Name: Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Leer de expressie en zuivering van S100A12 voor antimicrobiële studies tegen H. pylori. Deze methode levert hoge opbrengsten van stabiel puur S100A12-dimeer voor onderzoek naar antimicrobiële peptiden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door het Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701, CTSA-prijs UL1TR000445 van het National Center for Advancing Translational Sciences, de National Science Foundation Award Numbers 1547757 en 1400969, en NIH grant GM05551. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs officiële opvattingen van het Nationaal Centrum voor de Bevordering van Vertaalwetenschappen of de National Institutes of Health.

1. Uitdrukking van S100A12 <ol><li> Transformeer bevoegde BL21 DE3 cellen met een pGEMEX-S100a12 plasmide met behulp van een standaard warmte schok protocol 18 . Voeg 1 tot 5 ul plasmide toe aan 50 μl bacteriën in een microcentrifugebuis op ijs. Incubeer gedurende 20 minuten. </li><li> Warmte schok de cellen bij 42 ° C gedurende 30 s. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 2 minuten op ijs. </li><li> Voeg 500 μL SOC media toe aan de cellen. Incubeer bij 37 ° C bij schudden bij 250 rpm op een orbitale shaker gedurende 1 uur. </li><li> Plate 150 μl van de transformatie reactie op LB-agar medium (aangevuld met 100 μg / ml ampicilline). Incubeer gedurende 12-16 uur bij 37 ° C. </li><li> Kies een kolonie. Inoculeer 2 ml LB (aangevuld met 100 μg / ml ampicilline). </li><li> Incubeer gedurende 4-6 uur bij 37 ° C op een orbitale shaker (300 rpm). De OD 600 moet tussen 1-3 absorptie-eenheden lezen. </li><li> Voeg 500 μl starterkweek toe aan 50 ml ZYM-5052 autoinduCtion media 26 aangevuld met 100 μg / ml ampicilline. Voor de beste beluchting en maximale expressie, gebruik een 250 ml verduisterde Erlenmeyer fles. Schud (300 rpm) gedurende 24 uur bij 37 ° C. </li><li> Breng bacteriële suspensie over naar een centrifugebuis. Pellet de cellen door centrifugeren (4.000 xg, 10 min) bij 4 ° C. </li><li> Decant de media, log-sample, en winkelcel pasta bij -80 ° C. Sample is jarenlang stabiel. </li></ol> 2. Zuivering van S100A12 onder toepassing van lage drukchromatografie <ol><li> Resuspendeer cellen in 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Soniceer de suspensie op ijs om de cellen te lichten. Gebruik ~ 20 W uitgang, 5 s aan en 5 s uit cyclus gedurende 5 min. </li><li> Breng de oplossing over naar centrifugebuizen met hoge snelheid. Verduidelijkt het cellysaat door centrifugeren, 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Dek de supernatant af en overbrengen naar een schone 100 ml polypropyleenbeker. Koel de oplossing door de beker op ijs te plaatsen. Voeg een roer baR en voeg 11,20 g ammoniumsulfaat langzaam toe. Laat de oplossing nog 1 uur roeren op ijs. Dit zal een 60% oplossing van ammoniumsulfaat creëren en de meeste E. coli endogene eiwitten neerslaan. S100A12 blijft oplosbaar. </li><li> Centrifugeer de oplossing bij 4 ° C, 20.000 xg gedurende 20 minuten om het geprecipiteerde eiwit te pelletiseren. </li><li> Decanteer de supernatant en overdragen naar dialysebuis (MWCO 3.500 kDa). Dialyze tegen 1 1 van 20 mM Tris, pH 8,0 bij 4 ° C. Verander de dialysebuffer tweemaal. Laat 4 uur tussen veranderingen toe. </li><li> Anionuitwisselingschromatografie <ol><li> Chromatografie uitvoeren op een laagdruk systeem. Typische stromingssnelheid is 1 ml / min. </li><li> Equilibreer een 5 ml Sepharose kolom met 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Laad de ~ 40 ml S100A12 oplossing met behulp van de monsterpomp (verzamel de doorvoer). </li><li> Was de kolom met 10 ml 20 mM Tris, pH 8. </li><li> Ontwikkel de kolom met een 0-30% gradiënt (BuFfer B is 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) boven 19 kolomvolumes (CV, 95 ml). Verzamel 5 ml fracties. </li><li> Neem een ​​10 μl aliquot van elke fractie en analyseer met behulp van MES SDS PAGE met Coomassie-kleuring. Loop gel met behulp van constante spanning (20 V / cm) gedurende 30 min. </li><li> Poolfracties die S100A12 bevatten. S100A12 loopt bij ~ 10 kDa eiwit op een denaturerende gel. </li><li> Fracties concentreren op 5 ml met behulp van een ultrafiltratieapparaat (MWCO 10 kDa). Centrifugeer bij 3.000 xg gedurende ~ 8 min. Neem de bovenste fractie. </li></ol></li><li> Grootte-uitsluiting chromatografie <ol><li> Equilibreer S75 kolom met 1 CV (120 ml) van 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl. </li><li> Spuit &lt;5 ml geconcentreerde S100A12 fracties (uit de ionenuitwisselingschromatografie). </li><li> Ontwikkel de kolom bij een stroming van 1 ml / m boven 120 ml. Verzamel 5 ml fracties. </li><li> Neem een ​​10 μl aliquot van elke fractie en analyseer met behulp van SDS PAGE met Coomassie-kleuring. Valideer eiwitidentiteit met behulp vanWestelijke blot of massaspectrometrie (berekende moleculaire massa van monomeer subeenheid 10,575,0 Da, gemeten 10575,4 Da). </li></ol></li><li> Poolfracties <ol><li> Meet de absorptie van het eiwit A 280 met behulp van een spectrofotometer. Gebruik de SEC-buffer als een blanco. De berekende uitstootcoëfficiënt voor S100A12 homodimeer is 5960 M -1 cm -1 . OPMERKING: Typische opbrengsten zijn 35-45 mg S100A12 per 50 ml cultuur. </li><li> Aliquot S100A12 in 1,5 ml microcentrifugebuizen (1 mg / buis), vries in vloeibare stikstof en berg bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Antimicrobiële activiteit Assays <ol><li> Streak H. pylori stam G27 op tryptische soja agar platen aangevuld met 5% schapen bloed (bloed agar platen). Vergroot 2-3 dagen bij 37 ° C in kamerlucht aangevuld met 5% kooldioxide. </li><li> Inoculate H. pylori in Brucella bouillon aangevuld met 1x cholesterol. Cultuur overNacht schudden (250 rpm) bij 37 ° C in kamerlucht aangevuld met 5% kooldioxide. </li><li> Verdun H. pylori 1:10 in 50% Brucella bouillon, 50% calprotectin buffer plus 1x cholesterol en cultuur in medium alleen of aangevuld met 100 μM zinkchloride plus 0, 100 of 1000 μg / ml gezuiverd S100A12. Cultuur &#39;s nachts schudden (250 rpm) bij 37 ° C in kamerlucht aangevuld met 5% kooldioxide. </li><li> Volg de volgende dag seriële verdunningen en plaat op bloed agarplaten. Laat bacteriële kolonies 2-3 dagen bij 37 ° C groeien in kamerlucht, aangevuld met 5% kooldioxide. Tel de kolonievormende eenheden op om bacteriële groei te berekenen in aanwezigheid of afwezigheid van S100A12 en / of exogeen zink. </li></ol>

<ol><li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+and+S100A9%3A+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity%2C+traditional+risk+factors%2C+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+%28DAMP%29+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).</li>
<li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li>
<li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines%3A+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li>
<li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins%3A+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li>
<li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li>
<li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n2/full/nrc3893.html">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li>
<li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B%2FZn2%2B+signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li>
<li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-associated+S100+proteins%3A+new+mechanisms+that+regulate+function%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Immunity%3A+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li>
<li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).</li>
<li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+structural+states+of+S100A12%3A+A+key+to+its+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li>
<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+genotypes%2C+host+factors%2C+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li>
<li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li>
<li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastric+precancerous+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dig+Dis%22%5BJournal%5D)">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer%3A+epidemiology+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li>
<li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450(2014).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense%2C+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li>
<li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+calgranulin+proteins+S100A8%2C+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li>
<li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Een efficiënt protocol voor zowel expressie als zuivering van menselijke S100A12 wordt gepresenteerd. Het E. coli expressiesysteem is het meest voorkomende hulpmiddel dat wordt gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, met name wanneer mg hoeveelheden nodig zijn voor biochemische en biofysische studies. Een belangrijke verbetering van de hier beschreven werkwijze is het gebruik van auto-inductiemedia 26 die de opbrengst van gezuiverd eiwit verhoogt met een factor van bijna de...

S100 eiwitten zijn een klasse van de EF-hand familie van calcium bindende eiwitten met een uiteenlopende reeks functies 1 . Ze worden uitgedrukt in een weefsel- en celspecifieke manier en regelen een breed spectrum van cellulaire functies 2 , 3 . Uniek voor calciumbindende eiwitten, S100-eiwitten vertoonden zowel intracellulaire als extracellulaire functies 4 , 5 . Binnen de cel veroorzaakt Ca 2+ binding een conformatieve verandering die een hydrofoob oppervlak blootstelt dat specifiek op eiwitbindende partners 6 staat . Dit intracellulaire mechanisme regelt belangrijke processen zoals cel proliferatie, differentiatie en energie metabolisme. In het extracellulaire milieu hebben S100 eiwitten twee functies 7 . In een, fungeren ze als schade geassocieerde moleculaire patroon (DAMP) eiwitten en initiëren een pro-inflammatoireAtoom immuunrespons door interactie met patroonherkenningsreceptoren 8 , 9 . Daarnaast hebben meerdere leden van de S100 proteïne klasse sequester overgangsmetalen, een functie die dient om microbiële pathogenen te verhongeren in een proces genaamd voedingsimmuniteit 10 , 11 . S100A12 (ook bekend als calgranulin C en EN-RAGE) wordt sterk uitgedrukt in macrofagen en neutrofielen en is geïdentificeerd als een potentiële biomarker voor ontstekingsziekten 12 , 13 . Naast bindend calcium op zijn EF-Hand-plaatsen heeft S100A12 twee hoge affiniteits-overgangsmetaalbindingsplaatsen, gelegen aan tegenover elkaar gelegen uiteinden van de dimerinterface 14 , 15 . Elke bindingsplaats bestaat uit drie histidine residuen en één asparaginezuurrest en kan zink of koper cheleren &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Onlangs hebben we gemeld dat S100A12-afhankelijke zinkhonging belangrijk is bij het reguleren van de groei van Helicobacter pylori en de activiteit van pro-inflammatoire virulentiefactoren 18 . H. pylori infecteert de maag van ongeveer de helft van de menselijke bevolking van de wereld; Waardoor het waarschijnlijk een van de meest succesvolle bacteriële pathogenen is 19 . Infectie met H. pylori kan leiden tot significante gastrische ziekte-uitkomsten, waaronder gastritis, peptische en duodenale ulcus, mucosa geassocieerd lymfoïdweefsel (MALT) lymfoom, en invasieve maag adenocarcinoom (maagkanker). Maagkanker is de belangrijkste oorzaak van de niet-cardia-kankerverwante dood in de wereld, en de grootste risicofactor voor maagkanker is de grootste bijbehorende risicofactor bij H. pylori . H. pylori blijft in de maag niche ondanks een robuustheidSt immuunrespons op het pathogeen, onderstrepen de behoefte aan een beter begrip van immuunmechanismen om deze bacteriële infectie 20 , 21 , 22 , 23 te beheersen. H. pylori- geassocieerde ontsteking wordt gekenmerkt door een diepgaande infiltratie van polymorfonucleaire cellen, of neutrofielen, die een repertoire van antimicrobiële eiwitten deponeren, waaronder S100A12, op de plaats van infectie 18 , 24 , 25 . In een poging om de complexe dialoog tussen gastheer en pathogeen te begrijpen, trachten we de techniek te verfijnen om S100A12 te zuiveren en te gebruiken om het antimicrobiële effect dat het uitoefent op dit medisch relevante pathogeen te bestuderen. Het protocol hieronder schetst een verbeterde techniek voor S100A12-zuivering in zijn biologisch actieve toestand; In staat om voedingsstoffen met hoge affini te bindenTy en cheleren ze weg van invasieve micro-organismen. Bovendien benadrukken de onderstaande methodes het nut van dit eiwit als een kritisch reagens om het mechanisme te bestuderen waarbij aangeboren antimicrobiële moleculen de groei van bacteriële pathogenen beperken. S100A-familie eiwitten hebben op prijs gesteld als een belangrijke groep aangeboren immuunsysteem moleculen die deelnemen aan immuun signalering evenals gastheer verdediging 27 . De meest goed bestudeerde hiervan is calprotectine (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectine is een neutrofiele geassocieerde eiwit die een heterodimeer vormt van de S100A8- en S100A9-subeenheden die overgangsmetalen binden aan de dimerinterface 31 . Calprotectine is aangetoond om twee metaalbindingsplaatsen te bezitten: Site 1 kan Zn 2+ , Mn 2+ , of Fe 2+ binden en Site 2 kan<html> Bind Zn 2+ 31 , 32 . Verschillende rapporten hebben aangetoond dat calprotectin antimicrobiële activiteiten tegen diverse pathogenen heeft, waaronder Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli en H. pylori , en dat de remmende effecten zijn te wijten aan de metaalchelatieactiviteit van calprotectin 25 , 28 , 29 . Eerdere werkzaamheden aangetoond dat calprotectine talrijke activiteiten op H. pylori uitoefent, inclusief het veranderen van de lipide A-structuur in het buitenmembraan, onderdrukking van het cag- Type IV-secretiesysteem (dat een belangrijke proinflammatoire virulentiefactor binnen H. pylori is ), het induceren van biofilmvorming en het onderdrukken van H. pylori groei en levensvatbaarheid op een dosisafhankelijke manierClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Bovendien bleken genetische en biochemische analyses de antibacteriële activiteit van calprotectine tegen H. pylori te berusten, grotendeels afkomstig van zijn vermogen om nutriëntzink 25 te binden. H. pylori vereist zink, zoals werd bepaald door eerder onderzoek dat een chemisch gedefinieerd medium gebruikt om de micronutriëntvereisten voor dit pathogeen te bepalen om 34 te groeien en te prolifereren. Daarnaast was calprotectine zeer overvloedig in H. pylori- geïnfecteerde weefsels, en geassocieerd met neutrofiele infiltraten, wat aangeeft dat de gastheer calprotectine kan gebruiken als een antimicrobiële strategie tijdens infectie en daaropvolgende ontsteking 25 , 35 . Recent bewijs van onbevooroordeelde proteomische screeningstechnieken suggereert dat onder omstandigheden waarin reactieve zuurstofsoorten overvloedig zijn, calprotecTin ondergaat post-translationele modificaties die de hexa-histidine bindingsplaats veranderen, waardoor de metaalbindende activiteit van het eiwit 36 wordt geremd. Als zodanig hebben we verondersteld dat andere eiwitten van de S100A-familie onder het brede repertoire van deze moleculen potentieel kunnen optreden als hulpmetaal-chelators. We hebben S100A12 geselecteerd voor verdere studie, omdat het niet werd geïdentificeerd in het voornoemde scherm voor posttranslatorische modificatie, het heeft de capaciteit om zink te binden en het is zeer overvloedig in menselijke weefsels afgeleid van H. pylori- geïnfecteerde individuen. Ons werk geeft aan dat S100A12 de groei en de levensvatbaarheid van H. pylori op dosisafhankelijke wijze kan remmen in de G27-stam van H. pylori en dat de antimicrobiële activiteit van dit eiwit omgekeerd kan worden door toevoeging van overtollig nutriëntzink. Dit werk aanvult ons vorige werk dat S100A12 aangeeft dat antimicrobiële activiteit tegen PMSS1 en 7.1 heeft uitgeoefend3 stammen van H. pylori , die zijn brede antibacteriële activiteit aantonen tegen talrijke klinische isolaten en laboratorium aangepaste stammen van H. pylori 18 . Samen bevestigen deze resultaten het belang van S100A12 als een mechanisme om bacteriële groei en proliferatie via voedingsimmuniteit te beheersen. Toekomstige studies van deze belangrijke gastro-bacteriële interactie zouden onder meer de uitoefening van de activiteit van S100A12 kunnen omvatten om de bacteriële last in gastheerweefsels te verminderen of de bijdrage van dit eiwit aan immuun signalering in de context van H. pylori- infectie te bepalen.

<table><tbody><tr><td>S100A12 Expressie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expressiecellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) competente cellen</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Auto-inductie medium componenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Research Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>lactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>Selectie-agens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>S100A12 Zuivering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Chromatografie Systeem</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>H. pylori Cultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloedbouillon platen</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella bouillon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zinkchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van s100a12

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin eiwitten zijn belangrijke mediators van aangeboren immuniteit en zijn leden van de S100 klasse van de EF-hand familie van calcium bindende eiwitten. Sommige S100-eiwitten hebben de mogelijkheid om overgangsmetalen te binden met een hoge affiniteit en ze kunnen ze effectief wegvallen van invallende microbiële pathogenen in een proces dat &quot;voedingsimmuniteit&quot; wordt genoemd. S100A12 (EN-RAGE) bindt zowel zink als koper en is zeer overvloedig in aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen. We rapporteren een verfijnde methode voor de expressie, verrijking en zuivering van S100A12 in zijn actieve, metaalbindende configuratie. Gebruik van dit eiwit in bacteriële groei en levensvatbaarheidsanalyses laat zien dat S100A12 antimicrobiële activiteit heeft tegen het bacteriepatogen, Helicobacter pylori . De antimicrobiële activiteit is gebaseerd op de zinkbindende activiteit van S100A12, die chloorvoedingszink chelaat, waardoor H. pylori verhongert, wat zink vereist voor groei en proliferation.

S100A12 expressie en zuivering Een drievoudige zuivering produceerde ~ 40 mg recombinant S100A12 uit 50 ml bacteriële cultuur. De eerste stap was een ammoniumsulfaatprecipitatie van endogene E. coli- eiwitten. Deze stap werd gevolgd door anion-uitwisselingschromatografie ( Figuur 1A ). Het eiwit wordt gevolgd door een SDS-PAGE gekleurd met Coomassie Brilliant Blue ( Figuur 1B</st...

Hier presenteren we een methode om S100A12 (Calgranulin C) uit te drukken en te zuiveren. We beschrijven een protocol om zijn antimicrobiële activiteit tegen het menselijke pathogeen H. pylori te meten.

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Het algemene doel van dit protocol is om de isolatie en zuivering van S100A12 in zijn actieve vorm te vergemakkelijken, zodat het kan worden gebruikt voor antimicrobiële assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de microbiologie, zoals wat de rol is van S100A12, een antimicrobieel peptide dat wordt geproduceerd als reactie op infectie door pathogene bacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ons geoptimaliseerde protocol hoge opbrengsten van stabiel, puur S100A12-dimeer oplevert, dat in staat is om nutriëntmetalen te binden en te sequestreren.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ervaren omdat S100A12 onder bepaalde omstandigheden oligomeren van verschillende grootten vormt, en deze oligomeren een verminderde antimicrobiële activiteit in vitro vertonen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we begonnen met het zuiveren en bestuderen van de antimicrobiële activiteit van een verwant S100A-familie-eiwit genaamd calprotectine. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal voor de stappen van de grootte-uitscheiding en de uiteindelijke zuivering via de kolom.En

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate an anion-exchange chromatography technique to purify human calcium-binding protein S100A12 based on the net surface charge of the protein from an Escherichia coli culture.

Anion-Exchange Chromatography-Based Protein Purification: A Separation Technique to Isolate a Protein of Interest From Dialyzed Bacterial Lysate Based on Net Charge

This video demonstrates an assay to investigate the cytotoxicity of proteins produced by Staphylococcus aureus, a pathogenic bacterium, on isolated human polymorphonuclear leukocytes (PMNs). The secreted cytotoxic proteins form pores on the PMN cell membrane, initiating cell death. Upon staining the dead cells using propidium iodide, flow cytometry is performed to quantify the dead cells and assess the cytotoxicity of the bacteria.

An Assay for Bacterial Extracellular Protein-Mediated Cytotoxicity on PMNs

De bereiding van hoogwaardige gist celextracten is een noodzakelijke eerste stap in de analyse van afzonderlijke eiwitten of hele proteomen. Hier een snelle, efficiënte en betrouwbare homogeniseren protocol voor gist cellen die is geoptimaliseerd om proteïnefuncties, interacties, en post-translationele modificaties behouden beschrijven we.

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Hier wordt een methode waarbij een permeabel membraan-insert gebaseerde infectiesysteem de effecten van streptolysine S, een uitgescheiden toxine geproduceerd door Groep A Streptococcus bestuderen op keratinocyten beschreven. Dit systeem kan eenvoudig worden toegepast op de studie van andere uitgescheiden bacteriële eiwitten op verschillende types gastheercel tijdens infectie.

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Dit protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor recombinant tag-vrij calcium bindend proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor humane monocyt stimulatie testen.

Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

His-tag zuivering, dialyse en activering worden gebruikt om de opbrengst van oplosbare, actieve matrix metalloproteinase-3 katalytische domein eiwitexpressie in bacteriën te verhogen. Eiwitfracties worden geanalyseerd via SDS-PAGE gels.

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Hier presenteren we een affiniteitszuiveringsmethode van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus die eenvoudig, goedkoop en efficiënt is.

Affiniteitszuivering van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus

Dit manuscript beschrijft hoe om te screenen op thermostabilizing mutaties, zuiveren de menselijke serotonine transporter, het genereren van antilichamen met hoge affiniteit, en kristalliseren de serotonine transporter antilichaam-complex gebonden aan het antidepressivum citalopram S. Dit protocol kan worden aangepast aan de studie van andere uitdagende membraantransporteiwitten, receptoren en kanalen.

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Leer de expressie en zuivering van S100A12 voor antimicrobiële studies tegen H. pylori. Deze methode levert hoge opbrengsten van stabiel puur S100A12-dimeer voor onderzoek naar antimicrobiële peptiden.

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Meer video's verkennen