Immunofluorescentie analyse van stress granule vorming na bacteriële uitdaging van zoogdiercellen

Het algemene doel van dit experiment is om de effecten van een bacteriële infectie te beoordelen op het vermogen van gastheercellen om stressgranules te vormen als reactie op exogene stress. Deze methode is een waardevol instrument in het veld van de cellulaire microbiologie om vast te stellen of een bepaald pathogeen in staat is om het gehele stressgranule-pad te wijzigen of te ondermijnen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat stressgranules op een rigoureuze en geautomatiseerde manier kwalitatief en kwantitatief kunnen worden geanalyseerd met behulp van gratis programma's voor beeldanalyse.

Deze methode biedt inzicht in de dynamiek van de vorming en samenstelling van stressgranules en hoe deze parameters worden beïnvloed door een specifieke pathogeen. Dank u wel. Inoculeer, voorafgaand aan de uitdaging, een rode S.flexneri M90T bacteriekolonie van een vers uitgestreken tryptisch soja-agar 1% Congo-rood agarplaat in een conische buis van 15 milliliter, met daarin acht milliliter tryptisch sojebouillon.

Draai het deksel goed vast en incubeer de kolonie een nacht met schudden bij 222 RPM en 30 °C. Subcultuur de volgende dag 150 µL van de bacteriën in acht ml verse tryptic soy broth gedurende ongeveer twee uur bij 37 °C en 222 RPM om een inductie van de expressie van virulentiegenen in de late exponentiële fase te initiëren en de infectiviteit van de bacteriën te verhogen. Wanneer de optische dichtheid van de subcultuur tussen 0,6 en 0,9 ligt, brengt u één ml van de bacteriën over in een 1,5 ml buisje om deze via centrifugatie te verzamelen.

Resuspendeer de pellet in infectiemedium tot een optische dichtheid van één. Aspireer vervolgens de supernatanten uit elke well van een HeLa-celcoverslipcultuur. Was de HeLa-cellen daarna voorzichtig met 500 µL vers HeLa-celmedium op kamertemperatuur per well.

Vervang het wasmiddel door 500 µL infectiemedium per putje en centrifugeer de 24-wells plaat om de bacteriën op de cellen te centrifugeren. Plaats de bezonken bacteriële coculturen gedurende 30 minuten in een weefselkweekincubator op 37 °C om de infectie van de gastheercellen te faciliteren. Verwijder aan het einde van de incubatie de exogene bacteriën van de cellen door drie keer te spoelen met 1 mL vers HeLa-kweekmedium op 37 °C per wasbeurt.

Bedek vervolgens de geïnfecteerde cellen met één milliliter vers cultuurmedium dat gentamicin bevat en plaats de plaat terug in de celcultuurbroedmachine. Vervang aan het einde van de incubatie het medium door 500 microliters van het geschikte cultuurmedium, aangevuld met de betreffende stressfactor, en plaats de cellen terug in de weefselkweekbroedmachine. Aspireer na één uur het supernatant volledig en fixeer de monsters gedurende 30 minuten in 0,5 milliliter 4%paraformaldehyde in PBS op kamertemperatuur.

Gooi vervolgens het fixatiemiddel in de juiste afvalbak en was de dekglasjes gedurende twee minuten met één milliliter tris-gebufferde zoutoplossing onder zacht schudden. Aspireer aan het einde van de wasstap de TBS volledig en permeabiliseer de cellen in elke put met 500 microliters 0,3% Triton X-100 in TBS. Vervang na 10 minuten de permeabiliserende oplossing door één milliliter TBS, draai de plaat voorzichtig rond en vervang de TBS door één milliliter blokkeringsoplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Om de cellen te labelen met een primaire antilichaamcocktail naar keuze, plaatst u 50 microliters van het primaire antilichaammengsel per dekglas op een stuk plastic Parafilm dat stevig op het werkblad is geplakt. Gebruik vervolgens een pincet om het eerste dekglas op te pakken. Dep de rand van het dekglas op een stuk keukenpapier om overtollig vloeistof te verwijderen.

Plaats het dekglas voorzichtig op de druppel en incubeer de dekglazen onder de juiste labelingscondities. Zet na afloop van de incubatie met het primaire antilichaam elk dekglas over naar een individuele well van een nieuwe 24-wellplaat die één milliliter TBS per well bevat, en was de cellen drie keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een plaatshaker. Label na de laatste wasbeurt de cellen op elk dekglas met de juiste cocktailmix van secundaire antilichamen, zoals zojuist gedemonstreerd.

Incubeer de dekglasjes gedurende één uur in het donker bij kamertemperatuur. Na afloop van de incubatie voor de labeling met het secundaire antilichaam worden de cellen drie keer gewassen in één milliliter PBS in een nieuwe 24-well plaat onder zachte schudding, zoals zojuist gedemonstreerd, maar beschermd tegen licht. Dip na de laatste wasbeurt elk dekglasje kort in gedeïoniseerd water om het zout te verwijderen, dep de randen van het dekglasje op een tissue en monteer de dekglasjes zorgvuldig op vijf microliters fluorescentiemontagemedium per glazen microscoop OBJECTGLAS, zonder luchtbellen.

Verzegel vervolgens het dekglas met nagellak. Bewaar de preparaten op de juiste wijze tot aan de beeldvorming. Om de cellen via fluorescentie-confocale microscopie te beelden, begint u met het selecteren van het juiste objectief en de juiste fluorescentiekanalen voor de beeldacquisitie.

Neem vervolgens beeldstacks van de cellen op met de geschikte imaging-software. Wanneer alle beelden zijn vastgelegd, gebruikt u de passende software voor beeldanalyse om de beeldstacks samen te voegen en de stacks op te slaan als TIFF-bestanden. Laad daarna een controle- en een experimenteel TIFF-beeld in het analyseplatform en selecteer Lookup Table om de kanaalparameters in het Sequence-venster te openen.

Klik op alle selectievakjes van de kanaaltabbladen om alle kanalen te deactiveren. Klik vervolgens op kanaal nul en klik op de kleurbalk van kanaal nul om de gewenste kleur te selecteren, waarbij de intensiteit van het kanaal naar behoefte wordt verhoogd om alle structuren zichtbaar te maken. Nadat de juiste kleurkanalen voor de experimentele analyse zijn geselecteerd en aangepast, selecteert u het canvas-tabblad en past u de zoomregelaar aan om ongeveer 10 cellen per gezichtsveld weer te geven.

Klik met de polygoontool op de cel van belang en trek de lijn rond de cel om de celgrens af te bakenen. Om dit interessegebied te benoemen, klikt u in het venster voor interessegebieden met de rechtermuisknop op de cel van belang en dubbelklikt u op de naam van het interessegebied om deze te wijzigen. Nadat alle cellen van belang op dezelfde manier zijn geselecteerd en benoemd, opent u de Spot Detector-applicatie binnen het tabblad detectie en tracking.

Open het tabblad Voorbewerking en selecteer het te analyseren kanaal. Selecteer in het tabblad Detector de optie Detecteer heldere vlekken op een donkere achtergrond en kies de juiste schaal en gevoeligheid. Selecteer onder het tabblad Region of Interest het voorgestelde interessegebied uit de sequentie.

Selecteer onder het tabblad Filtering de optie NoFiltering. Selecteer in het tabblad Output de gewenste output. Selecteer Remove previous spots rendered as regions of interest en klik op no file selected om de map te selecteren waarin het bestand moet worden opgeslagen.

Select vervolgens onder het tabblad Display de gewenste opties en klik op Start Detection. Binnen de software voor beeldanalyse kan de spotdetector worden gebruikt om de stressgranules binnen elk van de aangewezen regio's van belang te identificeren. Er kan vervolgens een binair beeld worden gegenereerd om alle geïdentificeerde stressgranules weer te geven.

De analyse van stressgranula moet zorgvuldig worden afgestemd op elk geanalyseerd stressgranula-monster. Zo leiden wijzigingen in de geëiste grootte van het gedetecteerde interessegebied, of wijzigingen in de gevoeligheid van de detectieparameters, tot variërende resultaten. Bij grotere pixelgrootte-schalen zullen kleinere stressgranula niet worden geteld, waardoor het aantal stressgranula zal afnemen.

Hoewel het verhogen van de gevoeligheid leidt tot een toename in het aantal stressgranules. In dit experiment gaf bijvoorbeeld een schaal van twee met een gevoeligheid van 100 het beste resultaat voor de stressgranule-marker G3BP1. Terwijl een schaal van twee met een gevoeligheid van 55 het beste resultaat gaf voor de EIF3B stressgranule-marker.

Het oppervlak kan vervolgens worden berekend op basis van de grootte van de stressgranules. Frequentieverdelingsgrafieken zijn nuttig om verschuivingen in de grootte van stressgranules tussen verschillende celpopulaties te accentueren. Daarnaast kan de intensiteit van de fluorescentie informatie verschaffen over de kwaliteit van de geanalyseerde stressgranules.

Zodra de methode onder de knie is, kan de 'whole cell challenge' in ongeveer zes tot zeven uur worden uitgevoerd, en de analyse kan in nog eens twee tot drie uur worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de controle- en experimentele monsters altijd gelijktijdig en onder dezelfde omstandigheden moeten worden verwerkt om variabiliteit in de gegevens te minimaliseren. Na deze procedure kan de analyse ook worden uitgebreid naar een driedimensionaal volume om aanvullende inzichten te verkrijgen in de lokalisatie van stressgranules.

Deze semi-geautomatiseerde procedure maakt een rigoureuze en onbevooroordeelde analyse van stressgranules in niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen mogelijk. Het kan voorheen onbekende subversies van het stressgranule-pad onthullen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen met bacteriën infecteert, hoe u de vorming van stressgranules induceert en hoe u een semi-geautomatiseerde aanpak gebruikt voor het kwalitatieve en kwantitatieve analyseren van stressgranules.

En vergeet niet dat het werken met Shigella flexneri en stress-granule-inducerende middelen zoals clotrimazol gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, het werken in een BL2-laboratorium en het correct weggooien van alle reagentia noodzakelijk zijn.