Name: voorbereiding en In Vitro Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer een niet-virale methode voor microRNA-afgifte en magnetisatie van endotheelcellen met PEI/MNP-vectoren. Deze techniek verbetert celretentie en MRI-zichtbaarheid voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag G. Fulda (Electron Microscopy Center, Rostock University, Duitsland) bedanken voor de technische ondersteuning bij het verwerven van TEM beelden van gefilterde superparamagnetische nanodeeltjes en in het uitvoeren van hun X-stralen analyse. De werkzaamheden op de RTC Rostock gedragen werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A, FKZ 316159 en VIP + 03VP00241) en de Staat Mecklenburg-Voor-Pommeren met de EU-structuurfondsen (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 en ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) en de DFG (DA 1296-1), de Damp-Foundation en de Duitse Hartstichting (F / 01/12). Frank Wiekhorst werd gesteund door de EU FP7 onderzoeksprogramma &quot;NanoMag&quot; FP7-NMP-2013-GROOT-7.

We hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

De productie van genetisch gemanipuleerde cellen geladen met superparamagnetische nanopartikels voor de verdere magnetisch gestuurde geleiding heeft in het huidige protocol. De succesvolle toepassing van deze strategie maakt het mogelijk voor de oplossing van een aantal problemen van celtherapie, zoals lage retentie en slechte innesteling in de gewonde gebied 2, 3, 4, door middel van een richtbare cel product voor transplantati...

Gene en celtherapie zijn krachtige instrumenten die de potentie heeft om de huidige uitdagingen in de CVD behandeling op te lossen hebben. Ondanks het feit dat beide benaderingen worden momenteel getest in klinische studies, zijn ze nog niet klaar voor brede klinische toepassing 1. Met name een gemeenschappelijke benadering van de uitdagingen van gen- en celtherapie te pakken is om multifunctionele genafgifte vectoren die geschikt zijn voor klinische toepassing te ontwikkelen. Het gebrek aan veilige en efficiënte genafgifte systemen is de belangrijkste zorg van gentherapie. Tegelijkertijd, de genetische manipulatie van cellulaire producten voorafgaand aan transplantatie de grote uitdagingen van celtherapie, zoals lage efficiëntie (bijvoorbeeld in het cardiale gebied slechts ~ 5% functionele verbetering wordt bereikt na stamceltransplantatie 1 kon overwinnen ) en slechte retentie / implantatie op de plaats van letsel (dat wil zeggen, daalt celretentie dan 5-10% binnen minuten tot uren post-toepassing, ongeacht de toedieningsweg 2, 3, 4). Tot op heden virale vectoren aanzienlijk overschrijdt niet-virale systemen qua efficiëntie, wat heeft geleid tot bredere toepassing in klinische trials (~ 67%) 5. Echter, virale vehikels dragen ernstige risico&#39;s, zoals immunogeniteit (en de daaropvolgende ontstekingsreactie met ernstige complicaties), oncogeniciteit, en beperkingen van de omvang van de uitgevoerde genetisch materiaal 6. Vanwege deze veiligheidsproblemen en de hoge kosten van virale vectorproductie, het gebruik van niet-virale systemen de voorkeur in bepaalde gevallen 7, 8. Het is bijzonder geschikt voor kwalen die transiënte genetische correctie vereisen, zoals de expressie van groeifactoren regelen van angiogenese (bijvoorbeeld voor CVD behandeling) of delivery van vaccins. In onze groep werd een afgiftesysteem gemaakt door combineren van 25-kDa vertakte polyethyleenimine (PEI) en superparamagnetische ijzeroxide nanopartikels (MNP) gebonden door biotine-streptavidine interactie 9. Deze vector is een potentieel middel voor de genetische manipulatie van cellen, waardoor het gelijktijdig magnetisatie voorafgaand aan transplantatie. Laatstgenoemde vormt een basis voor magnetische geleiding / retentie, die bijzonder veelbelovend tegenwoordig geavanceerde magnetische targeting technieken met succes ontwikkeld 10. Bovendien is de resulterende magnetisch responsieve cellen hebben het potentieel om niet-invasief bewaakt door magnetische resonantie beeldvorming (MRI) of magnetische deeltjes imaging 11, 12. Bij de PEI / MNP vector, polyamine zorgt nucleïnezuur condensatie en dus bescherming tegen verval factor<html> s, vector internalisatie in cellen en endosomale ontsnappen 5. De MNP aanvulling op de eigenschappen van PEI, niet alleen qua magnetische geleiding, maar ook door het verminderen van de toxiciteit bekende PEI 7, 13, 14. Voorheen werden PEI / MNP vector eigenschappen qua afgifterendement (dwz pDNA en miRNA) en veiligheid bepalen door fibroblasten en menselijke mesenchymale stamcellen 15, 16. In dit manuscript wordt een gedetailleerd protocol over de toepassing van PEI / MNP&#39;s voor het genereren van miRNA-gemodificeerde cellen 17 beschreven. Hiertoe worden gebruikt HUVECs en een gevestigd model voor in vitro angiogenese vertegenwoordigen. Ze zijn moeilijk te transfecteren en zijn gevoelig voor toxische invloed 18, 19,ass = &quot;xref&quot;&gt; 20. Bovendien geven we een algoritme voor dergelijke cellen in vitro, waaronder het richten, intercellulaire communicatie en MRI detectie evalueren.

```html
<table><tbody><tr><td>PEI 25 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>Bevat Sephadex G-25 Medium</td></tr><tr><td>Ninhydrin Reagensoplossing 2%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7285</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader Model 680</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere Paramagnetische Deeltjes</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF Filter</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0,45 &micro;m</td></tr><tr><td>Libra 120 transmissie-elektronenmicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Versnellingsspanning 120&nbsp; kV</td></tr><tr><td>Sapphire X-ray detector</td><td>EDAX-Amatek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur plastic</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-31</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Esther Atto 488&nbsp;</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-31</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 miRNA Label IT kit</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Atto 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>Collagense Type IV Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Endotheel groeimedium, EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 &amp; CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>anti-PECAM-1 antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td></td></tr><tr><td>MS MACS columns</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negatieve Controle</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17120</td><td>"Cy3-miR" of "Cyanine-miR3" in het manuscript</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA Precursor Moleculen - Negatieve Controle&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17110</td><td>"scr-miR" in het manuscript</td></tr><tr><td>Anti-hsa-miR92a-3p synthetisch Inhibitor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM10916</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 systeem</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>4% oplossing in PBS</td></tr><tr><td>DAPI nucleair kleurmiddel</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA isolatie Kit</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolatie Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptie Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR Systeem</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcriptie Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>hsa-miR-92a TaqMan test</td><td>Thermo Scientific</td><td>000431</td><td>Volwassen miRNA-sequentie: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU</td></tr><tr><td>FastGene Taq Ready Mix</td><td>Nippon Genetics</td><td>LS27</td><td></td></tr><tr><td>ITGA5 TaqMan test</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hs01547673_m1</td><td></td></tr><tr><td>RNU6B TaqMan test</td><td>Thermo Scientific</td><td>001093</td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA Endogenous Control</td><td>Thermo Scientific</td><td>4333760F</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>7,1 Tesla dier MRI systeem</td><td>Bruker Corporation</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>bijgewerkt met een AngiogenesisAnalyzer (NIH)</td></tr><tr><td>MPS apparaat</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring Neodym Magneet&nbsp;</td><td>magnets4you GmbH</td><td>RM-10x04x05-G</td><td>&oslash; 10 mm; remanentie is ~ 1,3&nbsp; T, coerciviteit &ge; 955 kA/m</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave Reagens</td><td>Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoon bad</td><td>Bandelin electronic</td><td>Type: RK 100 SH</td><td></td></tr></tbody></table>
```

voorbereiding en<em&gt; in vitro</em&gt; karakterisering van magnetische mir-gemodificeerde endotheelcellen

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Tot op heden, de beschikbare chirurgische en farmacologische behandelingen voor hart- en vaatziekten (HVZ) zijn beperkt en vaak palliatieve. Tegelijkertijd, gentherapie, celtherapie zijn veelbelovende alternatieve benaderingen voor CVD behandeling. Echter, de brede klinische toepassing van gentherapie sterk beperkt door het gebrek aan geschikte gen-afgiftesystemen. De ontwikkeling van geschikte genafleveringsvectoren kan een oplossing voor de huidige problemen in cel therapie. Met name bestaande nadelen, zoals beperkte efficiëntie en lage retentietijd van cellen in het beschadigde orgaan, kunnen worden overwonnen door geschikte cel techniek (dwz genetische) vóór transplantatie. De gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte en veilige tijdelijke modificatie van endotheelcellen behulp polyethyleenimine superparamagnetische magnetische nanodeeltjes (PEI / MNP) gebaseerde afleverende vector. Ook het algoritme en werkwijzen voor cellulaire karakterisatie gedefinieerd. De succesvolle intracellular levering van microRNA (miR) in humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) is verwezenlijkt zonder dat cellevensvatbaarheid, functionaliteit of intercellulaire communicatie. Bovendien werd deze aanpak blijkt een sterke functionele effect geïntroduceerde exogene miR veroorzaken. Belangrijk is dat de toepassing van deze MNP-gebaseerde vector verzekert cel magnetisatie, met bijbehorende mogelijkheden magnetische targeting en niet-invasieve MRI tracing. Dit kan als basis voor het magnetisch geleid genetisch gemanipuleerde cellen therapeutica die niet-invasief kan worden gevolgd met MRI te verschaffen.

Hoofddoel van de voorgestelde protocol magnetisch responsieve miR-gemodificeerde cellen en hun nauwkeurige karakterisering (figuur 1) te voeren. Hierdoor efficiënt getransfecteerde cellen, reagerend op magnetische selectie en begeleiding en detecteerbaar met MRI, worden verkregen. Ten eerste, de identiteit van geïsoleerde HUVEC&#39;s werden bevestigd door typische kleuring met endotheliale merker CD31 (PECAM) ...

Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Het algemene doel van deze procedure is het introduceren van een techniek die celmodificatie met microRNA en gelijktijdige celmagnetisatie waarborgt. Deze methode kan belangrijke uitdagingen in het veld van de regeneratieve geneeskunde aanpakken, zoals de genetische modificatie van cellen voorafgaand aan transplantatie.Naast efficiënte celmodificatie met microRNA, maakten zij dit ook mogelijk met ijzeroxide. Dit kan worden gebruikt om de celretentie op de gewenste locatie te verhogen door middel van het aanbrengen van een magnetisch veld. Celtherapie is zeer veelbelovend voor de behandeling van hartaandoeningen, maar de lage celretentie en celoverleving moeten dringend worden verbeterd.Begin deze procedure met een kweek van menselijke endotheelcellen uit de navelstrengvene ter voorbereiding van de transfectiecomplexen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Zaai de HUVEC's 48 uur voor de transfectie uit op plastic celkweekplaten van een geschikte grootte, met een startceldichtheid van ongeveer 13 000 cellen per vierkante centimeter groeioppervlak.Bereid vervolgens verse miR/polyethyleenimine/superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes. Verdun eerst 2,5 picomol microRNA per vierkante centimeter celgroei-oppervlak en een vijfprocentige glucoseloplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,125 picomol microRNA per microliter te verkrijgen. Verdun vervolgens het PEI in een gelijk volume vijfprocentige glucoseloplossing.Voeg de verdunde PEI toe aan de microRNA-oplossing en vortex het verkregen mengsel gedurende 30 seconden. Incubeer vervolgens het miR/PEI-mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Sonicate de MNP's gedurende ten minste 20 minuten in het sonicatie-waterbad bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid MNP-oplossing toe aan het klaargezette miR/PEI-mengsel. Na 30 seconden vortexen wordt het mengsel 30 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Voeg daarna het bereide miR/PEI/MNP-mengsel druppelsgewijs direct toe aan het cultuurmedium op de cellen.Vervang dit mengsel zes uur na transfectie door vers kweekmedium. Na analyse van de vectorveiligheid, zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de intracellulaire lokalisatie van de transfectiecomplexen bevestigd en gekarakteriseerd middels confocale microscopie en superresolutie-gestructureerde illuminatiemicroscopie. Hiervoor worden de HUVEC's, zoals eerder gedaan, uitgezaaid op met gelatine gecoate glazen dekglasjes die in de putjes van 24-wells kweekplaten zijn geplaatst.Transfecteer de cellen met 3-kleurengelabelde miR/PEI/MNP en incubeer deze gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent kooldioxide. Was de dekglasjes eerst met twee procent bovien serumalbumine en fosfaatgebufferde zoutoplossing, en daarna enkel met PBS. Fixeer de cellen door incubatie in vier procent paraformaldehyde of PFA bij 37 °C gedurende 15 minuten.Was met PBS en kleur vervolgens de kernen met DAPI volgens standaardprotocollen. Was de cellen daarna drie keer gedurende 15 minuten met PBS op de shaker om overtollige kleurstof te verwijderen. Plaats de voorbereide dekglasjes op microscoopglaasjes met behulp van een geschikt monteermedium en laat de glaasjes minstens één uur drogen voordat ze voor microscopie worden gebruikt.Verkrijg beelden met een 63x olie-immersieobjectief volgens de SIM-instellingen in het tekstprotocol. Voor celdoelwitbepaling en gesimuleerde dynamische condities in vitro, transfecteer eerst de HUVECs in een 24-well plaat zoals voorheen. Was de cellen na een incubatieperiode van 24 uur.Voeg vervolgens 1x trips in EDTA verdund in PBS toe en incubeer de cellen gedurende vier minuten bij 37 °C voordat de cellen worden verzameld. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 300 ×g gedurende 10 minuten. Meng het verkregen celpellet uit één well met 1 ml vers kweekmedium.Breng de cellen over naar één well van een 12-wellplaat. Fixeer een kleine magneet lokaal met plakband. Plaats de kweekplaat op de schudmachine en incubeer de celsuspensie gedurende 12 uur bij 150 RPM om dynamische condities te simuleren.Was vervolgens de cellen en fixeer deze met 4% PFA. Kleur de kernen met DAPI. Registreer de celhechting met behulp van laser scanning confocale microscopie met 405 en 504 nanometer excitatielasers in z-stack-modus om de ruwe data te verkrijgen.Gebruik maximale intensiteitsprojectie-beeldverwerking om beelden voor analyse te creëren. Voor kwantitatieve analyse van magnetisch responsieve en niet-responsieve cellen, transfecteer eerst de HUVECs in een 24-well plaat. Incubeer de cellen gedurende 24 uur voordat de cellen worden gewassen en verzameld zoals eerder beschreven.Resuspendeer het celpellet dat uit elke well is verkregen in 500 µL voorverwarmde steriele cel-sorteerbuffer. Breng de celsuspensie aan op een magnetische sorteerkolom die is gefixeerd met de meegeleverde magneet. Was vervolgens de kolommen op de magneet drie keer met verse cel-sorteerbuffer.Verzamel de doorstroom als de magnetisch niet-responsieve fractie. Verwijder de kolommen van de magneet en verzamel onmiddellijk de magnetisch responsieve celfractie door verse cel-sorteerbuffer met een zuiger door de kolom te duwen. Centrifugeer zowel de Mag- als de Mag+-fracties bij 300 ×g gedurende 10 minuten.Nadat het celpellet in PBS is geresuspendeerd, worden de cellen geteld en wordt de celviabiliteit geëvalueerd met een trypaanblauw-uitsluitingsassay. HUVEC's, geïsoleerd uit navelstrengen, worden gekenmerkt door de expressie van de endotheliale marker CD31 en door de vorming van buisjes op een basaalmembraanmatrix. HUVEC's getransfecteerd met miR/PEI/MNP nemen allemaal het gelabelde miR op.En hun overleving blijft onbeïnvloed 24 uur na transfectie. Daarnaast laat superresolutie-microscopie een paranucleaire lokalisatie zien van met drie kleuren gelabelde transfectiecomplexen. PEI-toxiciteit wordt bevestigd door de verminderde functionaliteit van miR/PEI-getransfecteerde cellen.Belangrijk is dat MNP de celeigenschappen herstelt. miR/PEI/MNP-gemodificeerde cellen verschillen niet van onbehandelde cellen wat betreft buikvorming. Bovendien behouden deze cellen de intercellulaire gap-junction communicatie, zoals aangetoond via fluorescence recovery after photo-bleaching.Zodra een suspensie van miR/PEI/MNP-gemodificeerde cellen is uitgezaaid in de putjes van een kweekplaat die op de rotatie-shaker is geplaatst, neigen de cellen naar het gebied van de lokale magneetapplicatie om te migreren en te hechten. Representatieve afbeeldingen tonen de celgroei in het gebied met magneetapplicatie. Zonder magneetapplicatie.En in het centrum van de kweekput, waar de vloeistofstroom de cellen concentreerde. Eenmaal onder de knie, kan celtransfectie in twee uur worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed beeld moeten hebben van hoe endotheliale cellen transient maar zeer efficiënt kunnen worden gemodificeerd, inclusief de magnetisatie.En ook hoe het celproduct terminaal gekarakteriseerd kan worden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de opgegeven getallen voor de celzaaigrootte, de hoeveelheden componenten voor de bereiding van de transfectiecomplexen, de incubatietijd en de wasstap na de transfectie nauwkeurig op te volgen. Wij zijn zeer optimistisch dat deze aanpak goed overdraagbaar zal zijn naar andere celtypen voor de behandeling van andere aangedane organen.Na deze procedure kunnen in vivo-studies met gemodificeerde gemagnetiseerde cellen worden uitgevoerd. Deze kunnen aanvullende vragen beantwoorden over de vraag of ijzerbelading van cellen efficiënt genoeg is om hun retentie in het gebied van interesse te waarborgen, en om de detectielimieten met MRI in vivo te definiëren.

preparation-vitro-characterization-magnetized-mir-modified

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates a technique for purifying CD31+ endothelial progenitor cells (EPCs) from a culture using magnetic-activated cell sorting (MACS). The cell suspension is treated with a fluorophore-conjugated antibody that binds to CD31 on the EPCs. Completing the labeling of CD31+ EPCs involves adding an antibody complex, which binds to the fluorophores, and a polymer-coated magnetic nanoparticle, which binds to the antibody complex. The labeled cells are then purified using a magnetic...

Purification of CD31+ Endothelial Precursor Cells Using Magnetic-Activated Cell Sorting

Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo's op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Onze doelen waren voor het ontwerpen, produceren en testen ferromagnetische stents voor endotheelcellen capture. Ten stents werden getest op breuk en 10 meer stents werden getest behouden magnetisme. Tenslotte werden 10 stents getest in-vitro en 8 meer stents werden geïmplanteerd in 4 varkens cell capture en retentie vertonen.

Ferromagnetische Bare Metal Stent voor endotheelcellen Capture and Retention

Dit protocol is opgesteld om onze methode voor het isoleren van muizen coronaire endotheelcellen te delen, met als doel beeldvorming of om moleculair-biologische experimenten uit te voeren.

Isolatie van muis coronaire endotheelcellen

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

Microvasculaire endotheliale cellen van skeletspieren (MMEC) vorm van de binnenwand van de spier haarvaten en reguleren beide, uitwisseling van vloeistoffen/moleculen en migratie van (afweercellen) tussen spierweefsel en bloed. Isolatie van primaire lymfkliertest MMEC, kunt zoals hier beschreven, u uitgebreide in vitro onderzoeken van de "myovascular-eenheid".

Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen

We presenteren een gedetailleerd protocol om een murine xenograft model van veneuze misvorming te genereren. Dit model is gebaseerd op de onderhuidse injectie van patiënt-afgeleide endotheelcellen die hyper-activerende TIE2 en/of PIK3CA genmutaties bevatten. Xenograftlaesies vatten de histopathologische kenmerken van VM-patiëntweefsel nauwkeurig samen.

Een patiënt-afgeleide Xenograft Model voor veneuze misvorming

Dit protocol beschrijft een aangepaste methode om microvasculaire endotheelcellen van de hersenen af te leiden, uit te breiden en cryopreserveren, verkregen door het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en om de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière in een ex vivo model te bestuderen.

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een protocol, de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), die differentiatie van pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC) -achtige cellen mogelijk maakt. Deze cellen vertonen endotheelceladhesiemolecuulexpressie en zijn dus een menselijk bloed-hersenbarrièremodel dat geschikt is om immuuncelinteracties in vitro te bestuderen.

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Hier beschrijven we een magnetische scheidings-geassisteerde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels als een nieuw type exosoomnabootsers (EM's) die dezelfde biologische oorsprong en vergelijkbare structuur, morfologie en eiwitsamenstelling van inheemse extracellulaire blaasjes (EV's) delen.

Een magnetische scheidings-ondersteunde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide blaasjes

Leer een niet-virale methode voor microRNA-afgifte en magnetisatie van endotheelcellen met PEI/MNP-vectoren. Deze techniek verbetert celretentie en MRI-zichtbaarheid voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.

voorbereiding en

Meer video's verkennen