Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

NARRATOR Het algemene doel van deze methode is om efficiënt grote hoeveelheden robuuste celsferoïden te genereren door celaggregatie voor hun gebruik in een verscheidenheid aan op cellen gebaseerde analyses. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een niet-eiwitrijk, wateroplosbaar matrix gebruikt voor celaggregatie en sferoïdvorming, wat een eenvoudige en snelle isolatie van de sferoïd mogelijk maakt. Deze methode kan helpen om nieuwe inzichten in de celbiologie te verkrijgen over de effecten van cel-cel en cel/matrix-interacties op weefselgroei in een driedimensionale micro-omgeving.

NARRATOR Voordat je de aggregaten bereidt, verwarm 50 milliliter ultrapuur water tot 80 graden Celsius en voeg 10 gram methylcellulosepoeder toe. Roer de suspensie tot de deeltjes gelijkmatig verdeeld zijn. Voeg dan koud ultrapuur water toe tot een eindvolume van 100 milliliter en bewaar de deeltjes een nacht bij 4 graden Celsius tot de oplossing helder en strokleurig wordt zonder zichtbare vaste stoffen.

Laat de oplossing door een 0,45 micrometer filter lopen om eventuele onopgeloste fragmenten te verwijderen en verdun 1:5 milligram per milliliter van de gefilterde oplossing in het juiste kweekmedium. Filter vervolgens het met methylcellulose aangevulde medium door een 0,22 micrometer zeef. Was vervolgens in een bioveiligheidscabinet een 70% confluente subcultuur met PBS en bevestig de cellen met drie milliliter Trypsin-EDTA associatiebuffer in een celkweekincubator.

Na een paar minuten inspecteer de cellen onder een lichtmicroscoop met een 10x vergroting. Wanneer de cellen van de plaat zijn opgetild, neutraliseer de reactie met zeven milliliter serum aangevuld kweekmedium. Breng de celsuspensie over naar een verse 15 milliliter buis en verzamel vervolgens de bevrijde cellen door centrifugatie.

De meest voorkomende oorzaak van een onsuccesvolle sferoïdvorming, afgezien van verontreinigende deeltjes, is het gebruik van suboptimale concentraties methylcellulose of serum voor de aggregatie en groei van uw specifieke cellijn. NARRATOR-Gebruik een P1000 micropipet met een filtertip om de pallet drie tot vijf keer met een milliliter van het sferoïdvormingsmedium te tritureren, terwijl je de pipettip tegen de bodem van de buis drukt op een lichte hoek, terwijl je langzaam pipetteert zonder de hele tipinhoud te verdrijven om de pellet te schuiven. Na het tellen, verdun de celsuspensie tot een eenmaal 10 tot de vierde cellen per milliliter concentratie en spoel een steriele multikanaals pipettenreservoir met gefilterd ultrapuur water om eventueel stof en vezels te verwijderen.

Dosering de cellen in het reservoir en gebruik filtertips om 100 microliters van de cellen over te brengen in elk putje van een 96-putjes U-bodem celrepelent plaat, terwijl je de celsuspensie periodiek mengt om te voorkomen dat de cellen naar de bodem van het reservoir zinken. Wanneer alle cellen zijn geplaatst, plaats de plaat in een weefselkweekincubator en inspecteer de putjes dagelijks op sferoïdvorming. De cellen zouden zich binnen zes uur aan de bodem van elk putje moeten nestelen en zich over het algemeen binnen 24 tot 48 uur tot een sferoïd bundelen.

Om de vorming van een succesvolle sferoïd te bevestigen, gebruik een P10 tip onder een lichtmicroscoop om voorzichtig medium over de sferoïd te pipetteren. Goed gevormde sferoïd zullen loskomen van de plaat en rollen, wat hun 3D-structuur bevestigt. Om de sferoïd in collageen te bedden, gebruik omgekeerde pipettering om de bodem van elk putje van een acht-putjes weefselkweekkamerplaat gelijkmatig te bedekken met minimaal 50 microliter geneutraliseerd collageen per putje.

Wanneer alle putjes bedekt zijn, plaats de kamerplaat in een 35 millimeter weefselkweekschaal gevuld met ultrapuur water in een 10 centimeter weefselkweekschaal en incubeer de 10 centimeter weefselkweekschaal bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer een uur. Wanneer het collageen is gepolymeriseerd, gebruik een P1000 filtertip om de vooraf gevormde sferoïd voorzichtig over te brengen in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Het is van cruciaal belang dat de collageenbasislagen worden geïncubeerd totdat ze volledig zijn gepolymeriseerd om te voorkomen dat het collageen wordt verstoord bij het toevoegen van de sferoïd of het medium.

Narrator Verzamel de geoogste sferoïd in een tafelcentrifuge en gebruik een P200 pipet om de supernatanten te verwijderen, waarbij je eventueel overtollig supernatant wegveegt door de buis op een schone papieren handdoek te keren zoals nodig. Gebruik direct een P200 pipettip met een brede boring om de sferoïd in 50 microliter geneutraliseerd collageen te resuspenderen en breng vervolgens de sferoïd-collageenmengsels voorzichtig over in elk putje van de acht-putjes weefselkweekkamerplaat. Plaats de plaat terug in de incubator totdat het collageen is gepolymeriseerd.

Na ongeveer een uur voeg langzaam ten minste 100 microliters verwarmd kweekmedium met de juiste behandeling van belang toe aan elk putje voor een verdere incubatie. Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop om optische beeldsneden te verkrijgen door de binnendringende sferoïd. Met dit protocol kunnen sferoïd worden gegenereerd vanuit een verscheidenheid aan cellijnen.

Onder de juiste methylcellulose en serum behandelingsomstandigheden nestelen de individuele cellen zich samen en hechten ze zich aan het centrum van de put om sferoïd te vormen met een minimale hechting aan de bodem van de put. Sommige cellijnen kunnen zich hechten aan celrepelente platen in afwezigheid of bij lage concentraties van methylcellulose, wat resulteert in de vorming van een sferoïd omgeven door een celmonolaag. Over het algemeen voorkomen hogere concentraties methylcellulose dat de cellen zich aan de put hechten.

Maar een te hoge concentratie methylcellulose vermindert de cel-cel adhesie en voorkomt dat de cellen zich aan de bodem van de put nestelen, wat resulteert in de vorming van losse aggregaten en talrijke satellietsferoïd. In collageen beddende sferoïd kunnen worden behandeld met een chemoattractant om de invasie van individuele cellen naar buiten van de sferoïd in de omringende matrix te induceren. Vaste collageen beddende sferoïd kunnen worden geïmagerd door helderveldmicroscopie om de afstand en het aantal binnendringende cellen te kwantific