Name: Een In Vitro Caseum Binding Assay die de penetratie van drugs in tuberculose-lesingen voorspelt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Leer een snelle evenwichtsdialyse-methode om drugbinding aan caseum in tuberculose-lesies te voorspellen. Dit protocol gebruikt een schuimige macrofaagmatrix als surrogaat voor caseum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Johnson &amp; Johnson, de TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X en Trius Therapeutics bedanken voor respectievelijk bedaquiline, PA-824 (pretomanide), AZD5847, radezolid en tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li en Danielle Weiner verstrekten ondersteuning met MALDI analyse, bioanalytische methoden, voorbereiding van de caseum surrogaat, chemische synthese en isolatie van konijn caseum. Dit werk is uitgevoerd met financiering van de Bill en Melinda Gates Foundation, award # OPP1044966 en OPP1024050 aan V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, evenals gezamenlijke financiering van de Bill en Melinda Gates Foundation en Wellcome Trust voor een Center of Excellence Voor Leadoptimalisatie voor ziekten van de ontwikkelingswereld naar P. Wyatt.

Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren van de nationale instituten van gezondheid, met goedkeuring van het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van de NIAID (NIH), Bethesda, MD. Alle studies met betrekking tot M. tuberculose werden uitgevoerd in een laboratorium met bioveiligheidsbeperkingsniveau 3 (BSL-3). 1. Konijn Infectie Model en Caseum Collection <ol><li> Infectie Nieuw- Zeelandse witte konijnen met M. tuberculose met gebruik van een blootstellingssysteem met uitsluitend aerosolbestrijding zoals eerder beschreven. 12 , 13 Laat de infectie gedurende 12-16 weken vooruit. Verplaats de konijnen met 35 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine intramusculair, euthaniseer de konijnen met 0,2 ml / kg pentobarbitalnatrium en fenytoïne-natrium intraveneus en ga verder met de necropsieën. </li><li> Met behulp van tweezers en een scalpel, verwijder de longen van de borst ca.viteit. Ontleed afzonderlijke holtes en grote necrotische granulomen met behulp van een scalpel uit elke longlap. Schraap het caseum voorzichtig uit de holte en de granulomuren. Weeg, op te nemen en op te slaan monsters in 2 ml schroefbuisjes bij -20 ° C tot klaar voor gebruik. </li><li> Gamma-bestraling de infectieuze caseummonsters op 3 MegaRad op droogijs om ze onfectief en veilig te maken voor gebruik in een BSL-2 lab. </li></ol> 2. In Vitro Generatie van Caseum Surrogaat van THP-1 Cells <ol><li> Groei THP-1 monocyten in RPMI 1640 medium (2 mM L-glutamine en 10% foetaal runder serum) in T175 celkweekflessen (80 ml / fles). Incubeer de flessen in een 5% CO 2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende 3-4 dagen. </li><li> Centrifugeer de cultuur van een T175 fles in twee 50 ml conische buizen bij 150 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en schuif de pellet in 10 ml RPMI 1640 media. </li><li> Pipetteer 5 μl van deze cultuur in een 1,5 ml buis die 45 μl t bevatRypan blauw. Meng grondig door pipettering. Draag 10 μL over naar een hemocytometer en tel het aantal levensvatbare THP-1 monocyten (onbeschadigd) met een lichtmicroscoop (10X vergroting). Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml van de cultuur. Verdun het met RPMI media tot de uiteindelijke dichtheid van 1,25 x 106 cellen / ml. </li><li> Laad 40 ml van de kweek op een grote celcultuurplaat (50 x 106 cellen / plaat). Voeg 40 μl 100 μM PMA (phorbol 12-myristaat13-acetaat bereid in ethanol) toe en laat cellen overnachten in de incubator. OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van PMA is 100 nM. </li><li> Verdun pure oliezuur (OA) (0,89 g / ml) in ethanol tot de concentratie van 0,1 M ( dwz 31,7 μL OA in 968,3 μL ethanol). Verdun deze oplossing in vers voorverwarmd RMPI media tot een concentratie van 10 mM. Verdun deze OA-suspensie naar 0,4 mM (eindwerkende concentratie) in RPMI-medium, vooraf verwarmd tot 37 ° C. </li><li> Verwijder de bestaande media en niet-adherende cellen uit de celkweekplaten en voeg 40 ml 0,4 mM OA zachtjes toe aan de THP-1 macrofagen (THP-M). Incubeer bij 37 ° C in de incubator overnacht. </li><li> Gebruik een lichtmicroscoop bij 40x vergroting om de aanwezigheid van talrijke lipide-lichaamsinsluitingen in elke THP-M visueel te bevestigen. Verwijder al het RPMI-medium uit de celkweekplaten en wacht de bijtende cellen tweemaal met fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een serologische pipet van 50 ml. OPMERKING: Lipide lichamen verschijnen als kleine, heldere, bolvormige structuren in het cytoplasma van de THP-M. </li><li> Voeg 40 ml 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in PBS toe aan elke plaat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de schuimige macrofagen (FM) door herhaaldelijk op en neer op de oppervlakte van de gehele plaat te pipetteren met behulp van een 10 ml serologische pipet. Zet de celsuspensie over in een 50 ml conische buis en draai gedurende 5 minuten op 150 xg. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 10 ml PBS (derde PBS was) aNd overdracht naar een voorgewogen 15 ml kegelbuizen. Spin opnieuw af bij 150 xg gedurende 5 minuten. Zuig de supernatant zorgvuldig door met behulp van een serologische pipet en weggooi. </li><li> Onderwerp de FM pellets op 3 vries-ontdooi cycli om de cellen te lichten en incubeer hen gedurende 20-30 minuten bij 75 ° C om eiwitten in de matrix te denatureren. Bewaar de pellets bij -20 ° C tot het klaar is voor gebruik. </li></ol> 3. Rapid Equilibration Dialysis (RED) Assay <ol><li> Bereid 10 mM voorraadoplossingen van alle testverbindingen in dimethylsulfoxide (DMSO) op. Verdun op 500 μM werkoplossingen in DMSO voorafgaand aan elke test. </li><li> Weeg de buis die de caseum surrogaatpellet bevat. Trek het gewicht van de lege buis af om het gewicht van de pellet alleen te kunnen afleiden. Voeg 2-3 metalen kralen per buis toe en gebruik een weefselhomogenisator bij 1,200 stromen / min gedurende 1 minuut, verstoord caseum of de surrogaatmatrix in PBS (1: 9 w / v) om 10x verdunde suspensie van elke matrix te verkrijgen. </li><li> Spike 6.5 μL van de 500ΜM oplossing van de testverbinding in 643,5 μl van het homogenaat om de uiteindelijke concentratie van 5 μM (≤1% DMSO) en vortex te bereiken. </li><li> Plaats de RODE inzetstukken in de basisplaat. Voeg 200 μL van de drugspikmatrix in de donorkamer (rode ring) van elk ROOD-inzetstuk en 350 μl PBS in elke ontvangerkamer. Bereid 3 inserts voor elke testverbinding (drievoudige monsters) op. Afdichtingsplaat met een kleefplaatafdichting en incuberen bij 37 ° C op de thermomixer bij 200 rpm (1 xg) gedurende 4 uur. </li><li> Na de incubatie meng de inhoud van de donor- en ontvangerkamers zachtjes door 2-3 keer op en neer te pipetteren. Pipetteer 20 μl aliquots van homogenaat uit de donorkamers en voeg toe aan 20 μl schone PBS in een 1,5 ml buis (1: 1). Op dezelfde manier pipetteer 20 μl alikvoten PBS-monsters uit de ontvangerkamers en voeg 20 μL schoon homogenaat toe (matrix matching). 8 OPMERKING: Matrix-matching elimineert de neEd voor 2 afzonderlijke kalibratiekrommen (in homogenaat en PBS) voor kwantitatieve analyse. Inhoud van de donorkamer kan in de loop der tijd sedimenten. Meng de inhoud voorzichtig door pipettering voordat u de porties verwijdert. </li></ol> 4. LC-MS Kwantificering en Data Analysis <ol><li> Voeg 160 μl 1: 1 methanol: acetonitril met 500 ng / ml diclofenac of 10 ng / ml verapamil (interne standaard) toe aan elke buis en vortex om eiwitten te precipiteren. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten om het neerslag te sedimenteren en supernatanten over te brengen in 96-putjes diepe putten voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LCMS) analyse. 7 </li><li> Calibratiekrommen van 1-1.000 nM opbouwen voor elke testverbinding, terwijl dezelfde matrixsamenstelling als bovenstaande monsters wordt gehouden. Kwantificeer de concentratie van de testverbinding in monsters van de donor- en ontvangerkamers met behulp van een LC-MS-methode. </li><li> Bereken de ongebonden fractie ( f u ) oF het geneesmiddel in verdunde matrix met behulp van vergelijking 1. Bereken de fu in onverdunde matrix met behulp van vergelijking 2 ( D = verdunningsfactor van 10). 14 <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Controleer het herstel (massasaldo) van elke verbinding met behulp van vergelijking 3 om verbindingen te identificeren met stabiliteit / metabolisme / niet-specifieke bindingsproblemen. OPMERKING: Het herstel valt meestal tussen 70% en 130%. 15 <img alt="Vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li>
<li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Int+Union+Tuberc%22%5BJournal%5D)">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li>
<li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li>
<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li>
<li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li>
<li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://jpharmsci.org/article/S0022-3549(16)32735-6/pdf">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li>
<li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+localization%2C+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+a+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li>
<li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2423064/">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li>
<li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure%3A+implications+for+rational+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Drug+Dispos%22%5BJournal%5D)">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li>
<li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li>
<li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
</ol>

Er zijn geen concurrerende financiële belangen.

Pulmonale necrotische letsels en holtes bij tuberculose-geïnfecteerde patiënten bevatten subpopulaties van bacteriën die onaantrekkelijk zijn voor de behandeling van geneesmiddelen. De caseous kernen van deze structuren zijn in het bijzonder verantwoordelijk voor het inhuren van deze persisten in een extracellulaire omgeving. 16 Gunstige verdeling van antibacteriële middelen in deze afgelegen locaties wordt geacht een belangrijke determinant van de werkzaamheid van tuberculose drugs te zijn. Voor...

De behandeling van pulmonale tuberculose ziekte vereist effectieve verdeling van geneesmiddelen in verschillende soorten laesies. Necrotische laesies en holtes bevatten caseous centra die subpopulaties van drugstolerante of &#39;aanhoudende&#39; bacteriën bezitten. 1 , 2 De cavitusziekte is geassocieerd met minderwaardige geneeskracht en een slechte prognose. 3 , 4 Vorige studies hebben aangetoond dat met behulp van kwantitatieve en beeldvormende technieken de mogelijkheid om caseum te penetreren significant verschilt van de ene geneesmiddelklasse naar de andere. 5 , 6 Deze methoden vereisen echter het gebruik van dierlijke infectiemodellen die traag en vervelend zijn. Een in vitro test die geneesmiddelen bindt aan ex vivo caseum is ontworpen. Deze binding bleek omgekeerd te correleeren met drugpenetratie in caseous granulomas en is derhalveGebruikt als voorspellend hulpmiddel. 7 Evenwichtsdialyse wordt beschouwd als de gouden standaardbenadering voor plasma-eiwitbindende studies. De snelle equilibrium dialysis (RED) -inrichting biedt een snel, makkelijk te gebruiken en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van dergelijke analyses. 8 Het apparaat bestaat uit twee componenten: eenmalig gebruik, wegwerpinzetten bestaande uit 2 kamers gescheiden door een verticale cilinder van semi-doorlatend membraan; En herbruikbare basisplaten die maximaal 48 inzetstukken tegelijk kunnen bevatten. Het dialysemembraan heeft een afscheiding van 8 kDa molecuulgewicht (MWCO) dat ideaal is voor drug-macromolecule bindingsstudies. De hoge oppervlakte-volume verhouding van het membraancompartiment zorgt voor snelle dialyse en evenwicht. Zowel de inzetstukken als de basisplaat zijn gevalideerd voor minimale niet-specifieke binding. De combinatie van het RED-apparaat met bioanalytische technieken zorgt voor nauwkeurige schattingen van de ongebonden fracties van geneesmiddelen in pLasma. 8 , 9 Hoewel oorspronkelijk ontworpen om plasma-eiwitbinding te meten, is het RED-apparaat gebruikt in verschillende weefselbindende studies waarbij gebruik wordt gemaakt van homogenaten. 10 , 11 In dit protocol, we meten bindmiddel aan caseum, de necrotische vuilnis uitgesneden uit de necrotische laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. De acellulaire en non-vasculaire aard van caseous materiaal maakt het gemakkelijk homogeniseren in een homogene suspensie die compatibel is met de test. Aangezien dat caseum vervelend is om te produceren en moeilijk te verkrijgen is, is het protocol ook gevalideerd voor gebruik met een surrogaatmatrix die uit schuimige macrofagen wordt bereid. THP-1 monocyt-afgeleide macrofagen worden geïnduceerd met oliezuur om meerdere lipide lichamen op te halen die hen hun &#39;schuimige&#39; uitstraling geven. Deze lipide geladen cellen worden geoogst enVerwerkt om een ​​matrix te produceren die we als surrogaat gebruiken voor caseum. Deze studie heeft aangetoond dat drug binding aan deze surrogaatmatrix goed corrigeert met binding aan caseum, effectief nabootsen van het in vivo proces dat de penetratie van drugs in de caseous kern van granulomen en holtes belemmert.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

een<em&gt; in vitro</em&gt; caseum binding assay die de penetratie van drugs in tuberculose-lesingen voorspelt

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

De uitroeiing van de ziekte van tuberculose vereist geneesmiddelenregimes die de veelvoudige lagen van complexe pulmonale letsels kunnen binnendringen. Drugsverdeling in de caseous kernen van holtes en laesies is vooral cruciaal omdat ze subpopulaties van drugstolerante bacteriën bezitten, ook vaak aangeduid als persisters. Bestaande methoden voor de meting van drugspenetratie bij tuberculose-laesies zijn kostbare en tijdrovende in vivo farmacokinetische studies gekoppeld aan bioanalytische of imaging technieken. De in vitro meting van drug binding aan caseum macromoleculen werd voorgesteld als een alternatief voor dergelijke technieken, aangezien deze binding de passieve diffusie van geneesmiddelmoleculen door caseum verhindert. Snelle evenwichtsdialyse is een snel en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van plasma-eiwit- en weefselbindingstudies. In dit protocol gebruikten we een snelle equilibrium dialysis (RED) -apparaat om bindend te zijn aan homogenaten van caseum dat excis isUit de laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. Het protocol beschrijft ook hoe u een surrogaatmatrix wilt genereren uit lipide geladen THP-1 macrofagen om in plaats van caseum te gebruiken. Deze caseum / surrogaatbindingstest is een belangrijk hulpmiddel bij het ontdekken van tuberculose-geneesmiddelen en kan aangepast worden om de verspreiding van geneesmiddelen bij letsels of abscesses die door andere aandoeningen worden veroorzaakt, te helpen bestuderen.

Met behulp van dit protocol, hebben we honderden van tuberculose de ontwikkeling van geneesmiddelen verbindingen getest op hun voorspelde efficiëntie op indringende geworden ca- seum. Figuur 1 visualiseert de basisconcepten van de RED assay. Het dialysemembraan van de RED inzetstukken maakt ongebonden kleine moleculen diffunderen van de donor en de ontvanger goed uiteindelijk bereiken van een evenwicht tussen beide compartimenten. Kleine moleculen die zijn gebonden aan m...

Hier beschrijven we een werkwijze snel evenwicht dialyse (RED) drug binding aan ca- seum longtuberculose laesies en holtes meten. Het protocol wordt ook gebruikt met een schuimige-macrofaag afgeleide matrix met een effectieve surrogaat voor ca- seum.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Binding Assay die de penetratie van drugs in tuberculose-lesingen voorspelt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Het algemene doel van dit protocol is het voorspellen van geneesmiddelbinding aan caseum uit tuberculose-laesies. Deze methode kan helpen bepalen hoe effectief antimicrobiële middelen doordringen in de caseuze kern van necrotische laesies zonder het gebruik van diermodellen en dure beeldvormingstechnieken. Hoewel deze methode inzicht kan geven in directe ontdekkingen bij tuberculose, kan deze ook worden toegepast op andere ziekten die worden gekenmerkt door de vorming van laesies of abscessen waarbij de penetratie van geneesmiddelen beperkt is.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien consistentie in de uitvoering van het protocol de reproduceerbaarheid van gegevens tussen experimenten waarborgt. Vandaag zal ik de celkweekprocedure en de bereiding van de surrogaatmatrix demonstreren. Hsin-pin, een research associate uit ons laboratorium, zal de bijbehorende assay demonstreren.Kweek THP-1 monocyten in T-175 kweekflessen met 80 mL RPMI 1640-medium, aangevuld met 2 millimolar l-glutamine en 10 procent foetaal runderserum. Incubeer de flessen bij 37 °C met vijf procent koolstofdioxide gedurende drie tot vier dagen. Wanneer de cellen ongeveer 70 procent confluent zijn, verdeel deze over twee conische buizen van 50 mL en centrifugeer ze bij 150 ×g gedurende vijf minuten.Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer het palatum in 10 mL RPMI 1640-medium. Pipetteer vijf µL van deze cultuur in een 1,5 mL buisje met 45 µL trypaanblauw. Meng grondig door te pipetteren.Breng 10 µL over naar een hemocytometer. Tel vervolgens met een lichtmicroscoop bij een 10x vergroting het aantal levensvatbare THP-1 monocyten. Nadat het aantal levensvatbare cellen per milliliter van de cultuur is bepaald, wordt deze verdund met RPMI-medium tot een uiteindelijke dichtheid van 1,25 × 10⁶ cellen per milliliter.Voeg 40 µL 100 µM PMA toe aan de buis. Breng de cultuur vervolgens over naar een celkweekplaat van 140 x 20 mm. Laat de cellen gedurende de nacht hechten in de incubator.Verdun vervolgens zuiver iliaczuur in ethanol tot een concentratie van 0,1 M. Hierbij worden 31,7 µL iliaczuur opgelost in 968,3 µL ethanol. Verdun de oplossing in vers, voorverwarmd RPMI-medium tot een concentratie van 10 mM.Verdun de iliazuursuspensie tot een uiteindelijke werksconcentratie van 0,4 millimolar in RPMI-medium dat is voorverwarmd tot 37 degrees Celsius. De verdunning van iliazuur in voorverwarmd RPMI-medium is cruciaal om een voldoende oplossing van het vetzuur in een waterige oplossing te waarborgen. Verwijder met een pipet het bestaande medium en de niet-adherente cellen uit de kweekplaat met THP-1-macrofagen en voeg voorzichtig 40 mL 0,1 millimolar iliazuur toe.Incubeer gedurende de nacht in de incubator bij 37 °C. Gebruik de volgende dag een lichtmicroscoop bij een 40x vergroting om de aanwezigheid van talrijke lipide-lichaamsinclusies in de THP-macrofaag visueel te bevestigen. Lipide-lichamen verschijnen als kleine, heldere, sferische structuren in het cytoplasma.Verwijder al het RPMI-medium uit de kweekplaat en was de adherente cellen voorzichtig twee keer met PBS met behulp van een serologische pipet van 50 mL. Voeg 40 mL van 5 millimolar EDTA en PBS toe aan de plaat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.Gebruik vervolgens een serologische pipet van 10 mL om de schuimige macrofagen los te maken door herhaaldelijk op en neer te pipetteren over het gehele oppervlak van de plaat. Overbreng de celsuspensie naar een conische buis van 50 mL en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 150 ×g.Resuspendeer na het centrifugeren de celpellet in 10 mL PBS en breng deze over naar een vooraf gewogen conische buis van 15 mL. Centrifugeer opnieuw bij 150 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant met een serologische pipet en gooi dit weg.Onderwerp de schuimige macrofaag-pellets aan drie freestyle-cycli. Wissel af tussen droogijs en incubatie bij 37 graden Celsius op een thermisch blok om de cellen te lyseren. Incubeer ze vervolgens bij 75 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om de eiwitten in de matrix te denatureren.Bewaar de palletten bij -20 °C tot ze nodig zijn. De rapid equilibrium devices, of RED-assay, die in dit deel van de video wordt getoond, kan worden uitgevoerd met gebruik van zowel de zojuist gemaakte surrogaatmatrix als weefsel uit TB-geïnfecteerde konijnenlaesies. Hier laten we de assay zien zoals deze wordt uitgevoerd op de surrogaatmatrix.Bereid 10 millimolaire voorraadoplossingen van alle testverbindingen. Hierbij wordt moxyfloxacine bereid in DMSO. Verdun deze vóór elke assay tot 500 micromolaire werkoplossingen in DMSO.Weeg de buis met het uitgesneden caseum of het surrogaatpalet. Trek het gewicht van de lege buis eraf om het gewicht van alleen het caseum of het surrogaatpalet te bepalen. Voeg twee tot drie metalen kraaltjes per buis toe en voeg vervolgens PBS toe in een verhouding van één op negen w/v. Ontricht het caseum of de surrogaatmatrix gedurende één minuut met een vortexmixer.Voeg 6,5 µL van de bereide testverbinding toe aan 643,5 µL van het homogenaat. Om een eindconcentratie van 5 µM te bereiken, wordt het mengsel gevortexd. Plaats vervolgens de rode inzetstukken in de basisplaat.Bereid de inserts voor voor elke test, waarbij elke verbinding in triplikaat wordt uitgevoerd. Voeg 200 µL van de met het geneesmiddel gespike matrix toe aan de rode donorkamer van elke rode insert. Voeg vervolgens 350 µL PBS toe aan elke ontvangerkamer.Plaats een plakfolie op de plaat en incubeer deze bij 37 degrees Celsius op de thermische menger bij 200 rotations per minute gedurende vier uur. Meng na de incubatie de inhoud van de donor- en ontvangerkamers voorzichtig door twee tot drie keer op en neer te pipetteren. Overbreng 20 microliters homogenaat van elke donorkamer naar 20 microliters schoon PBS in een 1,5 mL buisje.Breng op dezelfde wijze aliquots van 20 µL PBS-monsters over van de ontvangerkamers naar 20 µL schoon homogenizaat. Matrix-matching elimineert de noodzaak om voor de kwantitatieve analyse twee afzonderlijke kleurvisiecurves in homogenizaat en PBS op te stellen. De inhoud van de donorkamer vormt na verloop van tijd een sediment.Meng de inhoud voorzichtig door te pipetteren voordat er aliquots worden afgenomen. Voeg 160 µL van een één-op-één mengsel van methanol en acetonitril, met 500 ng/mL diclofenac of 10 ng/mL verapamil, aan elke buis toe als interne standaard. Vortex om de proteïnen te laten neerslaan.Centrifugeer 5 minuten bij 10000 x g om het precipitaat te laten bezinken en breng vervolgens de supernatanten over naar 96-well deep well plates voor analyse via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie, LCMS. Stel kalibratiecurves op van 1 tot 1000 nanomolair voor elke testverbinding door verdunningen van de voorraadoplossing van de verbinding te maken, waarbij dezelfde matrixsamenstelling als de monsters wordt behouden. Kwantificeer de concentratie van de testverbinding in monsters uit de donor- en ontvangerkamers met behulp van een LCMS-methode.Bereken de ongebonden fractie, of fu, van het geneesmiddel en de verdunde matrix met behulp van vergelijking één, zoals hier getoond. Bereken vervolgens de fu in de onverdunde matrix met behulp van vergelijking twee, waarbij D gelijk is aan een verdunningsfactor van 10. Controleer tot slot het herstel of de massabalans van elke verbinding met behulp van vergelijking drie, zoals hier getoond.Om verbindingen te identificeren met problemen op het gebied van stabiliteit, metabolisme of aspecifieke binding. Houd er rekening mee dat het herstel doorgaans tussen 70 procent en 130 procent ligt. Het in deze video beschreven protocol is gebruikt om honderden verbindingen voor de ontwikkeling van tuberculosemedicijnen te testen op hun voorspelde efficiëntie bij het penetreren van caseum.Het dialysemembraan van de rode inzetten maakt het mogelijk dat ongebonden kleine moleculen diffunderen van de donorput naar de ontvangersput, waardoor uiteindelijk een evenwicht tussen beide compartimenten wordt bereikt. Kleine moleculen die gebonden zijn aan macromoleculen, zoals eiwitten of lipiden, blijven gevangen in de donorput. Kwantitatieve analyse van de monsters uit beide compartimenten maakt de berekening mogelijk van de ongebonden fractie, fu, van elk klein molecuul in het caseum of de surrogaatmatrix, zoals hier wordt getoond.Hoe hoger de fu, hoe uitgebreider het geneesmiddel in het caseum diffundeert. Matrix-assisted laser desorption ionization, of MALDI-massaspectrometrie-imaging, werd uitgevoerd voor zes geneesmiddelen. Ionenkaarten van representatieve longlaesies worden hier getoond, waarbij de signaalintensiteit wordt aangegeven door de schaalbalk aan de linkerzijde.Hematoxiline en ESN of HNE kleuringen van aangrenzende coupes worden eronder getoond. De zwart-witte contourlijnen markeren het caseuze centrum van elke laesie. Deze gegevens zijn consistent met de hypothese dat geneesmiddelmoleculen vanuit de interface met de cellulaire lagen van de laesie diffunderen naar het buitenste deel van het caseum.Binding aan caseous macromoleculen sequestreert het geneesmiddel, waardoor verdere diffusie in de caseuze kern wordt voorkomen. Zoals hier wordt aangetoond, is de matrix geprepareerd uit THP-1-afgeleide schuimcellen een effectief surrogaat voor echt caseum. Binding in beide matrices correleert sterk met elkaar.Door deze procedure te volgen, kunnen meerdere verbindingen gelijktijdig worden getest om tijd en middelen te besparen. We noemen dit cassette-testing. Sinds de ontwikkeling is deze assay gebruikt door meerdere lead-optimalisatieprogramma's voor de ontdekking van geneesmiddelen tegen tuberculose.Vergeet niet dat het werken met microben en weefselmonsters geïnfecteerd met tuberculose zeer gevaarlijk kan zijn en dat een gevalideerd weefselsterilisatieprotocol met gammastraling moet worden gebruikt voordat geïnfecteerde monsterhulzen in een BSL2-laboratorium worden behandeld. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Sarathy, J. P. et al. An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates an in vitro assay for measuring drug binding to caseum from tuberculosis lesions using rapid equilibrium dialysis. It outlines the steps for preparing caseum suspensions, performing dialysis, and calculating the unbound drug fraction to predict drug penetration into caseum.

Measuring Drug Binding to Caseum from Tuberculosis Lesions via the Rapid Equilibrium Dialysis Method

This video demonstrates an assay to evaluate the efficacy of drugs against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. An in vitro infection model containing Mtb/macrophage aggregates is generated that mimics in vivo infection. Upon introducing suitable antibiotics, their efficacy is tested via resuzarin assay to monitor the survival of bacteria with increasing drug concentrations.

An Assay to Evaluate Drug Efficacy against a Mycobacterium tuberculosis Infection Model

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Hier beschrijven we een protocol met behulp van laser vangt microdissection LC/MS-analyse wordt gekoppeld aan het ruimtelijk-kwantificeren drug distributies binnen longtuberculose granulomas. De aanpak heeft brede toepasbaarheid te kwantificeren van de drug concentraties in weefsels bij hoge ruimtelijke detail.

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Hier presenteren we een protocol om potentiële anti-tuberculose-geneesmiddelkandidaten te identificeren via fenotypische screening, waaronder de chemische synthese van een 4-aminoquinolineverbinding, het bepalen van de minimale remmende concentratie tegen Mycobacterium tuberculosis en de beoordeling van de cytotoxiciteit in zoogdiercellijnen.

Identificatie van potentiële anti-TB-kandidaten: Een stapsgewijze gids voor synthese, MIC-bepaling en cytotoxiciteitsbeoordeling in zoogdiercellen

Dit artikel beschrijft de procedure voor de vorming en visualisatie van een bacteriële biofilm gegroeid binnen een 8-well kamer...

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

Leer een snelle evenwichtsdialyse-methode om drugbinding aan caseum in tuberculose-lesies te voorspellen. Dit protocol gebruikt een schuimige macrofaagmatrix als surrogaat voor caseum.

Een

Meer video's verkennen