Protocollen voor het onderzoeken van de host-weefsel Distribution, transmissie-mode, en het effect op de Host Geschiktheid van een Densovirus in de katoenkever

Het algemene doel van dit protocol is om het effect van een Densovirus, HaDV2, op zijn gastheer, Cotton Bollworm, te bestuderen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van virus-gastheer interacties te beantwoorden, zoals het effect van nu path-staande virussen op hun gastheren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de larven die worden gebruikt om virus-positieve en negatieve stammen te construeren, afkomstig zijn van dezelfde par-ne-co-gastheer, waardoor dezelfde genetische achtergrond wordt gegarandeerd.

Om het experiment te beginnen, paren acht paren van pas gesloten motten door een plastic kooi per paar te gebruiken, bedekt met katoengaas om goede ventilatie te garanderen en te dienen als een ovum-positie substraat. Om de kans op het verkrijgen van een virusvrije kolonie te vergroten, gebruik minimaal 30 paren van enkelpaar-paringen. Voer volwassen motten met een katoenbal gedrenkt in een 10% suiker en 2% vitamine oplossing en ververs de oplossing dagelijks.

Vandaag na het paring, als vrouwelijke volwassenen hun eieren op het katoengaas leggen, begin dan dagelijks het gaas te vervangen. Verzamel en bewaar gaas bevattende eieren in dezelfde groeikamerra als de volwassen motten totdat de eieren uitkomen. Breng onmiddellijk de nieuw uitgekomen larven over naar nieuwe 24-well platen met één individu per putje.

Vijf dagen na de eerste ei-leg datum, verzamel de ouder motten en bewaar ze in vloeibare stikstof. Controleer op HaDV2 van de ouders met PCR met specifieke primers, en bewaar de HaDV2-vrije individuen als de HaDV2-vrije niet-geïnfecteerde stam. Verzamel volwassen motten afzonderlijk en bewaar ze onmiddellijk in vloeibare stikstof.

Maal de verzamelde individuele motten volledig in vloeibare stikstof met behulp van een gesteriliseerde mortel en pestel. Breng ongeveer 10 microgram puin over in een schone 1,5 milliliter buis. Breng vervolgens het resterende puin over in een nieuwe buis en bewaar ze onmiddellijk bij 80 graden Celsius.

Extract DNA uit de 10 microgram puin volgens de protocollen die door de fabrikant worden geleverd. Zodra het motten DNA is geïsoleerd, controleer op HaDV2 met behulp van het protocol. Volgens de resultaten, verdeel het resterende puin in twee groepen: HaDV2 positief en HaDV2 negatief.

Voeg een milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing, of PBS, toe aan elk individu om de resterende larvale puin volledig op te lossen. Koel de centrifuge voor op vier graden Celsius, draai vervolgens het homogenaat. Op ijs, filter de vloeibare supernatant met de 0,22 micron membraanfilter.

Verzamel 200 microliter per buis van de gefilterde vloeistoffen, en bewaar ze onmiddellijk bij 80 graden Celsius. Om de orale infectie-efficiëntie te bepalen met de HaDV2 geïnfecteerde gefilterde vloeistoffen van verschillende concentratie door de vloeistof met HaDV2 te verdunnen. In een afzuigkap verspreid gelijkmatig 200 microliter van HaDV2 bevattende gefilterde vloeistoffen voor elke concentratie op het oppervlak van het vaste kunstmatige dieet.

Begin vervolgens met het overbrengen van 100 pas uitgekomen larven naar het HaDV2 bevattende kunstmatige dieet in een petrischaal. Klop voorzichtig de katoengaas inclusief pas uitgekomen larven om de larven van het gaas over te brengen naar een vel wit papier. Klop het papier voorzichtig zodat de larven zijde spinnen en van het papier afballonnen.

Gebruik gesteriliseerde pincetten om de zijde aan te raken en de larven naar een petrischaal te verplaatsen. Na 48 uur, verplaats één individu per putje op het kunstmatige dieet naar 24-well platen. Herschik de larven geïnoculeerd met HaDV2, met behulp van dezelfde concentraties tot het volwassen stadium.

Controleer op HaDV2 infectiestatus van de volwassenen met behulp van het protocol. Volwassenen geïnoculeerd met 10 tot het achtste kopienummer per microliter HaDV2 leverden 100% infectie op en worden bewaard als HaDV2 positieve stam. Om besmetting te voorkomen, steriliseer de pincetten en scharen in 75% ethanol driemaal en verwarm ze vervolgens in de vlam van een alcohollamp.

Gebruik een analytische weegschaal om de lege buizen te wegen die worden gebruikt om de weefsels op te slaan. Plaats vervolgens de larven en volwassen motten van de geïnfecteerde stam ongeveer vijf minuten op ijs. Bevestig de bevroren larven op cystosepiment met behulp van twee insectenpincetjes ingebracht in de intersegmentale membranen nabij het hoofd en het laatste buiksegment.

Snij vervolgens in het achterste gedeelte van de buik de proleg van de larven zodat het hemolymf vloeit uit. Gebruik een pipette om ongeveer 10 microliters larvale hemolymf binnen ongeveer 10 seconden te pipetten om bruining en coagulatie van het hemolymf te voorkomen. Maak met een schaartje een incisie in de cuticula variërend van de laatste intersegmentale membraan tot het hoofd.

Gebruik twee pincetten om voordarm, middendarm, achterdarm, vetlichaam en malpijische buisjes te disseceren. Om de besmetting van de resterende weefsels met het hemolymf tijdens de dissectie te voorkomen, was de gedisseceerde weefsels in PBS buffer. Meng weefselmonsters van drie individuen samen als één replicant.

Breng onmiddellijk elk weefsel over naar de buizen in vloeibare stikstof. In een schone petrischaal met PBS buffer, disseceer de weefsels van vrouwelijke en mannelijke volwassenen en breng onmiddellijk elk weefsel over naar de buizen in vloeibare stikstof. Weeg de buizen en de bovenstaande weefsels samen afzonderlijk en bereken de massa van de weefsels.

Extract DNA uit deze weefsels en voer kPCR uit om de virale titerb van elk weefsel te kwantificeren. Plaats minimaal 100 poppen of pas uitgekomen volwassen motten afgeleid van de niet-geïnfecteerde stam in een katoengaas-bedekte 5-liter draadgaas kooi. Na twee dagen zullen gepaarde volwassen vrouwt