Name: Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer efficiënte small RNA-transfectie in primaire humane Th17-cellen met next generation electroporatie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar T-celdifferentiatie en immuunfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de US National Institutes of Health (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), een Leukemia & Lymphoma Society wetenschapper award (K.M.A.), en het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Dit protocol houdt zich aan richtlijnen UCSF&#39;s voor de menselijke onderzoek ethiek. 1. Bereiding van T Celkweek, isolatie van CD4 + T-cellen en Th17 Polarisatie <ol><li> Op dag 0, laag 6-well weefselkweek platen met 1,5 ml per putje van anti-humaan CD3 (2 ug / ml) en anti-humaan CD28 (4 ug / ml) in PBS met calcium en magnesium ten minste 2 uur bij 37 ° C. <ol><li> Alternatief, laag de platen overnacht bij 4 ° C. Wikkel platen in parafilm. </li></ol></li><li> De kabel voorbereiden bloed mononucleaire cellen (CBMCs) door dichtheidsgradiënt centrifugatie instructies van de fabrikant. LET OP: Ga voorzichtig te werk en zorgen voor een goede persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) wordt gedragen bij het hanteren van menselijk bloed om elk risico van blootstelling aan door bloed overgedragen ziekteverwekkers te voorkomen. </li><li> Nadat de mononucleaire cellen zijn geïsoleerd en gewassen, het uitvoeren van de menselijke CD4 + T-cellen de isolatie door negatieve Selectie behulp van een commerciële menselijke CD4 + T-cel kit. LET OP: Als er rode bloedcellen besmetting na mononucleaire cel isolatie, kan een optionele lysis van rode bloedcellen voorafgaand aan de CD4 + T-cel isolatie stappen worden uitgevoerd. Resuspendeer de mononucleaire cellen in 1 ml isolatie buffer (2% FBS in PBS). Voeg 5 ml 1x lyserende oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 5 ml isolatiebuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. <ol><li> Resuspendeer de mononucleaire cellen bij een dichtheid van 50 x 10 6 per 500 pi bij de isolatie buffer in een nieuwe buis van 5 ml. </li><li> Voeg 100 ul van FBS en 100 pi van het antilichaam mix per buis vervolgens elke buis incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten op een schudapparaat goed te mengen. </li><li> Na de incubatie, voeg 3-4 ml isolatie buffer om de cellen te wassen. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 8 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Zorgvuldig aspireren de supernatant. </li><li> Tijdens deze rotatie, pre-wassen van de magnetische bolletjes. Breng de gewenste hoeveelheid magnetische korrels in een nieuwe buis (gebruikt bij 1: 1 met de cellen) en voeg een gelijk volume isolatiebuffer de parels te wassen. Meng goed met een 1 ml micropipet en plaats vervolgens de slang in de magneet gedurende ten minste 1 min. zuig het supernatant voorzichtig. Resuspendeer de magnetische korrels in hetzelfde volume aanvankelijk voorafgaand overgedragen aan de was. </li><li> Resuspendeer de cellen in elke buis met 500 pl van de isolatiebuffer en voeg 500 ul van voorgewassen magnetische korrels. </li><li> Incubeer de cellen met de magnetische korrels gedurende 15 minuten op een rondschudapparaat bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) goed te mengen. </li><li> Na de incubatie grondig pipet de cellen met een 1 ml micropipet ten minste 10 maal. voeg 3-4 ml isolatiebuffer en zet elke buis in de magneet gedurende 2 minuten. </li><li> Zorgvuldig overdracht van de negatief geselecteerde CD4 + T-cellen die zijn inhet supernatant naar een nieuwe buis. </li></ol></li><li> Zodra CD4 + T-cel isolatie is voltooid, tel de cellen met een hemocytometer en houden de cellen op ijs. </li><li> Was de met antilichaam beklede platen tweemaal met PBS. Voeg daarna 1,5 ml 2x mix van Th17-polariserende medium aan elk putje: anti-humaan IFN-y (20 gg / ml), anti-humaan IL-4 (20 ng / ml), humaan TGF- (10 ng / ml), humaan IL-1β (40 ng / ml), humaan IL-23 (40 ng / ml), humaan IL-6 (50 ng / mL) alle verdund in serumvrij basismedium (aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat en 100 pM 2-mercaptoethanol). OPMERKING: Transfectie en RNA interferentie werkt in serum-bevattende media. Het doel van het gebruik serumvrij medium met dit protocol is het beter IL-17A productie. </li><li> Centrifugeer de humane CD4 + -T-cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Zorgvuldig aspireren de supernatmier. Resuspendeer dan de cellen in serumvrij basismedium en de plaat van de cellen bij een dichtheid van 3 x 10 6 in 1,5 mL per putje zodat het uiteindelijke volume 3 ml per putje en polariserende cytokinen zijn nu op een 1 x eindconcentratie. <ol><li> Plaats de platen in 5% CO2, 37 ° C incubator gedurende twee dagen. </li></ol></li></ol> 2. Elektroporatie van in vitro gepolariseerde Menselijke cellen Th17 <ol><li> Op dag 2, laag 48-putjes weefselkweekplaten met 250 pl per putje van anti-humaan CD3 (2 ug / ml) en anti-humaan CD28 (4 ug / ml) in PBS met calcium en magnesium ten minste 2 uur bij 37 ° C. <ol><li> Alternatief, laag de platen overnacht bij 4 ° C. Wikkel platen in parafilm. </li></ol></li><li> Bereiden kleine RNAs voor transfectie. Voor elke transfectie aliquot 1 ui van een 5 pM voorraadoplossing van siRNA in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Omvatten geschikte chemie aangepaste kleine RNA control. Houd alle buizen op ijs. </li><li> Was de met antilichaam beklede platen tweemaal met PBS. Voeg vervolgens 500 pi 1X Th17-polariserende medium aan elk putje: anti-humaan IFN-y (10 ug / ml), anti-humaan IL-4 (10 ng / ml), humaan TGF (5 ng / ml), humaan IL 1β (20 ng / ml), humaan IL-23 (20 ng / ml), humaan IL-6 (25 ng / mL) alle verdund in serumvrij basismedium (aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat en 100 pM 2-mercaptoethanol). </li><li> Nadat de kweekplaten en transfectie reagentia bereid, resuspendeer de cellen met een 1 ml micropipet voorzichtig pipetteren maar zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de bodem van de putjes. de cellen zwembad in een conische buis en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. LET OP: Voor perioden cultuur langer dan de vier-daagse protocol hierin worden gepresenteerd, moeten de cellen worden ongeveer getransfecteerd om de 3 dagen met behulp van hetzelfde protocol. Stap 20,4 moet echter worden gewijzigd sinds het behandeld met verschillende kleine RNAs cellen niet worden samengevoegd. Alle omstandigheden getest moeten worden verzameld, geteld, en afzonderlijk getransfecteerd. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatans, en resuspendeer de cellen in ten minste 1 ml PBS te wassen. Tel de live-Th17 cellen (bijvoorbeeld met een hemocytometer met behulp van Trypan Blue uitsluiting van de levensvatbaarheid te beoordelen) en breng de cellen om een microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. </li><li> Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de cellen vervolgens met de meegeleverde hersuspensiebuffer van het transfectie 10 pi kit in een dichtheid van 2,5-4 x 10 7 cellen per ml. Houd cellen bij kamertemperatuur. LET OP: Als richtlijn, proberen om slechts zoveel cellen bereiden binnen 30 minuten kan worden getransfecteerd. Meerdere batches kunnen worden vergeleken. </li><li> Voeg 9 pl van cellen aan 1 pl kleine RNA in elke MicroCentrifuge buis. Pipet keer om de cellen en kleine RNAs voor transfectie mix vervolgens geladen in de pipet elektrodepunt. OPMERKING: Gewoonlijk voeg 9,5 pi celsuspensie te zorgen voor voldoende het mengsel te voorkomen waardoor de bellen in de pipet elektrodepunt voor transfectie. </li><li> Vul het voorzien cuvette met 3 ml kamertemperatuur elektrolytische Buffer E. Plaats de cuvet in de pipet station en plaats van de pipet in positie in de cuvette. </li><li> Onmiddellijk elektroporatie elke 10 pi mix van cellen en kleine RNA met de volgende parameters: 1,500-1,550 pulsspanning V, pulsbreedte 10 ms en 3 pulsen totaal de transfectie apparaat. </li><li> Na de elektroporatie is voltooid, direct het celmengsel voeg 500 ul 1X Th17-polariserende media in bereide putjes van een kweekplaat. Plaats platen in een 5% CO2, 37 ° C incubator gedurende twee dagen. OPMERKING: Was de pipet elektrode tip door pipetterenop en neer in PBS tussen elke transfectie. </li></ol> 3. Oogst Menselijke cellen Th17 <ol><li> Resuspendeer de cellen in de cultuur media met een micropipet, pipetteren voorzichtig maar ervoor te zorgen dat alle cellen worden losgemaakt van de bodem van de putten. Bereid de cellen voor functionele en / of genexpressie-assays. OPMERKING: Routinematig worden genoeg cellen verkregen van een enkel putje van getransfecteerde Th17 cellen, bestemd voor flowcytometrische analyse van oppervlaktemerker en intracellulaire cytokine kleuring en transcriptiefactor of voor de bereiding van RNA voor genexpressie analyse. </li></ol>

<ol><li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+immune+axis%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li>
<li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+origin+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li>
<li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+bioanal+chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%26gamma%3B+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li>
<li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li>
<li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Na%C3%AFve+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol verschaft een verbeterde werkwijze voor het afleveren van kleine RNA&#39;s in humane cellen Th17. Hoewel menselijke cellen Th17 hier gebruikt, kan deze werkwijze elektroporatie van kleine RNA&#39;s worden gebruikt met andere primaire menselijke T-helper-subsets, zoals Th1, Th2 en Tregs. Het is niet goed gewerkt voor naïeve CD4 + T-cellen, zodat de cellen moeten worden geactiveerd in cultuur voorafgaand aan transfectie. Voor dit protocol, we eerst geoptimaliseerd in vitro kweeksysteem bet...

CD4 + T-cellen zijn cruciaal orchestrators van de adaptieve immuunrespons. Naïeve CD4 + T-cellen kunnen ontwikkelen in verschillende effector T-cellen (bijv Th1, Th2, Th17, enz.), Elk met hun eigen set van karakteristieke cytokinen en transcriptiefactoren, afhankelijk van de plaatselijke micromilieu 1. Het geslacht besluiten dat T-cellen vormen cruciaal zijn voor beschermend immuniteit en tolerantie voor zichzelf. Th17 cellen zijn een subgroep van T-cellen bekend extracellulaire bacteriën en schimmels te bestrijden, maar hun verkeerde reacties zijn ook betrokken bij de pathogenese van multiple autoimmuun- en ontstekingsziekten zoals multiple sclerose en psoriasis 2, 3. Th17 humane cellen kunnen worden gegenereerd uit naïeve CD4 + T-cellen in vitro door hen met een geschikte polariserende omgeving 4. Vario<html> ons combinaties van de cytokines IL-1β, IL-23, TGF-P en IL-6 zijn gebruikt voor de ontwikkeling van de menselijke Th17 cellen. Menselijke Th17 cellen brengen CCR6, een chemokine receptor die gewoonlijk wordt gebruikt om deze celpopulatie en worden omschreven met hun belangrijkste transcriptiefactor RORγt (gecodeerd door RORC) 5, 6. Th17 cellen hebben de mogelijkheid om meerdere cytokinen tot expressie brengen, maar IL-17A is de lijn definiëren effector cytokine geproduceerd door deze cellen. Onderzochten we de expressie van alle drie Th17 geassocieerde markers (CCR6, RORγt, IL-17A) om de robuustheid van onze menselijke Th17 differentiatie in vitro assay te evalueren. Daarnaast hebben we gekweekte humane CD4 + -T-cellen onder niet-polariserende omstandigheden waarbij geen cytokinen of blokkerende antilichamen die aan het kweekmedium toegevoegd om als negatieve controle omdat expressie van deze markers Th17 laag of afwezig moeten zijn. ve_content &quot;&gt; Een manier om normale humane T-celontwikkeling en biologie studie is om genexpressie te manipuleren tijdens de ontwikkeling. Korte interfererende RNA (siRNA) zijn synthetische kleine RNA moleculen die eiwitcoderende mRNA targeten en kan worden toegepast om genexpressie te verlagen . MicroRNAs (miRNA&#39;s) zijn endogene niet-coderende kleine RNAs bekend genexpressie posttranscriptioneel. miRNAs bleken een belangrijke rol in zowel muizen- als humane T-cel biologie spelen, met inbegrip van Th17 cellen 7, 8, 9. de is essentieel voor betrouwbare werkwijzen voor het manipuleren van kleine RNA in humane T-cellen hun effecten op genexpressie en uiteindelijk menselijke T-celbiologie bestuderen. we beschrijven hier een eenvoudig te gebruiken, consistent en betrouwbaar protocol dat we hebben ontwikkeld voor het inbrengen kleine synthetische RNAs en afgesloten nucleïnezuren (LNA&#39;s, chemisch gemodificeerde nucleïnezuren met verhoogde stabiliteit)in immuuncellen, en in het bijzonder in de menselijke Th17 cellen. Er zijn verscheidene alternatieve werkwijzen voor het inbrengen kleine RNA&#39;s in zoogdiercellen, die in het algemeen in chemische, biologische of fysische categorieën 10 vallen. Gewoonlijk gebruikte chemische werkwijzen, waaronder op lipiden gebaseerde transfecties en calciumfosfaat transfectie, afhankelijk maken van chemisch-DNA-complexen die efficiënter door cellen genomen. Over het algemeen chemische werkwijzen niet zo efficiënt voor de transfectie van primaire T-cellen. De meest voorkomende biologische methode is om een virale vector (bijvoorbeeld retrovirus of lentivirus), dat direct ingevoegd vreemde RNA in een gastheer als onderdeel van zijn natuurlijke replicatiecyclus gebruiken. Virale transductie duurt kenmerkend langer in beslag, vooral wanneer men factoren in de tijd voor moleculaire klonering van provirale plasmiden. Daarnaast kunnen virale vectoren transductie potentieel schadelijk voor de onderzoekers. Elektroporatie is een fysiek methode induceren membraan permeabilisatie door het onderwerpen van cellen aan hoogspanningspulsen, waarbij nucleïnezuren transiënt voeren in de cel waar ze inwerken op hun doel. Traditionele elektroporatie instrumenten waren niet effectief voor het transfecteren primaire lymfocyten. Toch is geoptimaliseerd next generation elektroporatie bewezen in staat T-cellen te transfecteren met zeer hoge efficiëntie, in het bijzonder wanneer het materiaal te transfecteren klein RNA. De term generatie losjes gebruikt om de twee nieuwere platforms (bijvoorbeeld neon, Amaxa) door traditionele elektroporatie machines differentiëren. Bovendien is deze werkwijze gemakkelijk schaalbaar voor matige doorvoer screenings met tot ongeveer 120 kleine RNAs in een enkel experiment, vaak met gevalideerde synthetische reagentia. Belangrijker is dat succesvolle transfecties worden bereikt in slechts 16 uur na T-celactivering. Het nadeel van deze methode is echter dat zij niet tot stabiele genomische incorporatiop, en is daarom van voorbijgaande aard. Daarom is de extra inspanning een stabiel expressieconstruct dat kan worden verpakt in een virale vector en met succes tot expressie gebracht in T-cellen wanneer langdurige expressie van een kleine RNA nodig maken waard. We hebben een nieuwe generatie transfectie (bijvoorbeeld Neon) gebruikt om diverse synthetische enkel- of dubbelstrengs RNA of LNA oligonucleotide gereedschappen leveren voor verschillende doeleinden 11, 12, 13. Efficiënte RNA interferentie kan worden geïnduceerd in primaire muis en menselijke T-cellen met behulp van dubbelstrengs korte interfererende RNA (siRNA). Dit protocol beschrijft geoptimaliseerde omstandigheden voor het gebruik van deze techniek in humane cellen Th17. In aanvulling op siRNA, kunnen in de handel verkrijgbare synthetische miRNA bootst en remmers worden gebruikt om miRNA winst en verlies van functie te bestuderen. miRNA bootst dubbelstrengs RNA-moleculen, vergelijkbaar met siRNA, maar designed met de sequentie van endogeen mature miRNAs. miRNA-remmers worden chemisch gemodificeerde RNA en / of LNA gebaseerd enkelstrengs oligonucleotiden die binden aan natief miRNAs en hun functie antagoniseren. We hebben ontdekt dat elk van deze instrumenten effectief kan worden gebruikt in gekweekte primaire T-lymfocyten, met inbegrip van maar niet beperkt tot de menselijke Th17 cellen.

<table><tbody><tr><td>anti-human IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-human IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S.B3</td></tr><tr><td>anti-human CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-human RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-human CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Voor intracellulaire transcriptiefactor flow cytometry kleuring</td></tr><tr><td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>"Serum-Free Base Media"</td></tr><tr><td>MACS CD28 pure functional grade, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>anti-human CD3 Purified</td><td>UCSF monoclonal antibody core</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purified anti-human IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-human IFNg, functional grade purified</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-23</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-1&beta;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human TGF-&beta;1</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-6</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4+ T cell Isolation Kit</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Next generation electroporation instrument</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &mu;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Provided in kit (MPK1096)</td><td>"Transfection Resuspension Buffer"</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>costar 48-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Moet worden gemaakt 1x oplossing met gedistilleerd water voor gebruik</td></tr></tbody></table>

small rna transfectie in primaire humane th17 cellen door next generation electroporation

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T-cellen kunnen differentiëren in verschillende subsets van effectieve T-helpercellen, afhankelijk van de omringende cytokine-milieu. Th17-cellen kunnen worden gegenereerd uit naïeve CD4+ T-cellen in vitro door ze te activeren in aanwezigheid van de polariserende cytokinen IL-1β, IL-6, IL-23 en TGF-β. Th17-cellen orkestreren de immuniteit tegen extracellulaire bacteriën en schimmels, maar hun abnormale activiteit is ook geassocieerd met verschillende auto-immuun- en ontstekingsziekten. Th17-cellen worden geïdentificeerd door de chemokine-receptor CCR6 en gedefinieerd door hun belangrijkste transcriptiefactor, RORγt, en karakteristieke effectorcytokine, IL-17A. Geoptimaliseerde kweekcondities voor differentiatie van Th17-cellen vergemakkelijken mechanistische studies van humane T-celbiologie in een gecontroleerde omgeving. Ze bieden ook een setting voor het bestuderen van de belangrijkheid van specifieke genen en genexpressieprogramma's door middel van RNA-interferentie of de introductie van microRNA (miRNA)-mimics of -remmers. Dit protocol biedt een gemakkelijk te gebruiken, reproduceerbare en zeer efficiënte methode voor tijdelijke transfectie van differentiërende primaire humane Th17-cellen met kleine RNA's met behulp van een elektroporatie-apparaat van de volgende generatie.

De eerste stap om de ontwikkeling van een betrouwbaar systeem met succes elektroporatie humane Th17 cellen werd krachtig in vitro gedifferentieerde humane Th17 celculturen te genereren. T-cellen gekweekt onder Th17-polariserende uitgedrukte chemokine receptor CCR6 en de transcriptiefactor RORγt (Figuur 1A, links). Deze merkers werden niet tot expressie gebracht wanneer T-cellen werden gekweekt onder niet-polariserende (THN) omstandigheden (figuur 1A,</st...

Elektroporatie van de volgende generatie is een efficiënte methode om humane Th17-cellen te transfecteren met kleine RNA's om genexpressie en celgedrag te veranderen.

Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire menselijke T-cellen efficiënt te transfecteren met kleine RNA-reagentia middels electroporatie van de volgende generatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de T-celbiologie, zoals de wijze waarop specifieke genproducten de T-celdifferentiatie en immuunfunctie reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer efficiënte en betrouwbare methode is om primaire menselijke T-cellen te transfecteren met sRNA's en andere synthetische kleine RNA-reagentia.Deze methode kan inzicht verschaffen in de biologie van menselijke Th17-cellen, maar kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere lymfocyten van mensen of muizen. Coat op dag nul zeswell-weefselkweekplaten met 1,5 milliliters per well antihuman CD3 en antihuman CD28 in PBS met calcium en magnesium gedurende ten minste twee uur bij 37 °C. Zodra de mononucleaire cellen uit navelstrengbloed, of CBMC's, zijn geïsoleerd en gewassen, wordt de isolatie van CD4-positieve T-cellen uitgevoerd via negatieve selectie met behulp van een commerciële kit voor menselijke CD4-positieve T-cellen.Voeg isolatiebuffer toe en resuspendeer de mononucleaire cellen. Breng de cellen over naar een nieuwe buis van vijf milliliter, voeg vervolgens 100 µL foetaal runderserum, of FBS, en 100 µL van de antilichaammix per buis toe, en incubeer elke buis 20 minuten bij vier °C op een orbitale schudmixer om alles goed te mengen. Voeg na de incubatie drie tot vier milliliter isolatiebuffer toe om de cellen te wassen.Centrifugeer de cellen bij 300 ×g gedurende acht minuten bij vier °C om de cellen te pelletteren. Aspireer voorzichtig het supernatant. Breng de magnetische kralen over naar een nieuwe buis en voeg een gelijk volume isolatiebuffer toe om de kralen te wassen.Gebruik een micropipet van één milliliter om de beads goed te mengen en plaats de buis vervolgens gedurende ten minste één minuut in de magneet. Aspireer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de magnetische beads in hetzelfde volume dat oorspronkelijk vóór het wassen was overgeplaatst. Voeg 500 microliters isolatiebuffer toe aan elke buis en resuspendeer de cellen, voeg vervolgens 500 microliters vooraf gewassen magnetische beads toe.Incubeer de cellen gedurende 15 minuten met de magnetische kraaltjes op een orbitale schudder bij kamertemperatuur om deze goed te mengen. Pipetteer na de incubatie de cellen grondig ten minste 10 keer met een micropipet van één milliliter, voeg vervolgens drie tot vier milliliter isolatiebuffer toe en plaats elke buis gedurende twee minuten in de magneet. Draag de negatief geselecteerde CD4-positieve T-cellen in het supernatant voorzichtig over naar een nieuwe buis.Zodra de isolatie van CD4-positieve T-cellen is voltooid, moeten de cellen op ijs worden bewaard en met een hemocytometer worden geteld. Was de antilichaam-gecoate platen twee keer met PBS en voeg vervolgens 1,5 milliliters van een twee X mengsel van Th17-polarisatiemedium toe aan elke well. Centrifugeer daarna de humane CD4-positieve T-cellen om de cellen te pelletteren.Aspireer voorzichtig het supernatant en gooi dit weg, resuspendeer de cellen vervolgens in serumvrij basismedium en zaai de cellen uit zodat het eindvolume drie milliliters per well is en de polariserende cytokines nu een eindconcentratie van 1X hebben, en plaats de platen vervolgens gedurende twee dagen in een incubator met 5% carbon dioxide bij 37 degrees Celsius. Coat op dag twee 48-wells weefselkweekplaten met 250 microliters per well anti-humane CD3 en anti-humane CD28 in PBS met calcium en magnesium gedurende ten minste twee uur bij 37 degrees Celsius. Om kleine RNA's voor transfectie voor te bereiden, wordt één microliter van een 5 micromolar stockoplossing van siRNA in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis per transfectie gedoseerd.Houd alle buizen op ijs. Was vervolgens de met antilichamen gecoate platen twee keer met PBS en voeg daarna 500 µL van een 1X Th17-polarisatiemedium toe aan elke put. Nadat de kweekplaten en transfectiereagentia zijn voorbereid, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd met een micropipet van 1 mL; pipetteer voorzichtig, maar zorg ervoor dat alle cellen loskomen van de bodem van de putten.Breng de cellen samen in een conische buis en centrifugeer de buizen 5 minuten bij 500 ×g bij vier graden Celsius. Aspireer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen vervolgens in minimaal één milliliter PBS om ze te wassen. Tel de levende Th17-cellen met een hemocytometer, waarbij trypanblauw-exclusie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid te beoordelen, en pelletiseer de cellen vervolgens in een microcentrifugebuis.Zuig het supernatant voorzichtig af en resuspendeer de cellen met de meegeleverde resuspensiebuffer uit de kit. Houd de cellen op kamertemperatuur. Voeg negen µL cellen toe aan één µL klein RNA in elke microcentrifugebuis.Pipetteer één keer om de cellen en kleine RNA's voor transfectie te mengen en breng de cellen vervolgens over in de meegeleverde pipetelektrodepunt. Om een optimale transfectie te garanderen, dient men luchtbellen in de pipetelektrodepunt vóór de transfectie te vermijden. We voegen 9,5 µL cel-suspensie toe om ervoor te zorgen dat er voldoende mengsel is om de vorming van bellen in de elektroporatiepipet te voorkomen.Vul de meegeleverde cuvette met drie milliliters elektrolytische buffer op kamertemperatuur. Plaats de cuvette in het neon pipetstation en breng vervolgens de pipet in positie in de cuvette. Elektroporeer onmiddellijk elk mengsel van 10 microliter cellen en klein RNA.Nadat de electroporatie is voltooid, voegt u het cellenmengsel direct toe aan 500 µL van één X Th17-polarisatiemedium in voorbereide putjes van een kweekplaat. Plaats de platen vervolgens gedurende nog twee dagen in een incubator bij 5% CO2 en 37 °C. Werk zorgvuldig maar snel om celsterfte te voorkomen.Als er veel monsters geëlectroporeerd moeten worden, kunnen de cellen in batches worden verzameld en getransfecteerd. Deze contourplot laat zien dat T-cellen, gekweekt onder Th17-polariserende condities, de chemokinereceptor CCR6 en de transcriptiefactor ROR gamma T tot expressie brachten, terwijl deze niet tot expressie kwamen wanneer T-cellen onder niet-polariserende condities werden gekweekt. T-cellen die onder Th17-polariserende condities werden gekweekt, produceerden bij restimulatie ook IL-17A, maar dit gebeurde niet onder ThN-condities.Th17-differentiatie vindt nog steeds plaats na transfectie met kleine RNA's, maar in sommige experimenten wordt een afname van de frequentie van IL-17A-productie waargenomen. Dit demonstreert het belang van een chemisch overeenkomstige kleine RNA-controle voor vergelijking binnen elk experiment. De levensvatbaarheid blijft behouden na transfectie met kleine RNA's en is doorgaans groter dan 70%. Transfectie van humane Th17-cellen op dag twee met een siRNA-pool gericht op het gen PTPRC, dat CD45 codeert, verminderde de expressie van CD45 sterk in vergelijking met een chemisch overeenkomstige controle-siRNA.De unimodale populatieverschuiving in CD45-expressie, hier te zien, wijst op een transfectie-efficiëntie van bijna 100%. Het verminderen van de expressie van ROR gamma T door RNAi had een functioneel effect, aangezien deze cellen een verminderde IL-17A-productie vertoonden in vergelijking met cellen die waren getransfecteerd met een controle-siRNA. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe in vitro gepolariseerde menselijke Th17-cellen kunnen worden getransfecteerd met kleine RNA's met behulp van next generation elektroporatie.

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

We presenteren onze geoptimaliseerde high-throughput nucleofection protocol als een efficiënte manier transfecteren primaire menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen met een plasmide DNA of siRNA, zonder dat cel rijping. We verder bewijs leveren voor een succesvolle siRNA zwijgen van gerichte gen RIG-I zowel op mRNA-en eiwitniveau.

Geoptimaliseerd protocol voor Efficiënte Transfectie van dendritische cellen zonder Cell Rijping

Dit protocol geeft een efficiënte en betrouwbare methode voor de menselijke THP-1 macrofagen met siRNA of plasmide-DNA te transfecteren door elektroporatie met hoge transfectie efficiëntie met behoud van hoge cel vitaliteit en volledige capaciteit macrofaag differentiatie en polarisatie.

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

We presenteren een methode voor het kweken en bewerken van primaire resusapen B-cellen met behulp van CRISPR / Cas9 en recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 6 voor de studie van B-celtherapieën.

Genbewerking van primaire resusapen B-cellen

We presenteren een protocol voor retrovirale transductie van gids-RNA in primaire T-cellen van Cas9 transgene muizen, en bieden een efficiënt alternatief voor genbewerking bij het bestuderen van Th17-differentiatie.

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Er is een gedetailleerd protocol voorzien voor het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie om zeer efficiënte, gerichte knock-in van grote, multicistronische constructies in primaire menselijke T-cellen te bereiken via de homologie-gemedieerde eindjoining (HMEJ) DNA-reparatieroute. T-cellen die met dit cGMP-aanpasbare protocol zijn ontwikkeld, behouden een uitstekende celexpansie, cytotoxiciteit en cytokineproductie.

Niet-virale engineering van primaire menselijke T-cellen via homologie-gemedieerde end-joining gerichte integratie van grote DNA-sjablonen

De afgifte van genoomredacteuren als RNA's is een bijzonder krachtig middel om de genomen van primaire zoogdiercellen en cellijnen te modificeren. Het doel van dit protocol is om genoomeditoren als mRNA te leveren in primaire zoogdiercellen en cellenlijnen, gevolgd door gerichte Illumina-sequencing en analyse om bewerkingsuitkomsten te kwantificeren.

Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA

Leer efficiënte small RNA-transfectie in primaire humane Th17-cellen met next generation electroporatie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar T-celdifferentiatie en immuunfunctie.

Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation

Meer video's verkennen