tr><td>Detroit-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-138</td><td>Menselijk keelholtecarcinoom</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium met L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Kweekmedium voor BxPC-3 cellen</td></tr><tr><td>Eagle's Minimum Essential Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-611F</td><td>Kweekmedium voor EBC-1 cellen, aangevuld met 0,1% natriumpyruvaat voor Detroit-562 cellen</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Euro Clone</td><td>ECS0180L</td><td>Aanvulling op het kweekmedium</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-CL&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VZA-2012</td><td>Aanvulling op het kweekmedium (antibiotica)</td></tr><tr><td>Standard Line Celkweekkolven</td><td>VWR</td><td>10062-872</td><td>Biedt een consistent, steriele groeiomgeving voor cellen</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA Mixtuur&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>Verwijderen van gehechtte cellen</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Trypanblauw oplossing, 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Gebruikt voor het tellen van cellen</td></tr><tr><td>[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I</td><td>door ons gemaakt</td><td>-</td><td>Zuiverheid &ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II</td><td>door ons gemaakt</td><td>-</td><td>Zuiverheid &ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>[Lys8(FITC)]-GnRH-III</td><td>door ons gemaakt</td><td>-</td><td>Zuiverheid &ge;98% (HPLC)</td></tr><tr><td>microscoopglasbodem met 8 putjes</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Gebruik in CLSM-experiment</td></tr><tr><td>Corning Costar celkweekplaat, 12 putjes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3513-50EA</td><td>Gebruik in FACS-experiment</td></tr><tr><td>Fixeeroplossing (10% neutraal gebufferd formaline)</td><td>Bio-Optica</td><td>01V60P</td><td>Fixeren van hechtende cellen</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td>Voorkomt niet-specifieke binding van antilichamen</td></tr><tr><td>GnRHR Antilichaam</td><td>Proteintech</td><td>19950-1-AP</td><td>Reagens voor immunocytochemie, bindt aan de humane type-I GnRH-receptoren</td></tr><tr><td>Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 546-conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11035</td><td>Reagens voor immunocytochemie, bindt aan het primaire antilichaam</td></tr><tr><td>Fluorescente sondeoplossing (Draq5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62254</td><td>Tegenkleuring van kernen</td></tr><tr><td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td>Gebruik in CLSM-experiment, behoudt fluorescentie</td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop</td><td>Elektro-Optika Ltd.&nbsp;</td><td>Alpha XDS-2T</td><td>Controleer het fenotype en de confluentie van celculturen</td></tr><tr><td>Omgekeerd confocale laserscanningmicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM-710</td><td>Gebruik in CLSM-experiment</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td>Gebruik in FACS-experiment</td></tr></tbody></table>

in vitro imaging en kwantificering van de drug targeting efficiency van fluorescent gelabelde gnrh analogen

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

GnRH-analogen zijn effectief doelgerichte eenheden en in staat om antikanker middelen te leveren selectief in kwaadaardige tumorcellen die zeer uitdrukkelijke GnRH-receptoren. Echter, de kwantitatieve analyse van cellulaire opname GnRH analogen en de onderzochte celtypen in-GnRH gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen momenteel beperkt. Eerder introduceerde, selectief gelabeld fluorescerende GnRH I, -II en -III derivaten zorgen voor een grote detecteerbaarheid, en ze hebben voldoende chemische eigenschappen voor reproduceerbare en robuuste experimenten. We vonden ook dat de nodige up-to-date methoden met deze gelabeld GnRH-analogen roman informatie over de GnRH-based drug delivery systemen kon bieden. Dit manuscript introduceert een aantal eenvoudige en snelle experimenten met betrekking tot de cellulaire opname van [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II en [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III op de EBC-1 (long), de BxPC-3 (alvleesklier) en de Detroit-562- (farynx) maligne tumor cellen. Parallel aan deze GnRH-FITC-conjugaten werd het celoppervlak niveau van GnRH-I receptoren onderzocht in de volgende cellijnen voor en na de behandeling met GnRH confocale laser scanning microscopie. De cellulaire opname van GnRH-FITC-conjugaten werd gekwantificeerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering. In deze experimenten kleine verschillen tussen GnRH analogen en grote verschillen tussen celtypes waargenomen. De significante verschillen tussen cellijnen worden gecorreleerd met hun verschillende niveau van celoppervlakte GnRH-I receptoren. De geïntroduceerde experimenten bevatten praktische methoden te visualiseren, kwantificeren en vergelijk de opname-efficiëntie van GnRH-FITC-conjugaten in een tijd- en concentratieafhankelijke wijze op verschillende hechtende celculturen. Deze resultaten kunnen de drug targeting efficiëntie van GnRH conjugaten op de gegeven celkweek te voorspellen, en bieden een goede basis voor verdere experimenten in het onderzoek van GnRH-gebaseerde drug delivery systemen.

Afbeeldingen verkregen door confocale laser scanning microscopie (CLSM) bieden een spectaculair informatie over de opname van GnRH-FITC conjugaten van de gegeven celkweek in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Parallel aan deze GnRH-FITC conjugaten, de aanwezigheid van de GnRH-IR op het celoppervlak ook controleerbaar door de CLSM experiment. Verder kan door toepassing van een ver-rode kleuring DNA fluorescente probe, is het mogelijk om de kernen van cellen tegenkleuring naast G...

Selectief gemerkte fluorescerende GnRH-I, -II en -III derivaten betrouwbare middelen voor het opsporen en kwantificeren van de cellulaire opname. Dit manuscript introduceert experimenten te visualiseren, kwantificeren en te vergelijken de opname efficiëntie van deze GnRH conjugaten in diverse cellijnen.

In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effectiviteit van op GnRH gebaseerde systemen voor geneesmiddelentoediening in humane kankercelculturen te onderzoeken en te voorspellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van gerichte antikankertherapie, zoals de efficiëntie waarmee cellen van verschillende humane kankertypen GnRH-gerichte antikankermiddelen opnemen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat er gebruik wordt gemaakt van nieuwe fluorescentielabelled GnRH-analogen, waardoor gelijktijdig gebruik van confocale microscopie en flowcytometrie-analyse mogelijk is.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot anti-kankertherapie, omdat GnRH-receptoren sterk tot expressie komen op verschillende typen kankercellen, wat selectieve targeting van deze cellen mogelijk maakt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Bianka Gurbi, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het verwijderen van het kweekmedium uit elk van de zeven wells van een gezaaide microscopische slide.Voeg vervolgens 250 µL van het voorverwarmde complete medium toe aan de negatieve controleput en 250 µL van het voorverwarmde GnRH fit seed behandelmedi

in-vitro-imaging-quantification-drug-targeting-efficiency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op...

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo nabije-infrarood fluorescentie xenograft beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Flowcytometrie en Microscopie

Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een snelle werkwijze voor het bepalen van de relatieve concentraties van fluorescent gelabelde verbindingen binnen en tussen weefsels of behandelingsgroepen. Omgekeerd kwantitatieve fluorescentie histologie, terwijl arbeidsintensiever, maakt de kwantificering van de absolute weefselconcentraties van gelabelde moleculen.

Het gebruik van Ex Vivo Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

Hier presenteren we een protocol om de afbeelding cellen die groen fluorescerend eiwit-tag soort angiotensine 1a receptoren tijdens endocytose geïnitieerd door angiotensine II behandeling. Deze techniek omvat labeling lysosomen met een tweede fluorescerende marker, en vervolgens met behulp van software om de co-lokalisatie van receptor en lysosomen te analyseren in drie dimensies in de tijd.

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Dit protocol beschrijft confocale microscopie detectie van G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) internalisatie in zoogdiercellen. Het omvat de basis-celkweek, transfectie, en confocale microscopie procedure en zorgt voor een efficiënte en gemakkelijk te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en de internalisering van-fusion uitgedrukt GPCR detecteren.

Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Beschrijven we een protocol voor preklinische in vivo volgen van kanker uitzaaiingen. Het is gebaseerd op een verslaggever van de radionuclide-fluorescentie combineren de natrium jodide symporter, ontdekt door niet-invasieve [18F] Zilvertetrafluorboraat-PET, en een fluorescente proteïne voor gestroomlijnde ex vivo bevestiging. De methode is toepasbaar voor preklinische in vivo cel bijhouden dan tumor biologie.

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.

In Vivo Beeldvorming van transduction efficiëntie van cardiale targeting Peptide

Leer fluorescerende GnRH-analogen gebruiken voor in vitro beeldvorming en kwantificering van celopname in humane kankercellijnen. Deze methode combineert confocale microscopie met flowcytometrie voor gerichte kankertherapie-onderzoek.

In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

Meer video's verkennen