voorbereiding en

Het algemene doel van deze procedure is het introduceren van een techniek die celmodificatie met microRNA en gelijktijdige celmagnetisatie waarborgt. Deze methode kan belangrijke uitdagingen in het veld van de regeneratieve geneeskunde aanpakken, zoals de genetische modificatie van cellen voorafgaand aan transplantatie.

Naast efficiënte celmodificatie met microRNA, maakten zij dit ook mogelijk met ijzeroxide. Dit kan worden gebruikt om de celretentie op de gewenste locatie te verhogen door middel van het aanbrengen van een magnetisch veld. Celtherapie is zeer veelbelovend voor de behandeling van hartaandoeningen, maar de lage celretentie en celoverleving moeten dringend worden verbeterd.

Begin deze procedure met een kweek van menselijke endotheelcellen uit de navelstrengvene ter voorbereiding van de transfectiecomplexen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Zaai de HUVEC's 48 uur voor de transfectie uit op plastic celkweekplaten van een geschikte grootte, met een startceldichtheid van ongeveer 13 000 cellen per vierkante centimeter groeioppervlak.

Bereid vervolgens verse miR/polyethyleenimine/superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes. Verdun eerst 2,5 picomol microRNA per vierkante centimeter celgroei-oppervlak en een vijfprocentige glucoseloplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,125 picomol microRNA per microliter te verkrijgen. Verdun vervolgens het PEI in een gelijk volume vijfprocentige glucoseloplossing.

Voeg de verdunde PEI toe aan de microRNA-oplossing en vortex het verkregen mengsel gedurende 30 seconden. Incubeer vervolgens het miR/PEI-mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Sonicate de MNP's gedurende ten minste 20 minuten in het sonicatie-waterbad bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid MNP-oplossing toe aan het klaargezette miR/PEI-mengsel. Na 30 seconden vortexen wordt het mengsel 30 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Voeg daarna het bereide miR/PEI/MNP-mengsel druppelsgewijs direct toe aan het cultuurmedium op de cellen.

Vervang dit mengsel zes uur na transfectie door vers kweekmedium. Na analyse van de vectorveiligheid, zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de intracellulaire lokalisatie van de transfectiecomplexen bevestigd en gekarakteriseerd middels confocale microscopie en superresolutie-gestructureerde illuminatiemicroscopie. Hiervoor worden de HUVEC's, zoals eerder gedaan, uitgezaaid op met gelatine gecoate glazen dekglasjes die in de putjes van 24-wells kweekplaten zijn geplaatst.

Transfecteer de cellen met 3-kleurengelabelde miR/PEI/MNP en incubeer deze gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent kooldioxide. Was de dekglasjes eerst met twee procent bovien serumalbumine en fosfaatgebufferde zoutoplossing, en daarna enkel met PBS. Fixeer de cellen door incubatie in vier procent paraformaldehyde of PFA bij 37 °C gedurende 15 minuten.

Was met PBS en kleur vervolgens de kernen met DAPI volgens standaardprotocollen. Was de cellen daarna drie keer gedurende 15 minuten met PBS op de shaker om overtollige kleurstof te verwijderen. Plaats de voorbereide dekglasjes op microscoopglaasjes met behulp van een geschikt monteermedium en laat de glaasjes minstens één uur drogen voordat ze voor microscopie worden gebruikt.

Verkrijg beelden met een 63x olie-immersieobjectief volgens de SIM-instellingen in het tekstprotocol. Voor celdoelwitbepaling en gesimuleerde dynamische condities in vitro, transfecteer eerst de HUVECs in een 24-well plaat zoals voorheen. Was de cellen na een incubatieperiode van 24 uur.

Voeg vervolgens 1x trips in EDTA verdund in PBS toe en incubeer de cellen gedurende vier minuten bij 37 °C voordat de cellen worden verzameld. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 300 ×g gedurende 10 minuten. Meng het verkregen celpellet uit één well met 1 ml vers kweekmedium.

Breng de cellen over naar één well van een 12-wellplaat. Fixeer een kleine magneet lokaal met plakband. Plaats de kweekplaat op de schudmachine en incubeer de celsuspensie gedurende 12 uur bij 150 RPM om dynamische condities te simuleren.

Was vervolgens de cellen en fixeer deze met 4% PFA. Kleur de kernen met DAPI. Registreer de celhechting met behulp van laser scanning confocale microscopie met 405 en 504 nanometer excitatielasers in z-stack-modus om de ruwe data te verkrijgen.

Gebruik maximale intensiteitsprojectie-beeldverwerking om beelden voor analyse te creëren. Voor kwantitatieve analyse van magnetisch responsieve en niet-responsieve cellen, transfecteer eerst de HUVECs in een 24-well plaat. Incubeer de cellen gedurende 24 uur voordat de cellen worden gewassen en verzameld zoals eerder beschreven.

Resuspendeer het celpellet dat uit elke well is verkregen in 500 µL voorverwarmde steriele cel-sorteerbuffer. Breng de celsuspensie aan op een magnetische sorteerkolom die is gefixeerd met de meegeleverde magneet. Was vervolgens de kolommen op de magneet drie keer met verse cel-sorteerbuffer.

Verzamel de doorstroom als de magnetisch niet-responsieve fractie. Verwijder de kolommen van de magneet en verzamel onmiddellijk de magnetisch responsieve celfractie door verse cel-sorteerbuffer met een zuiger door de kolom te duwen. Centrifugeer zowel de Mag- als de Mag+-fracties bij 300 ×g gedurende 10 minuten.

Nadat het celpellet in PBS is geresuspendeerd, worden de cellen geteld en wordt de celviabiliteit geëvalueerd met een trypaanblauw-uitsluitingsassay. HUVEC's, geïsoleerd uit navelstrengen, worden gekenmerkt door de expressie van de endotheliale marker CD31 en door de vorming van buisjes op een basaalmembraanmatrix. HUVEC's getransfecteerd met miR/PEI/MNP nemen allemaal het gelabelde miR op.

En hun overleving blijft onbeïnvloed 24 uur na transfectie. Daarnaast laat superresolutie-microscopie een paranucleaire lokalisatie zien van met drie kleuren gelabelde transfectiecomplexen. PEI-toxiciteit wordt bevestigd door de verminderde functionaliteit van miR/PEI-getransfecteerde cellen.

Belangrijk is dat MNP de celeigenschappen herstelt. miR/PEI/MNP-gemodificeerde cellen verschillen niet van onbehandelde cellen wat betreft buikvorming. Bovendien behouden deze cellen de intercellulaire gap-junction communicatie, zoals aangetoond via fluorescence recovery after photo-bleaching.

Zodra een suspensie van miR/PEI/MNP-gemodificeerde cellen is uitgezaaid in de putjes van een kweekplaat die op de rotatie-shaker is geplaatst, neigen de cellen naar het gebied van de lokale magneetapplicatie om te migreren en te hechten. Representatieve afbeeldingen tonen de celgroei in het gebied met magneetapplicatie. Zonder magneetapplicatie.

En in het centrum van de kweekput, waar de vloeistofstroom de cellen concentreerde. Eenmaal onder de knie, kan celtransfectie in twee uur worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een zeer goed beeld moeten hebben van hoe endotheliale cellen transient maar zeer efficiënt kunnen worden gemodificeerd, inclusief de magnetisatie.

En ook hoe het celproduct terminaal gekarakteriseerd kan worden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de opgegeven getallen voor de celzaaigrootte, de hoeveelheden componenten voor de bereiding van de transfectiecomplexen, de incubatietijd en de wasstap na de transfectie nauwkeurig op te volgen. Wij zijn zeer optimistisch dat deze aanpak goed overdraagbaar zal zijn naar andere celtypen voor de behandeling van andere aangedane organen.

Na deze procedure kunnen in vivo-studies met gemodificeerde gemagnetiseerde cellen worden uitgevoerd. Deze kunnen aanvullende vragen beantwoorden over de vraag of ijzerbelading van cellen efficiënt genoeg is om hun retentie in het gebied van interesse te waarborgen, en om de detectielimieten met MRI in vivo te definiëren.