Name: Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Leer een enkelmolecuul-analyse van laser-gelokaliseerde interstrengkruisverbindingen in genomisch DNA om cellulaire reacties op DNA-schade te bestuderen. Deze methode maakt directe beeldvorming van DNA-letsels mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) en de Fanconi Bloedarmoede Research Fund.

1. Bereiding van Dig-TMP <ol><li> Meng 50 mg (0,18 mmol) 4&#39;-chloormethyl-4,5&#39; , 8-trimethylpsoraleen en 590 mg (2,7 mmol) 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine in een droge 25 ml rondbodem -Bottom kolf onder stikstof. Voeg 10 mL tolueen en 12 h onder terugvloeikoeling. Verwijder oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk. <ol><li> Zuiver het residu door flitskolomchromatografie over silicagel. Elueer de kolom met chloroform, methanol en 28% ammonia (9: 1: 0,5). Damp het oplosmiddel in een roterende verdamper onder verminderde druk en herstellen van de zuivere 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoraleen als een lichtgele viskeuze vloeistof. </li><li> Meng 5,5 mg (0,012 mmol) 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoraleen met 5 mg (0,008 mmol) digoxigenine NHS-ester in een droge rondbodemkolf onder stikstof. Voeg 0,5 mL watervrije dimethylformamide (DMF) eend 3,4 pl trimethylamine en roer bij 50 ° C gedurende 18 uur. </li><li> Verwijder oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk. </li><li> Los het residu in een minimale hoeveelheid dichloormethaan. Breng de oplossing in 2 pl spots horizontaal over de bodem van een preparatieve dunne-laag plaat met silicagel als stationaire fase. Voer de preparatieve TLC in chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxide (8: 1: 0,1). </li><li> Plak de plaat, behalve in de verticale randen en identificeren van de band product met korte golflengte UV 254 nm lamp. Schrapen het product uit de plaat met een spatel en isoleren van het zuivere product met chloroform: methanol: 28% ammoniumhydroxide (8: 1: 0,1) mengsel. </li><li> Verwijder oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk. Los het overblijvende pellets in 1 ml 50% EtOH: H2O, af in 50 gl aliquots in 1,5 ml buizen (~ 20 monsters) en drogen in een centrifugale verdamper totdat al het oplosmiddel wordt verdampt (~ 3 uur). </li><li>Weer oplossen elk aliquot in 200 pl 50% EtOH: H2O en droog weer een centrifugale verdamper. Lossen elk monster opnieuw in 200 pl 50% EtOH: H2O, drogen in een centrifugale verdamper en opslag pellets bij -20 ° C voor lange termijn opslag. </li></ol></li><li> Gebruikt, los de pellet in 50 pl 50% EtOH: H2O Bereid een 1: 100 verdunning van de opgeloste Dig-TMP in H2O en meet OD bij 250 nm. De extinctiecoëfficiënt van Dig-TMP is 25.000. De oplossing is stabiel gedurende ongeveer een maand indien bewaard bij -20 ° C. Controleer de concentratie door meting van OD bij 250 nm voor elk gebruik. <ol><li> Bereken voorraadconcentratie: Abs x 100 x 10 6 / 25.000 = concentratie (in uM). Gewoonlijk is de voorraadoplossing ongeveer 3 mM. Het is belangrijk om in dit bereik, teneinde de hoeveelheid EtOH toegevoegd aan het medium te minimaliseren. </li></ol></li></ol> 2. Laser Gelokaliseerde Dig-TMP ICL <ol><li> Perform laser lokalisatie met een confocale microscoop met een SRS stikstoflaser (337 nm) gepompt door een kleurstof cel uitzenden van een lijn van 365 nm en bakken 3 ns pulsen bij 10 Hz, met een vermogen van 0,7 nW. </li><li> Voeg een verticale markering aan de zijkant van een 35 mm glazen bodem celkweek schotel met een markeerstift. Kras kruis in het midden van het glas op het kweekoppervlak met een diamant pen, zodanig dat de zwarte streep op de zijkant van de schaal is bovenaan één arm van het kruis. Het kruis is duidelijk op de groei oppervlak van het glas, zodat de cellen in hetzelfde brandvlak. </li><li> Steriliseer de plaat na merken met een spoeling van 70% EtOH. Dry voor plating cellen. </li><li> Plate cellen (standaard laboratorium stammen zoals HeLa of U2OS) in het kruis gemarkeerde cultuur gerechten een of twee dagen voor. Cell moeten actief worden delen en 50-70% confluent op de dag van het experiment. Incubeer 24 uur bij 1 uM 5-chloor-2-deoxyuridine (CldU) uniform label DNA. </li><li> ToevoegenGraaf-TMP in 50% EtOH: H2O ter celkweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 20 uM. Breng het medium tot 37 ° C. Verander het medium over de cellen en plaats in incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 30 minuten om de Dig-TMP in evenwicht. </li><li> Terwijl de cellen incuberen, stellen de x / y-coördinaten van het gezichtsveld waarin de laser is geactiveerd. Volg ijkprocedure de fabrikant waarin de laser wordt bestuurd door de software een spiegelend glas schuiven langs een horizontale en diagonale lijn etsen. De twee lijnen bepalen de grenzen van het veld waarin de laser een doel kan treffen. </li><li> Plaats de plaat in de klimaatkamer bij 37 ° C met gecontroleerde CO2 en vochtigheid op de microscoop podium en concentreer de olie 60X objectief op het kruispunt van het kruis. </li><li> Richt de 365 nm laserbundel een ROI, vastgesteld door de onderzoeker het vormgereedschap in de software, om een ​​strook van 3 &amp; vormen# 181; mx 0,6 urn. De omtrek van het ROI wordt geschreven door de cursor in kernen van cellen in de onmiddellijke nabijheid van het kruispunt van het kruis. Stel de z brandvlak richten de laser halverwege de kern. Met een laser in het gebied van 350-370 nm. 405 nm lasers kan niet crosslinks 19 induceren. LET OP: We vinden de ROI in nucleoplasmatische gebieden buiten de nucleoli, die kan worden onderscheiden van nucleoplasm in differentiële interferentie contrast (DIC) beeldvorming. </li><li> Controleer de focus en de activiteit van de laser door het verhogen van de energie-instelling tot een niveau voldoende om een cel (de cel wordt donkerder en dan verdwijnen) te wissen. Dit is een belangrijk diagnostisch voor een onbelemmerde lichtweg van de laser door de microscoop en vervolgens door het dekglaasje en in de cellen. <ol><li> Verlaag de instelling van het vermogen om net genoeg om de psoraleen en de ICL geïnduceerde DDR (dit moet empirisch worden bepaald voor elke laser / mic activerenroscope combinatie). Met een laser intensiteitsinstelling (1,7% here) die het DDR bij afwezigheid van psoraleen (gevolgd door de vorming van γ-H2AX) niet activeert. Opmerking: Dit is belangrijk voor het bepalen en de instellingen kunnen worden afgesteld indien de laserbron of een component in de lichtweg verandert. Volg de accumulatie van GFP gemerkte repair eiwitten zoals XPC of FAN1, die beide snel geworven (in seconden) van de laser psoraleen strepen, maar niet roi blootgesteld aan de laser alleen. Sommige eiwitten van de DDR verschijnen binnen enkele seconden, terwijl een paar minuten voor anderen kan nodig zijn. Het is noodzakelijk om het tijdsverloop bepalingen uit te voeren voor elk eiwit van belang. We stellen ook vast dat in cellen die niet werden blootgesteld aan de laser zijn er geen strepen te reageren eiwitten. </li></ol></li><li> Nadat alle cellen in een veld zijn gericht bewegen de plaat om een ​​nieuw veld, een verblijf in de buurt van het kruispunt van het kruis. </li><li> In experimenten ontworpen om de toonhoogte vanine de verdeling van afstanden tussen laesie bloot cellen aan de laser 20-25 gebied (4-5-cellen / veld) rondom het kruispunt. Om replicatie te analyseren in de nabijheid van de gelokaliseerde ICLs incubeer cellen met 10 uM 5-jood-2-deoxyuridine (IDU) na de laser afvuren. NB: De incubatietijd met IDU enigszins willekeurig. We hebben gebruikt zo kort als 20 min en zolang 60 min (zie hieronder). Langere pulsen (een paar uur) resulteren vaak in meerdere replicatie traktaten samenvloeien, waardoor de mogelijkheid verliezen om de afbeelding van de voortgang van enkele vorken. In sommige experimenten ces gelabeld met CldU gedurende 24 uur labelen DNA voorafgaand gelijkmatig blootstelling aan Dig-TMP gevolgd door pulsmerking van replicatie stukken. </li></ol> 3. Oogst van cellen en Stretching DNA Vezels <ol><li> Verwijder de plaat uit de fase verwijdert het medium en wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS-oplossing. Plaats een 10 ul druppel van een commerciële trypsine/ EDTA-oplossing bij kruispunt van het kruis in het midden van het glasoppervlak. </li><li> Incubeer gedurende 3-4 minuten bij kamertemperatuur (KT) en teken de trypsine-oplossing met de losgemaakte cellen in de pipet tip. Er is geen noodzaak om de trypsine te neutraliseren. </li><li> Plaats de druppel trypsine / EDTA met de cellen aan een uiteinde van een gesilaniseerd microscoopglaasje. Lyseren van de cellen en laat het DNA door toevoeging van 10 ui 0,5% SDS-oplossing en incubeer gedurende 3-4 minuten bij kamertemperatuur voorzichtig te mengen met de pipet tip, waardoor de omtrek van het zwembad te drogen. </li><li> Kantel de slede 20 ° en laat de vloeistof tot aan het einde draaien. De DNA vezels worden verlengd / uitgerekt door de hydrodynamische krachten van de stromende vloeistof. Laat de dia&#39;s drogen (-10 min) en fixeer 3: 1 methanol / azijnzuur gedurende 10 min. Montagehulpstukken verwijderen uit de fixeeroplossing en lucht drogen opnieuw. Op dit moment kunnen ze oneindig worden bewaard in 70% EtOH bij -20 ° C. Bij verwijdering van het 70% EtOH aan de lucht drogen vóór het next stap. </li><li> Wassen objectglaasjes in PBS, en vervolgens gedenatureerd in 2,5 M HCl gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Deze behandeling depurinates DNA dat de opgenomen gehalogeneerde nucleobasen toegankelijk voor antilichamen. </li><li> Neutraliseren slides in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Tweemaal spoelen in PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) gedurende 5 minuten elk. </li><li> Blok glijdt met 5% runderserumalbumine (BSA) en 10% geitenserum in PBS. Bedek de objectglaasjes voorzichtig met een parafilm de blokkerende oplossing gelijkmatig over de glijbaan en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Pipet 100 pi van 1: 200 verdunning in blokkeringsoplossing rat anti-broomdeoxyuridine (detecteert specifiek CldU) primair antilichaam elke dia. Bedek de objectglaasjes voorzichtig met een parafilm de verdunning gelijkmatig over de glijbaan en incuberen in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder het parafilm en was de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk. </li><li> Pipet 100 pl verdund (1: 100) geit anti-rat Alexa Fluor 647 in blokkeeroplossing elke dia. Bedek deschuift voorzichtig met een parafilm en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk. </li><li> Pipet 100 pl verdund (1:40) muizen-anti-broomdeoxyuridine (LDU detecteert en CldU Deze tweeledige specificiteit vereist de blokkering van CldU de rat anti- BrdU in de stand van incubatie.) Primair antilichaam en konijn anti-DIG antilichaam (1: 200 ) in blokkeeroplossing elke dia. Bedek de objectglaasjes voorzichtig met een parafilm en incubeer in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk. </li><li> Pipet 100 pl verdund (1: 100) geit anti-muis Alexa Fluor 488 andc (1: 5000) geiten anti-konijn probe (bijvoorbeeld Qdot 655) in blokkeeroplossing elke dia. Bedek de objectglaasjes voorzichtig af met parafilm en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de objectglaasjes drie keer in PBST gedurende 5 minuten elk. </li><li> Giet overtollige PBST op een papieren handdoek. Voeg 50 ul van antifade fixeermiddel op elk glaasje en bedek met een dekglaasje. Afbeelding of op te slaan voorniet meer dan 48 uur bij -20 ° C. </li></ol> 4. Fiber Imaging met fluorescentiemicroscopie <ol><li> Voeren beeldverwerving door een 63x objectief op een omgekeerde microscoop met een aangrenzende volledig gemotoriseerd filterwiel met FITC, Cy5 en Q Dot 655 detecteren. Het excitatiefilter 425 nm en de emissie filter 655 nm 20 nm gecentreerd bij de emissiepiek 20. </li></ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%3A+three+levels+of+DNA+repair+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2013).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li>
<li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate+effects%2C+endogenous+DNA+damage%2C+and+signaling+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li>
<li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li>
<li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts%3A+their+role+in+carcinogenesis%2C+epidemiology%2C+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li>
<li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs%3A+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li>
<li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li>
<li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li>
<li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li>
<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255(2011).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84(2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li>
<li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+%286-4%29+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li>
<li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA%3A+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li>
<li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De laser lokalisatie techniek vereist het gebruik van hechtende cellen met kernen die zichtbaar helderveld microscopie. We hebben geprobeerd om niet hechtende cellen, zoals primaire lymfocyten of losjes hechtende gekweekte cellen zoals AD293 hechten aan het glasoppervlak met celhechtend preparaten zoals polylysine of collageen, of meer complexe mengsels. Hoewel deze behandelingen van de cellen naar de oppervlakte kunnen binden, vinden we dat zij over het algemeen blijven afgerond waardoor het erg moeilijk om zich te con...

DNA wordt voortdurend aanval door exogene middelen zoals bestraling, ultraviolet licht, giftige stoffen, verbrandingsproducten, etc. Daarnaast wordt ook aangetast door endogene radicalen geproduceerd door oxidatief metabolisme. Deze hebben het potentieel om de integriteit van DNA 1 chemisch of fysisch te verstoren. Verstoringen in het genoom kan de DNA Damage Response (DDR), een werving en post-translationele modificatie cascade met honderden te activeren, zo niet duizenden, van eiwitten en microRNAs die betrokken zijn bij laesie reparatie, regulatie van de celcyclus, apoptose, veroudering, en inflammatoire pathways 2. De meeste van onze informatie over de DDR afkomstig uit studies met DSB. Dit is grotendeels vanwege de beschikbaarheid van technieken voor het inbrengen pauzes, zoals sequentiespecifieke onderbrekingen, in genoom DNA in levende cellen 3. Bovendien, de propensity van pauzes om brandpunten van DDR-eiwitten, die kan worden weergegeven door immunofluorescentie veroorzaken, is zeer nuttig geweest voor het identificeren van de kinetiek en eisen te reageren eiwitten. Een van de belangrijkste technologieën voor het bestuderen van de DDR werd geïntroduceerd door Bonner en collega&#39;s, die een laserstraal in de kernen van levende cellen 4 gebruikt om een streep van DSB&#39;s te richten in een &quot;Region of Interest&quot; (ROI). In feite, creëerden ze een langdurige focus op welke eiwitten van de DDR konden worden geïdentificeerd met immunofluorescentie. Dit werd geïllustreerd door de demonstratie van de sterke streep gefosforyleerd histon H2AX (γ-H2AX) in de laser-belichte cellen. Sindsdien is de laser aanpak toegepast in tal van studies van de DDR veroorzaakt door DSB. Hoewel krachtig en populair, en de bron van dramatische immunofluorescentie beelden, dient te worden opgemerkt dat in de meeste experimenten de laser intensiteit wordt aangepast om waarneembare resultaten te produceren, zonder zorg voor laesie identiteit,dichtheid of tussenruimte. Inderdaad, kan het moeilijk zijn om deze schattingen te maken. Aldus worden zij grotendeels genegeerd, ondanks het grote aantal laesies in DNA geïntroduceerd door lasers 5. Dit draagt bij aan de vele tegenstrijdigheden in de literatuur 6. In tegenstelling tot DSB meeste chemische modificaties van DNA niet de vorming van afzonderlijke foci van DDR eiwitten stimuleren. Dit is belangrijk in het licht van onze huidige kennis van laesie frequenties. Er wordt geschat dat menselijke cellen in kweek gebracht wel 50 DSB&#39;s per celcyclus grotendeels gevormd tijdens S-fase 7, 8, 9. Minder gevormd in niet-prolifererende cellen. Dit in tegenstelling tot het aantal nucleobase verlies of wijziging gebeurtenissen, die in de tienduizenden per cel / dag 1, 10. Dus, we weten het meest overde DDR opgewekt door gebeurtenissen die relatief zeldzaam, en veel minder over die geïnduceerd door helix vervormen laesies, die globaal slechts veel vaker voorkomen. Met het oog op vragen over de cellulaire respons op wijzigingen van genoom DNA covalente aan te pakken, willen we aan de slag met een helix verstorende DNA adduct dat inherent DDR inductieactiviteit gehad. Verder naar experimenteel ontwerp te vergemakkelijken en de interpretatie we geïnteresseerd waren in een structuur waarvan het binnenbrengen zou kunnen worden gecontroleerd met betrekking tot de tijd en was vatbaar voor visualisatie. Daarom ontwikkelden we een strategie gebaseerd op psoralen. Psoralenen goed gekarakteriseerd fotoactieve DNA intercalerende begunstiging 5&#39;TA: AT sites. In tegenstelling tot andere verknopingsmiddelen zoals stikstof mosterd en mitomycine C (MMC) niet met DNA reactief indien blootgesteld aan lange golf UV (UV) licht. De geïntercaleerde moleculen reageren met thymine basen aan tegenoverliggende strengen helix vervormen crosslinks tussen de strengen te produceren (ICL) 11. Met trimethyl psoralen gebruikt in onze experimenten meeste producten ICLs, relatief weinig monoadducten gegenereerd (minder dan 10%) 12 en intrastrengs verknopingen tussen aangrenzende basen op één streng worden gevormd. Omdat ze krachtige blokken replicatie en transcriptie, psoraleen en andere verknopingsmiddelen, zoals cis-platina en MMC, worden vaak gebruikt bij chemotherapie. Zo psoralen ingeschakeld studies dat de activering van de DDR, gevolgd door een helix vervormen structuur, en ook inzicht gegeven in de cellulaire reactie op een verbinding met de klinische belang. We synthetiseerden een reagens waarin trimethyl psoralen is verbonden met digoxigenine (Dig), een plantensterol niet in zoogdiercellen en vaak gebruikt als immunotag. De vereiste fotoactivatie maakt lokalisatie met laserlicht (365 nm) van psoraleen ICLs in vastgestelde ROI kernen in levende cellen. Deze kunnen worden weergegeven door immunofluorescence tegen de Dig tag. DNA herstel en DDR eiwitten verscheen in de strips van laser gelokaliseerde ICLs 13, 14. De DDR geactiveerd door de hoge laserintensiteiten gebruikt voor DSB&#39;s te produceren kan het gevolg zijn geïsoleerde of geclusterde schade 15, 16. Bijgevolg is de relevantie van de resultaten van deze experimenten natuurlijk voorkomende laesies aanwezig bij veel lagere concentratie, is onzeker. Op soortgelijke vragen over psoraleen adduct frequentie en tussenruimte in het DNA aan te pakken, hebben we geprofiteerd van DNA vezeltechnologie 17 en immunoquantum stippen. Quantum dots zijn veel helderder dan fluorescerende kleurstoffen en zijn niet gebleekt door blootstelling aan licht. Zo worden ze vaak gebruikt voor single molecule imaging 18 de toepassing waarvoor fluorescente kleurstoffen onvoldoende licht. DNA afzonderlijke vezels kunnen worden gespannen op glass schuiven en kan worden weergegeven door immunofluorescentie tegen nucleoside analogen ingebracht gedurende incubaties vóór oogst cel. We behandelde cellen met Dig-psoraleen en blootgesteld de ROI te laser micro bestraling. Vezels werden bereid uit de cellen en individuele Dig-psoraleen adducten kunnen worden gevisualiseerd met de immunoquantum stippen. Blootstellen van de cellen aan nucleoside-analogen relatief korte tijd (20-60 min) maakt de weergave van replicatie streken in de nabijheid van de laser gelokaliseerde ICL.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flass glass column 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Met Volocity Software</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>met een stikstof gepulseerde laser&nbsp;</td></tr><tr><td>dye cell</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 dye</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>New Comer Supply</td><td>Part # 5070</td><td>New Silane Slides</td></tr><tr><td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 op 40</td></tr><tr><td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 op 200&nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit anti Dig antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 op 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 op 5.000</td></tr><tr><td>AF647- goat anti Rat IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 op 100</td></tr><tr><td>AF488-goat anti mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 op 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp;met Axiovision software</td></tr><tr><td>Q-dot 655 filter</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

single molecule analyse van de laser gelokaliseerde psoralen adducten

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Het DNA Damage Response (DDR) is uitgebreid gekarakteriseerd in studies van dubbelstrengs breuken (DSB&#39;s) veroorzaakt door micro laser bestraling in levende cellen. De DDR aan helix vervormen DNA covalente modificaties, waaronder DNA crosslinks tussen de strengen (ICL) is niet goed gedefinieerd. We hebben de DDR gestimuleerd door ICL, gelokaliseerd met behulp van laser foto-activatie van immunotagged psoralenen bestudeerd, in de kernen van levende cellen. Om fundamentele vragen over adductverdeling en replicatie vork ontmoetingen pakken, combineerden we laser lokalisatie met twee andere technologieën. DNA vezels worden vaak gebruikt om de voortgang van replicatievorken door immunofluorescentie of nucleosideanalogen ingebracht gedurende korte pulsen geven. Immunoquantum stippen zijn op grote schaal gebruikt voor single molecule imaging. In de nieuwe benadering worden DNA vezels uit cellen die laser gelokaliseerd ICLs uitgespreid op microscoopglaasjes. De getagde ICLs worden weergegeven met immunoquantum stippen en the inter-laesie afstanden bepaald. Replicatievorksnelheid botsingen met ICLs kunnen worden gevisualiseerd en verschillende patronen ontmoeting geïdentificeerd en gekwantificeerd.

Laser gelokaliseerde Dig-TMP (Figuur 1A) ICLs kan worden weergegeven door immunofluorescentie tegen Dig-tag gekoppeld aan het psoraleen. Hoewel de laser kan worden gericht te slaan in een gebied van elke contour strepen niet &quot;natuurlijke&quot; vormen in cellen en legitieme signalen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van artefacten als gevolg van niet-specifieke binding door primaire of secundaire antilichamen. Deze functie is handig bij het gebruik van antilich...

Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

Het algemene doel van deze procedure is om een single-molecule analyse uit te voeren van de distributie van laser-gelokaliseerde interstrand crosslinks in genomisch DNA, om zo de cellulaire respons op DNA-interstrand crosslinks te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van DNA-reparatie met betrekking tot de distributie van DNA-laesies die zijn geïntroduceerd door lasertechnologie, een veelgebruikt experimenteel instrument. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het directe beeldvorming mogelijk maakt van DNA-laesies die in genomisch DNA zijn geïntroduceerd door de laser-geactiveerde verbinding.Dit was voorheen niet mogelijk. De procedure zal worden gedemonstreerd door Julia Gichimu en Hima Gali uit ons laboratorium. Telkens wanneer de richtlaser wordt gebruikt, is het belangrijk om een spiegelglas-kalibratie uit te voeren om te verifiëren dat de laser de juiste XYZ-coördinaten raakt en om het gebied van het door de camera vastgelegde veld vast te stellen waar de laser kan worden ingesteld om te raken.Zoek op de slide een veld dat eerder is geëtst. Stel de belichtingstijd en het laservermogen in. Pas vervolgens de focus aan om naar een nabijgelegen, niet-doelveld op de spiegel-slide te gaan.Start de kalibratieprocedure. De software zal de laser activeren om de spiegelglasplaat te etsen langs horizontale en diagonale lijnen. Deze lijnen definiëren de grenzen van het veld waarin de laser een doelcel kan raken.Stel verschillende regio's van belang, of ROI's, in binnen het gezichtsveld en activeer de laser om te bevestigen dat deze op de geselecteerde gebieden richt en zo de juiste XYZ-coördinaten raakt. Er moet ook een biologische kalibratie worden uitgevoerd bij het opzetten van het laserdoelsysteem van de microscoop. De eerste stap is het bepalen van het minimale laservermogen dat nodig is om trimethylpsoralen, of TMP, foto-activeren, interstrand crosslinks induceren en de rekrutering van een GFP-gelabelde herstelfactor teweegbrengen, waarvan de kinetiek vooraf kan worden gekarakteriseerd.In dit laboratorium wordt een U2OS-cellijn gebruikt die stabiel is transfecteerd met een plasmide dat GFP fan one tot expressie brengt. Zoals hier wordt getoond: wanneer cellen gedurende 10 minuten worden blootgesteld aan zes micromolair TMP en 1,2% laser, bevestigt het bekijken van de reeks beelden als video de rekrutering van GFP fan one naar de doel-ROI. De tweede stap is om te verifiëren dat deze vermogensinstelling geen rekrutering veroorzaakt in afwezigheid van de verbinding.Zoals hier wordt getoond, wanneer cellen gedurende 10 minuten uitsluitend worden blootgesteld aan de 1,2% laser en het beeld als video wordt bekeken, is er geen rekrutering van GFP fan one naar de doel-ROI. Ten derde is het belangrijk om de minimale vermogensinstelling te bepalen die in staat is om een cel te laten exploderen. Het vermogen om een cel bij deze vermogensinstelling te laten exploderen, dient elke dag dat de doellaser wordt gebruikt, als routinematige biologische kalibratie te worden getest.Stel de ROI in binnen de kern, terwijl u de nucleoli vermijdt. Pas de focus aan. Stel het laservermogen in op 12% en activeer de laser.Ten slotte is het essentieel om het brandvlak in het midden van de cel in te stellen om een correcte targeting te bereiken. Om dit aan te tonen worden drie cellen getarget op drie verschillende brandvlakken. Midden van de cel.Te hoog. En te laag. Drie minuten na het targeten wordt een stack van beelden over drie microns gegenereerd om de distributie van de GFP fan one stripe door het gefocuste beeldvlak te onderzoeken.Alleen de cel die in het midden van de celgroep is gericht, vertoont één GFP-waaierstreep in alle Z-vlakken. Bereid vóór het uitvoeren van de laserlokalisatie glazen kweekschalen van 35 millimeter met een glazen bodem voor om de cellen in te laten groeien. Maak met een markeerstift een verticale markering op de zijkant van elke schaal.Gebruik een diamantpen om een kruis in het midden van het glas op het kweekoppervlak te krassen, zodanig dat de zwarte streep aan de zijkant van de schaal zich bovenaan één arm van het kruis bevindt. Het kruis wordt op het groeioppervlak van het glas gemarkeerd, zodat het kruis en de cellen zich in hetzelfde brandvlak bevinden. Zaai de cellen uit in de gesteriliseerde, met een kruis gemarkeerde kweekschalen en incubeer gedurende 24 uur in één micromolaire five chloro deoxyuridine om het DNA uniform te labelen.Voeg op de dag van het experiment digoxigenine-gekoppeld TMP of dig TMP in 50% ethanol toe aan het celkweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 20 µM. Breng het medium naar 37 °C. Vervang het medium in de kweekschalen door medium dat dig TMP bevat en incubeer 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 om het dig TMP te laten equilibreren.Terwijl de cellen incuberen, voert u de kalibratie van de spiegelschuif uit en een blow-out van 12% van een cel, zoals eerder gedemonstreerd. Plaats de plaat in de omgevingskamer op 37 °C met gecontroleerde CO2 en vochtigheid op de objecttafel van de microscoop. Focus met het 60X olie-objectief op het snijpunt van het kruis.Selecteer het eerste veld dat u wilt targeten en gebruik de vormtool om de ROI's in individuele cellen in de directe nabijheid van de kruising van het kruis in te stellen. Selecteer nucleoplasmatische gebieden buiten de nucleoli. Pas het Z-brandvlak aan om de laser in het midden van de kernen te richten.Stel vervolgens de vermogensinstelling in op het minimum dat vereist is om de psoralenen in de DNA-schade-respons die door interstrand-crosslinks wordt geïnduceerd te activeren. Hier wordt 1,2% gebruikt. Activeer de laser.Nadat alle cellen in een gezichtsveld zijn aangestuurd, verplaatst u de plaat naar een nieuw veld, waarbij u dicht bij het kruispunt van het kruis blijft. Herhaal de zojuist gedemonstreerde procedure in 12 tot 18 velden om in totaal 80 tot 100 cellen aan te sturen. Verwijder de kweekschaal van de objecttafel om de cellen te oogsten.Verwijder het medium en was de cellen met een PBS-oplossing. Verwijder de PBS en breng een druppel van 10 µL van een commerciële trypsine-EDTA-oplossing aan op het kruispunt van het kruis in het midden van het glasoppervlak. Incubeer drie tot vier minuten bij kamertemperatuur en zuig vervolgens de trypsine-oplossing met de losgekomen cellen op in een pipetpunt.Plaats de druppel trypsine EDTA met de cellen aan één uiteinde van een gesilaniseerde glazen objectglas. Om de cellen te lyseren en het DNA vrij te maken, voegt u 10 µL 5% SDS-oplossing toe en incubeert u dit drie tot vier minuten bij kamertemperatuur, waarbij u voorzichtig mengt met de pipetpunt en de rand van de vloeistof laat opdrogen. Kantel het objectglas 20 graden en laat de vloeistof naar het uiteinde lopen.De hydrodynamische krachten van de stromende vloeistof zullen de DNA-vezels uitrekken en strekken. Laat het objectglas 10 minuten aan de lucht drogen. Dompel het objectglas onder in een oplossing van methanol en azijnzuur in een verhouding van drie op één en fixeer gedurende 10 minuten.Verwijder vervolgens het objectglas uit de fixeeroplossing en laat het opnieuw aan de lucht drogen. Op dit punt kan het objectglas onbeperkt worden bewaard in 70% ethanol bij 20 °C. Om het objectglas te prepareren voor de detectie van dig-signalen op DNA-vezels via fluorescentiemicroscopie, wordt het objectglas met het uitgerekte DNA uit de 70% ethanol-oplossing gehaald en aan de lucht gedroogd.Denatureer vervolgens de DNA-vezels in zoutzuur en breng ze daarna over naar een houder met tris-hydrochloride bij pH 8 voor neutralisatie. Was daarna de monsters in PBS. Kleur ze tot slot met de passende antilichamen volgens een eerder gepubliceerde procedure.De structuur van trimethylpsoralen met een dioxigenin-tag wordt getoond. Interstrand DNA-crosslinks, of ICL's, kunnen worden weergegeven door immunofluorescentie tegen dig TMP. Dit voorbeeld toont cellen met een accumulatie van gamma H2AX, een bekende marker voor de DNA-schaderespons, gevisualiseerd in groen, in ROI's die lasergelokaliseerde ICL's bevatten, gevisualiseerd in rood.De met DAPI gekleurde nucleus is blauw. Het bright-field beeld toont een cel die gedeeltelijk op de markering van de diamantpen ligt. Let erop dat de ROI's buiten de nucleoli zijn geplaatst.Om de frequentie en spatiëring van adducten te bepalen, werden cellen gedurende 24 uur geïncubeerd in vijf-chloordeoxyuridine voorafgaand aan de introductie van de ICL's. Na het oogsten van de cellen en het uitspreiden van de DNA-vezels werden de dig-signalen gedetecteerd met een amino-quantumdot, gevisualiseerd in rood, en het vijf-chloordeoxyuridine via amino-fluorescentie, gevisualiseerd in groen. Analyse van de dig-signalen op de vezels onthult dat de inter-ICL-afstanden variëren van minder dan 10 KB tot meer dan 160 KB. Er was geen bewijs voor geclusterde adducten.Door deze richtlijnen te volgen zou het mogelijk moeten zijn om deze aanpak uit te breiden naar andere DNA-adducten, zoals oxidatieve laesies die kunnen worden gelokaliseerd met lasers van de juiste golflengte.

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

This video demonstrates localized surface plasmon resonance imaging to detect protein secretions from a single cell. Using a microfluidic setup and a peptide-bound plasmonic nanostructure chip, changes in reflected light intensity at the resonance angle reveal interactions with secreted proteins from a single cell.

Localized Surface Plasmon Resonance Imaging to Detect Protein Secretions from a Single Cell

We rapporteren op een werkwijze in situ verandering van HF behandelde Si (001) oppervlak in een hydrofiel of hydrofoob toestand door bestralen monsters microfluïdische kamers gevuld met H 2 O 2 / H2O-oplossing (0,01% -0,5%) en methanol oplossingen met behulp van UV-gepulste laser van een relatief lage hartslag Fluence.

Selectieve Area Wijziging van Silicon Surface Bevochtigbaarheid door Pulsed UV Laser bestraling in Liquid Milieu

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) en 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

Dit protocol presenteert een methode om inline radicale dosimetrie en een plasma lichtbron te gebruiken om flash oxidatie eiwit footprinting uit te voeren. Deze methode vervangt de gevaarlijke UV-laser om de reproduceerbaarheid van snelle fotochemische oxidatie van eiwitstudies te vereenvoudigen en te verbeteren.

Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren

Dit protocol beschrijft een niet-invasieve methode om S-fase cellen efficiënt te identificeren voor downstream microscopiestudies, zoals het meten van DNA-reparatie eiwitrekrutering door lasermicrobestraling.

Laser micro-bestraling om DNA-rekrutering tijdens de S-fase te bestuderen

Hier wordt een robuust protocol gepresenteerd voor het isoleren van neuromelaninekorrels uit menselijk post-mortem substantia nigra pars compacta weefsel via lasermicrodissectie. Dit herziene en geoptimaliseerde protocol minimaliseert massaal de vereiste tijd voor monsterverzameling, vermindert de vereiste monsterhoeveelheid en verbetert de identificatie en kwantificering van eiwitten door LC-MS / MS-analyse.

Laser Microdissection-Based Protocol voor de LC-MS/MS analyse van het proteomische profiel van Neuromelanine Granules

Leer een enkelmolecuul-analyse van laser-gelokaliseerde interstrengkruisverbindingen in genomisch DNA om cellulaire reacties op DNA-schade te bestuderen. Deze methode maakt directe beeldvorming van DNA-letsels mogelijk.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

Meer video's verkennen