Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

Het algemene doel van deze technieken is om een gereedschapskist te bieden voor het mogelijk maken, bewaken en kwantificeren van cellulaire senescentie. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de identificatie en kwantificering van cellulaire senescentie en de biologische factoren die cellulaire en organismische veroudering reguleren. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze een verscheidenheid aan methoden omvatten voor het bewaken van cellulaire senescentie in verschillende modellen, weefsels en celtypen.

Begin met het plateren van de vroege passage proliferatieve cellen van belang op een lage dichtheid in de juiste schaal voor de analyse. En kweek de cellen een nacht in een weefselkweekincubator. Wanneer de cellen 50-60% confluent zijn, zuig het groeimedium af en was de cellen twee keer met PBS.

Na de tweede wasbeurt, bedek de cellen met een dunne laag PBS. En stel de cellen bloot aan een enkele dosis gammastraling van 10 graden. Vervang de PBS door groeimedium.

En plaats de cellen terug in de incubator. Ververs het medium elke 48 tot 72 uur met dagelijkse monitoring van morfologische veranderingen onder een lichtmicroscoop. Zeven tot 10 dagen na de bestraling, ontdooi alle reagentia van een commerciële senescentie-geassocieerde beta-galactosidase assaykit in een 37 graden Celsius waterbad.

Wanneer alle reagentia kamertemperatuur hebben bereikt, bereid de fixeer- en kleuroplossing volgens de instructies van de fabrikant voor. En was elke put voorzichtig met PBS op kamertemperatuur. Zorg ervoor om de cellen voorzichtig te spoelen, aangezien senescentiecellen niet goed hechten en gemakkelijk tijdens wasbeurten kunnen worden verwijderd.

Fixeer de cellen in elke put met één milliliter fixeeroplossing per put gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Gevolgd door twee wasbeurten van twee milliliter PBS per put. Voeg vervolgens één milliliter beta-galactosidase kleuroplossing toe aan elke put en bedek de plaat met aluminiumfolie voor een 24 tot 48 uur durende kweek in een 37 graden Celsius incubator zonder koolstofdioxide.

Controleer de cellen na 24 uur. Wanneer de cellen voldoende gekleurd zijn, vervang de beta-gal oplossing door verse PBS en bekijk de culturen onder een lichtmicroscoop met een gekoppelde camera bij een 10x of hogere objectief. De senescentie-geassocieerde beta-galactosidase cellen zullen blauw verschijnen.

Vervolgens, verkrijg ten minste vijf niet-overlappende beelden per put. En tel handmatig het totaal aantal senescentie-geassocieerde beta-galactosidase positieve cellen en het totaal aantal cellen per beeld om het percentage senescentie-geassocieerde beta-galactosidase cellen per put te berekenen. 10 dagen na gammastraling, was de cellen drie keer met PBS.

Na de laatste wasbeurt, vervang de PBS door 2,5 milliliter serumvrij medium, aangevuld met antibiotica per zes centimeter schaal en plaats de cellen terug in de weefselkweekincubator voor een nacht. De volgende ochtend, giet het medium in een conische buis op ijs. En was de cellen twee keer met verse PBS.

Vervolgens, trypsiniseer en tel de cellen. Centrifugeer vervolgens het supernatant dat is geoogst uit de celkweekplaat. En filter het vervolgens door een 0,45 micrometer spuitfilter en bevries het medium in 500 microliter aliquoten bij 80 graden Celsius tot hun analyse door ELISA.

Verhoogde senescentie-geassocieerde beta-gal kleuring komt voor bij replicatieve en door DNA-schade geïnduceerde senescentie. Merk de vergrote platte vorm van de senescentiecellen op in vergelijking met het spilvormige uiterlijk van de prolifererende fibroblasten. In dit experiment werden prolifererende jonge of replicatief senescentiecellen gefixeerd zoals beschreven in het geschreven protocol.

En gekleurd met een antilichaam tegen een biomerker voor DNA dubbelstrengsbreuken en DAPI. Met een duidelijke toename in het aantal DNA dubbelstrengsbreukfosi waargenomen in de senescentiecellen. RT-qPCR analyse van senescentie-geassocieerde secretoire fenotype factoren onthult dat ten minste enkele factoren opgereguleerd zijn na gammastraling geïnduceerde senescentie in laag passage humane diploïde fibroblasten op het MRNA niveau.

Dit wordt verder bevestigd door ELISA van de gamma bestraalde celkweeksupernatanten. Eenmaal beheerst, kunnen de DNA-schade inductie en SA beta-gal kleuring in ongeveer 30 minuten hands-on tijd worden voltooid. Het conditiemedium voor het kwantificeren van SASP-eiwitniveaus kan in ongeveer 30 minuten worden bereid.

Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om ze te monitoren op morfologische veranderingen in de celculturen voordat u doorgaat naar de kwantificering van de senescentiemarker. Na de ontwikkeling ervan, hebben deze technieken de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van veroudering en kanker om senescentie in een verscheidenheid aan weefsels, celculturen en modelorganismen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellulaire senescentie kunt induceren, bewaken en kwantificeren.