Name: Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer een efficiënte methode voor 3D-sferoïdevorming door celaggregatie met methylcellulose. Dit protocol maakt snelle isolatie mogelijk voor migratie-, invasie- en cel-matrix-interactieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken M. Gordon van het Queen's University Biomedical Imaging Centre voor hun hulp. Dit werk werd ondersteund door operationele subsidies van de Cancer Research Society of Canada (19439) en de Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), en door Ontario Graduate Scholarships en beurzen van het Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinaire Kankeronderzoek (SMM, EYL), en door een Craig Jury Summer Studentship (SMM).

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li>
<li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4(2007).</li>
<li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781627036399">Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology</a>. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).</li>
<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We presenteren een snelle en flexibele werkwijze voor het vervaardigen van 3D cel sferoïden de architectuur van weefsels in vivo met behulp van goedkope en algemeen verkrijgbare reagentia modelleren. Ons protocol maakt gebruik van de niet-cytotoxische en adhesie-bevorderende eigenschappen van MC 8, 9 naar cel aggregatie bemiddelen en cel monolaag de vorming van een minimum te beperken. Unlike eiwit gebaseerde matrices geïsoleerd uit dierlijke bronnen, M...

Biologisch relevante beoordeling van het gedrag van tumorcellen is een uitdaging met behulp van traditionele tweedimensionale (2D) celcultuur methoden, deels omdat deze niet voldoende afgestemd op het cel micro-omgeving gevonden in vivo. Alternatieve benaderingen waarin extracellulaire matrixcomponenten in de cultuur (bijvoorbeeld Boyden kamer assays) zijn fysiologisch representatief voor de in vivo weefselomgeving. Echter kunnen deze worden beperkt tot beoordeling van individuele gedrag van cellen en kan het complex in vivo combinaties van cel-matrix en cel-cel interacties die bijdragen aan weefsel of tumorgroei 1, 2, 3 niet herhalen. Het gebruik van multicellulaire sferoïden is een recente aanpak die nauwkeuriger reproduceert de compacte architectuur van in vivo celgroei 1,4. Sferoïden kunnen worden gebruikt om cel-matrix interacties van normale cellen te onderzoeken, maar kan ook als tumor analogen kenmerken van tumorprogressie, zoals metastatische groei of geneesmiddelresistentie 4 modelleren. Sferoïden worden gevormd door de proliferatie van afzonderlijke cellen ingebed in een matrix 5, of sneller, door het bevorderen van de aggregatie van meerdere cellen aan een cluster cellen (bv opknoping druppel, centrifugatiewerkwijzen) 6, 7 vormen. Bestaande cel aggregatie technieken kunnen kostbare materialen of gespecialiseerde apparatuur nodig. Bovendien hebben deze bolletjes hebben een breed scala aan afmetingen en morfologieën en kan moeilijk te produceren in grote hoeveelheden, het vergelijken van kweekomstandigheden of behandelingen moeilijk. Tenslotte kunnen sferoïden die door deze werkwijzen moeilijk te isoleren uit het eiwitmateriaal extracellaire matrix waarin ze zijn ingebed voor gebruik in andere toepassingen. Hier beschrijven we een robuuste en gemakkelijk aanpasbaar celaggregatie methodologie voor de snelle vorming van gelijkvormige cellen sferoïden gebruikmaking van commercieel verkrijgbare U-bottom cell afstotend platen en een inert adhesiebevorderende matrix, methylcellulose. Eenmaal gevormd, worden deze multicellulaire sferoïden eenvoudig worden geïsoleerd voor gebruik in een breed scala van toepassingen. Het protocol is ook gemakkelijk aangepast sferoïden door middel van celproliferatie, die kunnen worden gebruikt om andere celprocessen beoordelen genereren. Hier tonen wij celinvasie assays gekwantificeerd door immunofluorescentie kleuring en een anoikis assay, zoals bijvoorbeeld toepassingen van deze twee sferoïde vorming protocollen.

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate buffered saline</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Gebaten voor PBS+ wasbuffer; PBS+ wasbuffer niet autoclaveren na toevoeging van calciumchloride</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Gebaten voor PBS+ wasbuffer; PBS+ wasbuffer niet autoclaveren na toevoeging van magnesiumchloride</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Voor sfeervorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bodem Cel-afstotende plaat</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle-medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>Voor het kweken van SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cellijnen</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>Voor het kweken van TT cellijn</td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filter voor gebruik om deeltjesverontreinigingen te verwijderen</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Bereid in water tot 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Voor het kweken van HCT-116, BxPC-3 cellijnen</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Dissociatiebuffer</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Voor invasie-assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runder type I collageen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3,1 mg/mL; Onder gebruik op ijs bewaren</td></tr><tr><td>DMEM Fenolroodvrij Lage Glucose&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Minder achtergrondfluorescentie vergeleken met fenolrood gesupplementeerd medium</td></tr><tr><td>Gliacelkalijn Afgeleide Neurotrofe Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemoattractant</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Voor immunofluorescentiemicroscopie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Dekglazen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>Voor het monteren van uitgesneden sferoïden</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Gebaten om actine te kleuren bij 1:200</td></tr><tr><td>Runder serumalbumine</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Gebaten in BSA blokkeerbuffer</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Gebaten in MOWIOL montagemedium</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH</td><td>-</td><td>Gebaten voor beeldanalyse&nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>Voor het monteren van uitgesneden sferoïden</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Gebaten in MOWIOL montagemedium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Gebaten in fixeerbuffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Gebaten in permeabilisatiebuffer</td></tr></tbody></table>

een efficiënt en flexibel cel aggregatie voor 3d sferoïde production

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolaag celcultuur niet adequaat model van de in vivo gedrag van weefsels, die complexe cel-cel en cel-matrix interacties omvat. Driedimensionale (3D) celkweektechnieken een recente innovatie ontwikkeld om de tekortkomingen van hechtende celkweek pakken. Hoewel verschillende technieken voor het genereren van weefsel analogen in vitro ontwikkeld, deze werkwijzen zijn vaak complex, duur om, vereisen gespecialiseerde apparatuur en meestal beperkt door verenigbaarheid met slechts bepaalde celtypen. We beschrijven hier een snelle en flexibele protocol voor het aggregeren cellen tot multicellulaire sferoïden 3D consistente grootte die compatibel is met een groei van verschillende tumor en normale cellijnen. Wij gebruiken variërende concentraties serum en methylcellulose (MC) om verankering-onafhankelijke sferoïde generatie bevorderen en op zeer reproduceerbare wijze de vorming van celmonolagen. Optimale omstandigheden voor individual cellijnen kunnen worden verwezenlijkt door de MC of serumconcentraties in het bolvormige formatie medium. De 3D sferoïden gegenereerd kan worden verzameld voor gebruik in een breed scala van toepassingen, waaronder cell signaling of gene expression studies, testgeneesmiddel screening, of de studie van cellulaire processen zoals tumorcel invasie en migratie. Het protocol wordt ook direct aangepast om klonale sferoïden van enkelvoudige cellen genereren, en kan worden aangepast om verankering-onafhankelijke groei en anoikis weerstand beoordelen. Overall, ons protocol bevat een gemakkelijk aanpasbaar werkwijze voor het genereren en gebruik 3D cellen sferoïden om de 3D micromilieu van weefsels recapituleren en het model van de in vivo groei van normale en tumorcellen.

We beschrijven een flexibele en efficiënte methode om discrete bolletjes met behulp van mobiele-afstotende platen en sferoïde vorming media waaraan MC genereren. Onder de geschikte omstandigheden MC en serum, individuele cellen regelen en klonteren in het midden van de put sferoïden met minimale hechting aan de putbodem vormen. Met dit protocol werden sferoïden gevormd uit verschillende cellijnen (figuur 2B). Titratie van MC serumconcentratie is vereist voor elke cellijn...

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

NARRATOR Het algemene doel van deze methode is om efficiënt grote hoeveelheden robuuste cellsferoïden te genereren via celaggregatie voor gebruik in diverse celgebaseerde assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van een niet-eiwitachtige, wateroplosbare matrix voor celaggregatie en sferoïdvorming, wat een eenvoudige en snelle isolatie van de sferoïden mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het verkrijgen van nieuwe inzichten in de celbiologie over de effecten van cel-cel- en cel/matrix-interacties op weefselgroei in een driedimensionale micro-omgeving.VERTELCADEAU Verwarm, voordat de aggregaten worden geprepareerd, 50 milliliter ultrapuur water tot 80 graden Celsius en voeg 10 gram methylcellulosepoeder toe. Agiteer de suspensie totdat de deeltjes gelijkmatig zijn verspreid. Voeg vervolgens koud ultrapuur water toe tot een eindvolume van 100 milliliter en bewaar de deeltjes een nacht bij 4 graden Celsius totdat de oplossing helder en strogeel wordt en geen zichtbare vaste stoffen meer bevat.Filter de oplossing door een 0,45 micrometer filter om eventuele onopgeloste fragmenten te verwijderen, en verdun de gefilterde oplossing tot 1:5 milligram per mi

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Spheroids are a type of 3D cell culture model used to more accurately represent a cell’s environment compared to 2D cell culture monolayer models. In the example protocol, we will see scientists generate spheroids from a colorectal cancer cell line and apply live-cell imaging to track the spheroids’ growth.

Spheroid Generation from Cell Lines: A Three-Dimensional (3D) Cell Culture Method

We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.

Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

Hier beschrijven we de grootschalige productie van van vetweefsel afgeleide stromale / stamcel (ASC) sferoïden met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem om de celsuspensie te zaaien, waardoor homogeniteit van sferoïde grootte en vorm wordt gegarandeerd. Deze ASC-sferoïden kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor 3D-bioprintingbenaderingen.

Grootschalige, geautomatiseerde productie van van vetweefsel afgeleide stamcelsferoïden voor 3D-bioprinting

Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.

Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.

Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Hier presenteren we een protocol dat snelle, robuuste en goedkope fabricage van tumorsferoïden mogelijk maakt, gevolgd door hydrogel-inkapseling. Het is breed toepasbaar omdat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is. Het zou met name nuttig zijn voor het onderzoeken van sferoïde-matrixinteracties en het bouwen van in vitro weefselfysiologische of pathologiemodellen.

Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

Celsferoïden worden beschouwd als een potentieel model op het gebied van biologische toepassingen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het schaalbaar genereren van celsferoïden met behulp van een 3D akoestisch assemblageapparaat, dat een efficiënte methode biedt voor de robuuste en snelle fabricage van uniforme celsferoïden.

Driedimensionaal akoestisch assemblageapparaat voor massaproductie van celsferoïden

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

Leer een efficiënte methode voor 3D-sferoïdevorming door celaggregatie met methylcellulose. Dit protocol maakt snelle isolatie mogelijk voor migratie-, invasie- en cel-matrix-interactieonderzoek.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Meer video's verkennen