Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

NARRATOR Het algemene doel van deze methode is om efficiënt grote hoeveelheden robuuste cellsferoïden te genereren via celaggregatie voor gebruik in diverse celgebaseerde assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van een niet-eiwitachtige, wateroplosbare matrix voor celaggregatie en sferoïdvorming, wat een eenvoudige en snelle isolatie van de sferoïden mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het verkrijgen van nieuwe inzichten in de celbiologie over de effecten van cel-cel- en cel/matrix-interacties op weefselgroei in een driedimensionale micro-omgeving.

VERTELCADEAU Verwarm, voordat de aggregaten worden geprepareerd, 50 milliliter ultrapuur water tot 80 graden Celsius en voeg 10 gram methylcellulosepoeder toe. Agiteer de suspensie totdat de deeltjes gelijkmatig zijn verspreid. Voeg vervolgens koud ultrapuur water toe tot een eindvolume van 100 milliliter en bewaar de deeltjes een nacht bij 4 graden Celsius totdat de oplossing helder en strogeel wordt en geen zichtbare vaste stoffen meer bevat.

Filter de oplossing door een 0,45 micrometer filter om eventuele onopgeloste fragmenten te verwijderen, en verdun de gefilterde oplossing tot 1:5 milligram per milliliter in het geschikte kweekmedium. Filter vervolgens het met methylcellulose aangevulde medium door een 0,22 micrometer zeef. Was daarna, in een veiligheidskabinet, een 70% confluente subcultuur met PBS en behandel de cellen met drie milliliter Trypsin-EDTA associatiebuffer in een celkweekincubator.

Inspecteer na enkele minuten de cellen onder een lichtmicroscoop bij een 10x vergroting. Wanneer de cellen van de plaat zijn losgekomen, wordt de reactie geneutraliseerd met zeven milliliter serumgesupplementeerd kweekmedium. Breng de celoplossing over naar een nieuwe 15 milliliter buis en verzamel vervolgens de vrijgekomen cellen door middel van centrifugatie.

De meest voorkomende oorzaak van een mislukte sferoïdevorming, afgezien van verontreinigende deeltjes, is het gebruik van suboptimale concentraties methylcellulose of serum voor de aggregatie en groei van uw specifieke cellijn. VERTELSTEM-Tritureer het pellet drie tot vijf keer met één milliliter van het medium voor sferoïdevorming met een P1000-micropipet met filtertip, waarbij u de pipetpunt onder een kleine hoek tegen de bodem van de buis drukt, terwijl u langzaam pipetteert zonder de volledige inhoud van de tip uit te stoten om het pellet te sheareren. Verdun na het tellen de celсусpensie tot een concentratie van 1 × 10⁴ cellen per milliliter, en spoel een steriel reservoir voor een meerkanaalspipet met gefilterd ultrapuur water om eventueel stof en vezels te verwijderen.

Dispenseer de cellen in het reservoir en gebruik filtertips om 100 µL van de cellen over te brengen naar elke put van een 96-wells U-bodem celafstotende plaat, waarbij de celsuspensie periodiek wordt gemengd om te voorkomen dat de cellen naar de bodem van het reservoir zinken. Wanneer alle cellen zijn geplaatst, wordt de plaat in een weefselkweekincubator geplaatst en worden de putten dagelijks gecontroleerd op sferoïdevorming. De cellen zouden binnen zes uur naar de bodem van elke put moeten zakken en aggregeren doorgaans binnen 24 tot 48 uur tot een sferoïde.

Om de vorming van een succesvolle sferoïde te bevestigen, gebruikt u een P10-tip onder een lichtmicroscoop om voorzichtig medium over de sferoïde te pipetteren. Correct gevormde sferoïden zullen loskomen van de plaat en rollen, wat hun 3-D-structuur bevestigt. Om de sferoïden in collageen in te bedden, gebruikt u reverse pipetteren om de bodem van elke put van een tissue culture chamber slide met acht putten gelijkmatig te coaten met minimaal 50 µL geneutraliseerd collageen per put.

Wanneer alle putjes zijn bedekt, wordt de chamber slide in een 35 millimeter weefselkweekschaal gevuld met ultrapuur water in een 10 centimeter weefselkweekschaal geplaatst en wordt deze 10 centimeter weefselkweekschaal ongeveer een uur geïncubeerd bij 37 °C. Zodra het collageen is gepolymeriseerd, wordt een P1000 filtertip gebruikt om de vooraf gevormde sferoïden voorzichtig over te brengen naar 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Het is cruciaal dat de collageenbasislaag wordt geïncubeerd tot deze volledig is gepolymeriseerd om te voorkomen dat het collageen wordt verstoord bij het toevoegen van de sferoïden of het medium.

Narrator Verzamel de geoogste sferoïden in een tafelmodel microcentrifuge en gebruik een P200-pipet om de supernatanten te verwijderen; indien nodig kan overtollige supernatant worden weggesuizeerd door de buis om te keren op een schoon vel keukenpapier. Gebruik onmiddellijk een P200-pipetpunt met een wijde opening om de sferoïden te resuspenderen in 50 µL geneutraliseerd collageen en breng de mengsels van sferoïden en collageen zorgvuldig over naar elke put van de tissue culture chamber slide met acht putten. Plaats de slide terug in de incubator tot het collageen gepolymeriseerd is.

Voeg na ongeveer een uur langzaam ten minste 100 µL opgewarmd kweekmedium toe aan elke put, met daarin de gewenste behandeling voor een verdere incubatie. Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop om optische beeldsecties van de binnendringende sferoïden vast te leggen. Met dit protocol kunnen sferoïden worden gegenereerd uit een verscheidenheid aan cellijnen.

Onder de juiste behandelingen met methylcellulose en serum bezinken de individuele cellen en hechten ze in het centrum van de put aan elkaar om sferoïden te vormen met een minimale hechting aan de bodem van de put. Sommige cellijnen zijn in staat om aan celafstotende platen te hechten bij afwezigheid of lage concentraties methylcellulose, wat resulteert in de vorming van een sferoïde omringd door een cellaag. Over het algemeen voorkomen hogere concentraties methylcellulose dat de cellen aan de put hechten.

Maar een te hoge concentratie methylcellulose vermindert de cel-celadhesie en voorkomt dat de cellen naar de bodem van de put zakken, wat resulteert in de vorming van losse aggregaten en talrijke satelliet-sferoïden. In collageen ingebedde sferoïden kunnen worden behandeld met een chemoattractant om de invasie van individuele cellen vanuit de sferoïde naar de omringende matrix te induceren. Gefixeerde, in collageen ingebedde sferoïden kunnen worden afgebeeld met lichtveldmicroscopie om de afstand en het aantal invaderende cellen te kwantificeren, of met immunofluorescentiemicroscopie om de invasieve structuren te visualiseren die door de migrerende cellen zijn gevormd.

Het is belangrijk om voldoende tijd te geven aan de cellen om te aggregeren tot structureel stabiele sferoïden die robuust genoeg zijn voor manipulatie zonder te fragmenteren, en die gemakkelijk kunnen worden verzameld voor gebruik in daaropvolgende assays. Ons protocol voor celgroei kan verder worden aangepast voor meerdere celbiologische assays. Bijvoorbeeld, het plaatsen van cellen in media aangevuld met hoge concentraties methylcellulose kan worden gebruikt om de celanoïsche resistentie te beoordelen.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u driedimensionale celsferoïden door aggregatie kunt genereren, wat een waardevol hulpmiddel zal zijn voor veel toepassingen in de celbiologie.