In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

Het algemene doel van deze procedure is om de werkzaamheid van GnRH-gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen in humane kankercelculturen te onderzoeken en te voorspellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van gerichte antikankertherapie, zoals hoe efficiënt cellen van verschillende humane kankertypes GnRH-getargete antikankergeneesmiddelen opnemen. Het grote voordeel van deze methode is dat het gebruikmaakt van nieuwe fluorescerend gelabelde GnRH-analogen die gelijktijdig gebruik van confocale microscopie en flowcytometrie-analyse mogelijk maken.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar antikankertherapie omdat GnRH-receptoren sterk tot expressie worden gebracht op verschillende kankerceltypen, waardoor selectieve targetering mogelijk is. De procedure zal worden gedemonstreerd door Bianka Gurbi, een doctoraalstudent uit mijn laboratorium. Om te beginnen, verwijdert u het gekweekte medium uit elk van de zeven putjes van een gezaaide microscoopplaat.

Voeg vervolgens 250 microliter van het voorverwarmde volledige medium toe aan de negatieve controleput en 250 microliter van het voorverwarmde GnRH-fitzaadbehandelingsmedium in elk van de resterende zes putjes. Incubeer de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius, vijf procent koolstofdioxide gedurende vijf uur. Na vijf uur incubatie, aspireer het medium uit elke put en was de cellen met 250 microliter PBS.

Voeg vervolgens 250 microliter fixeeroplossing toe aan elke put en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Zodra de cellen zijn gefixeerd, gooi de fixeeroplossing weg en was de cellen met 250 microliter PBS. Voeg 250 microliter van een vijf micromolar fluorescerende sonde-oplossing, bereid in PBS, toe aan elke put en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Na het verwijderen van de fluorescerende sonde-oplossing, was de cellen voorzichtig twee keer met 250 microliter PBS. Voeg tenslotte drie tot vier druppels montagemedium toe aan elke put. Bewaar de plaat in het donker bij kamertemperatuur totdat deze onder een microscoop wordt afgebeeld.

Verwijder het gekweekte medium uit elk van de vijf putjes van een gezaaide microscoopplaat. Voeg vervolgens 250 microliter van het voorverwarmde volledige medium toe aan de negatieve controleput en aan de tweede put met de onbehandelde cellen. Behandel de cellen in de drie resterende putjes met het voorverwarmde behandelingsmedium dat 10 micromolar GnRH FITC bevat.

Incubeer de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius, vijf procent koolstofdioxide gedurende één uur. Verwijder vervolgens het medium alleen van de behandelde cellen en was de cellen met 250 microliter van het voorverwarmde volledige medium. Verwijder vervolgens het wasmedium.

Voeg vervolgens 250 microliter van het voorverwarmde volledige medium toe aan elk van de drie putjes. Incubeer de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius, vijf procent koolstofdioxide gedurende één uur. Na incubatie, gooi het medium uit alle vijf putjes weg en was de cellen met 250 microliter PBS.

Verwijder vervolgens het PBS en fixeer de cellen met 250 microliter fixeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi vervolgens de fixeeroplossing weg en was de cellen met 250 microliter PBS. Voeg 250 microliter blokkeeroplossing toe aan elke put en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende één uur.

Aspirieer de blokkeeroplossing uit elke put behalve de negatieve controle. Na het wassen van de cellen met 250 microliter PBS, voeg 250 microliter primaire antilichaam-oplossing toe aan elke put. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende één uur in een donkere plaats.

Verwijder oplossingen uit elk van de vijf putjes en was de cellen met 250 microliter PBS. Verwijder vervolgens het PBS en voeg 250 microliter secundaire antilichaam-oplossing toe. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende één uur in het donker.

Aspirieer de oplossing uit elke put en was de cellen met 250 microliter PBS. Verwijder het was-PBS en voeg vervolgens 250 microliter PBS met vijf micromolar fluorescerende sonde toe aan elke put. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de fluorescerende sonde-oplossing uit elke put en was de cellen twee keer voorzichtig met 250 microliter PBS. Voeg tenslotte drie tot vier druppels montagemedium toe aan elke put. Bewaar de plaat in het donker bij kamertemperatuur totdat deze onder een microscoop wordt afgebeeld.

Beeld de cellen af onder een omgekeerde confocale laserscanningmicroscoop. Schakel de 488 nanometer en de 633 nanometer lasers in. Controleer de laserversterking en de grootte van de pinhole.

Beeld de negatieve controle-staal af. Optimaliseer het signaal dat voor de kern wordt waargenomen en pas het signaal van FITC en Alexa 546 aan zodat het dicht bij nul is. Beeld vervolgens, met dezelfde parameters, de behandelde staaltjes af.

Gooi het volledige medium uit alle zeven putjes van een gezaaide kweekplaat. Voeg vervolgens een milliliter voorverwarmd volledig medium toe aan de negatieve controleput en een milliliter van het voorverwarmde behandelingsmedium in de resterende zes putjes. Incubeer de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius, vijf procent koolstofdioxide gedurende vijf uur.

Na het weggegooien van het medium uit alle putjes, was de cellen voorzichtig twee keer met twee milliliter PBS. Gooi het PBS weg en voeg vervolgens 500 microliter Trypsin EDTA-oplossing toe aan elke put. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius tot de cellen loslaten, wat ongeveer 10 minuten zal duren.

Gebruik een milliliter volledig medium om de Trypsin in elke put te neutraliseren en schud de plaat. Suspensieer vervolgens de cellen door voorzichtig te pipetteren. Breng de suspensies over in afzonderlijke FACS-buizen en centrifugeer de monsters bij 150 keer G gedurende vier minuten bij vier graden Celsius.

Decanteer de supernatanten voorzichtig. Voeg vervolgens