voorbereiding en In Vitro Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen
2 mei 2017
Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.
Het algemene doel van deze procedure is om een techniek te introduceren die zorgt voor celmodificatie met micro-RNA en parallelle celmagnetisatie. Deze methode kan belangrijke uitdagingen in het veld van regeneratieve geneeskunde aanpakken. Zoals genetische manipulatie van cellen vóór transplantatie.
Naast efficiënte celmodificatie met micro-RNA, hebben ze het ook mogelijk gemaakt met ijzeroxide. Dit kan worden gebruikt om de celretentie in de belangrijke zijde te verbeteren door toepassing van een magnetisch veld. Celtherapie is zeer veelbelovend voor de behandeling van hartaandoeningen, hypocelretentie en voor celoverleving is dringend verbetering noodzakelijk.
Begin deze procedure met humane navelstrengveneuse-endotheelcelcultuur in voorbereiding van transfectiecomplexen zoals beschreven in het tekstprotocol. 48 uur vóór transfectie, zaai de HUVEC's op plastic celcultuurputjes van geschikte grootte. Met een startceldichtheid van ongeveer 13.000 cellen per vierkante centimeter groeivorm.
Bereid vervolgens verse miR/polyethylenimine/superparamagnetisch ijzeroxide nanodeeltjes. Verdun eerst 2,5 picomol micro-RNA per vierkante centimeter celgroeivorm en vijf procent glucose-oplossing om een eindconcentratie van 0,125 picomol micro-RNA per microliter te verkrijgen. Verdun vervolgens de PEI in een gelijk volume van vijf procent glucose-oplossing.
Voeg de verdunde PEI toe aan de micro-RNA-oplossing en vortex de verkregen mengsel gedurende 30 seconden. Incubeer vervolgens het miR/PEI-mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Soniceer de MNP's gedurende minimaal 20 minuten in het sonicerende waterbad bij kamertemperatuur.
Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid MNP-oplossing toe aan het klaarstaande miR/PEI-mengsel. Na het vortexen gedurende 30 seconden, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens het bereide miR/PEI/MNP-mengsel druppelsgewijs direct toe aan het kweekmedium op de cellen.
Vervang dit mengsel zes uur na transfectie door vers kweekmedium. Na analyse van vectorveiligheid zoals beschreven in het tekstprotocol, bevestig en karakteriseer de intracellulaire lokalisatie van transfectiecomplexen door confocale en superresolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie. Om dit te doen, zaai de HUVEC's op gelatine-gecoate glazen deksels geplaatst in de putjes van 24-wels kweekplaten zoals eerder.
Transfecteer de cellen met 3-kleurig gelabeld miR/PEI/MNP en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent koolstofdioxide. Was de deksels eerst met twee procent bovien serumalbumine en fosfaatgebufferde zoutoplossing, en vervolgens met alleen PBS. Fixeer de cellen door incubatie in vier procent paraformaldehyde of PFA bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Was met PBS en kleed vervolgens de kernen met DAPI volgens standaardprotocollen. Was vervolgens de cellen met PBS drie keer 15 minuten op de shaker om overtollig kleurstof te verwijderen. Plaats de voorbereide deksels op microscoopglaasjes met behulp van geschikt montagemedium en laat de dia's minimaal een uur drogen voordat u ze gebruikt voor microscopie.
Verkrijg afbeeldingen met behulp van een 63 keer olie-immersie objectief in de SIM-instellingen zoals gevonden in het tekstprotocol. Voor celtargeting en gesimuleerde dynamische omstandigheden in vitro, transfecteer eerst de HUVEC's in 24-welsplaat zoals eerder. Na incubatie gedurende 24 uur, was de cellen.
Voeg vervolgens een x trips in EDTA verdund in PBS toe en incubeer de cellen gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius voordat u de cellen verzamelt. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 300 keer G gedurende 10 minuten. Meng de celpellet verkregen uit één put met één milliliter vers kweekmedium.
En breng de cellen over naar een enkele put van een 12-welsplaat. Bevestig lokaal een kleine magneet met tape. Plaats de kweekplaat op de shaker en incubeer de celsuspensie gedurende 12 uur bij 150 RPM om dynamische omstandigheden te simuleren.
Was vervolgens de cellen en fixeer ze met vier procent PFA. Kleed de kernen met DAPI. Neem de celaanhechting op met laserscanning confocale microscopie met 405 en 504 teen-nanometer excitatielasers in z-stack-modus om de ruwe gegevens te verkrijgen.
Gebruik maximale intensiteitsprojectie-beeldverwerking om afbeeldingen voor analyse te maken. Voor kwantitatieve analyse van magnetisch responsief en niet-responsief cellen, transfecteer eerst de HUVEC's in een 24-welsplaat. Incubeer de cellen gedurende 24 uur voordat u ze wast en verzamelt zoals eerder beschreven.
Re-suspendeer het celpellet verkregen uit elke put met 500 microliter verwarmde steriele cel-sorteerbuffer. Breng de celsuspensie aan op een magnetische sorteerkolom die wordt vastgehouden door de meegeleverde magneet. Was vervolgens de kolommen op de magneet drie keer met verse cel-sorteerbuffer.
Verzamel de doorstroming als de magnetisch niet-responsief fractie. Verwijder de kolommen van de magneet en verzamel onmiddellijk de magnetisch responsief celfractie door vers cel-sorteerbuffer door de kolom te duwen met behulp van een plunjer. Centrifugeer zowel Mag-als Mag+fracties bij 300 keer G gedurende 10 minuten.
Na re-suspendering van het celpellet in PBS, tel de cellen en evalueer celviabiliteit met een trypanblauw exclusie-assay. Geïsoleerd uit navelstrengkoorden, worden HUVEC's gekenmerkt door de expressie van de endotheliale marker CD31 en door de vorming van buizen op een basement membraanmatrix. HUVEC's getransfecteerd met miR/PEI/MNP nemen allemaal getagd miR op.
En hun overleving blijft onaangetast 24 uur na transfectie. Bovendien toont superresolutiemicroscopie paranucleaire lokalisatie van 3-kleurig gelabelde transfectiecomplexen. PEI-toxiciteit wordt bevestigd door de verminderde functionaliteit van miR/PEI getransfecteerde cellen.
Belangrijk is dat MNP celeigenschappen herstelt. miR/PEI/MNP gemodificeerde cellen verschillen niet van onbehandelde cellen in termen van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript introduceert een techniek voor de efficiënte, niet-virale aflevering van microRNA naar endotheelcellen, met behulp van een PEI/MNP-vector voor magnetisatie. Deze methode verbetert genetische modificatie en maakt magnetische celaanvoering en MRI-detectabiliteit mogelijk, waardoor uitdagingen in regeneratieve geneeskunde worden aangepakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Regeneratieve geneeskunde
- Celtherapie
- Genetische techniek
Achtergrond
- Celtherapie is veelbelovend voor de behandeling van hartziekten.
- Het verbeteren van celretentie en overleving is cruciaal.
- MicroRNA-modificatie kan de therapeutische werkzaamheid verbeteren.
- Magnetisatie helpt bij gerichte celaflevering.
Doel van het onderzoek
- Om een methode voor microRNA-aflevering en celaanvoering te introduceren.
- Om celretentie op doelwitten te verbeteren met behulp van magnetische velden.
- Om uitdagingen bij celoverleving en retentie tijdens transplantatie aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Nicht-virale aflevering van microRNA met behulp van een PEI/MNP-vector.
- Magnetisatie van endotheelcellen voor begeleiding.
- Toepassing van magnetische velden om celretentie te verbeteren.
- Evaluatie van de efficiëntie van genetische modificatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle aflevering van microRNA naar endotheelcellen.
- Effectieve magnetisatie van cellen voor MRI-detectabiliteit.
- Verbeterde kenmerken van therapeutische celproducten.
- Mogelijkheid voor verbeterde resultaten van celtherapie.
Conclusies
- De techniek biedt een nieuwe benadering voor celaanpassing.
- Magnetische begeleiding kan de therapeutische werkzaamheid aanzienlijk verbeteren.
- Deze methode behandelt sleuteluitdagingen in regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses critical bottlenecks in cell therapy by enabling transient microRNA delivery and simultaneous magnetization of endothelial cells, improving genetic modification efficiency and post-transplant cell retention. The approach supports predictive confidence in therapeutic cell product design by combining genetic engineering with non-invasive MRI tracking and magnetic targeting capabilities. It provides a scalable, non-viral platform for de-risking cell-based interventions in cardiovascular regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of microRNA mechanisms in endothelial cells without compromising viability or intercellular communication.
- Operational Value: Provides a reproducible method for transient gene modulation to validate therapeutic targets in vascular biology.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking miR overexpression to functional outcomes in tube formation and gap junctional communication.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates magnetically sortable cell populations for quantitative analysis of transfection efficiency and phenotypic response.
- Operational Value: Standardizes cell preparation for downstream assays using defined transfection complex ratios and incubation timelines.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across cell types through modular PEI/MNP vector design and magnetic separation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains endothelial functionality post-modification, supporting disease-relevant modeling of vascular repair and angiogenesis.
- Preclinical Continuity: Enables MRI tracking and magnetic guidance in simulated dynamic conditions, bridging in vitro findings to in vivo delivery studies.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by confirming that magnetization does not impair tube formation or gap junctional coupling.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying genetically engineered, magnetically responsive endothelial cells for target validation and assay development, with direct translational relevance to preclinical cell therapy optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled miR delivery and phenotypic readouts in tube formation and intercellular communication assays.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable magnetic responsiveness for standardized compound or genetic modifier screening.
- Analytics: Enables quantitative separation of transfected and non-transfected fractions using magnetic sorting, improving data precision in flow-through and retained cell analysis.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by allowing non-invasive MRI tracing and magnetic targeting in perfusion-like conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transfection and magnetization platform adaptable to other primary cell types for vascular and regenerative applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through combined genetic and functional modulation of endothelial cells.
- Operational Value: Standardization of transfection efficiency and reproducibility via defined PEI/miR/MNP ratios and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage failure risks associated with poor cell retention and transient engraftment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell therapy candidates through traceable, functionally validated cellular products.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid transfection, nanoparticle handling, and fluorescence microscopy for validation.
- Depends on access to sonication equipment, magnetic separation columns, and confocal/SIM imaging systems.
- Necessitates standardization of cell seeding density (13,000 cells/cm²) and transfection complex preparation across laboratories.
- Involves adaptation considerations for varying endothelial or progenitor cell types regarding transfection efficiency and magnetic responsiveness.
- Includes practical limitations such as the need to optimize miR dosage and PEI concentration to minimize cytotoxicity while maintaining magnetization.
