Name: Nieuwe test voor Cold Nociceptie in Drosophila Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Leer een nieuwe test voor koude nociceptie in Drosophila larven met een Peltier-probe. Deze methode kwantificeert koud-geïnduceerde gedragingen en helpt bij het identificeren van genen betrokken bij pijnperceptie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Sarah Wu en Camille Graham voor de ontwikkeling van de vroege stadia van de koude probe assay, de Bloomington Drosophila Stock Center for fly voorraden en Galko lab leden voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH NRSA (NIH F31NS083306) naar HNT, en door het NIH R01NS069828, R21NS087360 en een Universiteit van Texas MD Anderson Clark Fellowship in Basic Research naar MJG.

1. Bereiding van Larven <ol><li> Verhogen bestanden of genetisch kruisen in een 25 ° C incubator. <ol><li> Als het kweken van een kruis, gebruiken 20-25 maagdelijke vrouwtjes en 15-20 mannen per flacon met regelmatige maïsmeel fly media. Toestaan ​​vrouwtjes eieren gedurende ongeveer 48 uur alvorens hen naar een nieuw buisje voedsel. </li></ol></li><li> 4-5 dagen na eieren leggen, verzamel 3e instar larven van het gewenste genotype door voorzichtig spuiten van een waterstroom in de slappe eten en larven, en giet de inhoud in een middelgroot, schone petrischaal (60 mm x 15 mm). </li><li> Vervolgens zachtjes larven sorteren op grootte behulp van een tang of een penseel grotere &quot;zwervende 3 e instar&quot; of kleine ziekelijk larven belet wordt getest. Ontdoen larven die ongewenste genetische merkers of balanceerelementen. </li><li> Heeft u een collega-lab lid label gerechten of containers waarin naargelang larven zal worden geplaatst, zodat de experimentator &quot;blind&quot; kan zijn om de experimental conditie of genotype van de larven, indien van toepassing. De experimentator kan gedecodeerde labels van toepassing op de verzamelde gegevens na het experiment met behulp van een sleutel gegenereerd door een lab-lid. </li><li> Gebruik een scoopula overdragen dime een kleine hoeveelheid verse levensmiddelen in een (35 mm x 10 mm of 60 mm x 15 mm) schoon, gelabeld petrischaal gevuld halverwege met water op kamertemperatuur. </li><li> Beweeg de gesorteerde larven op het voedsel (uithongering en uitdroging te voorkomen als testen verwachting meer dan 20 minuten duren) behulp van een tang of kwast. </li></ol> 2. Cold Probe Assay <ol><li> Schakel de koude sonde eenheid waardoor enkele minuten voor te koelen tot de gewenste temperatuur. Als instelling lagere temperaturen condensatie waarschijnlijk gevormd langs de sonde. </li><li> Veeg overtollig vocht af met een laboratorium vegen voordat deze op de larve. Wanneer niet in onmiddellijk gebruik, plaats isolatiekapje op de probe zowel isoleren en de punt schoon te houden en te voorkomen. </li><li> Plaats een mid 3e instar larven op een dun stukje donkere beweegbare vinyl (gewoonlijk met een kleine stukje gesneden uit een notitieboekjemultomap) onder een helderveld microscoop. De zwarte vinyl helpt bij contrast visualisatie en bewegen van de larve zonder te raken om goed uit te lijnen met de probe. </li><li> Stel de microscoop (zie tabel of Materials) en de verlichtingseenheid (zie tabel of Materials) tot gemiddelde helderheid (50-75% helderheid max) om het contrast te verschaffen en te voorkomen dat de larve uitdrogen te snel. </li><li> Gooi alle larven die niet eerst de normale peristaltische beweging vertonen omdat ze de resultaten kunnen verwarren. De larven moet vochtig worden uit de petrischaal van water anders de larve zal vasthouden aan het vinyl remmende normale voortbeweging. Water moet niet plas rond de larve. </li><li> Schuif de sonde handmatig naar de larve op een 90 ° hoek met de achterwaartse lichaamsas, met de platen naar de larve in cor verplaatsenrect positie (zie figuur 1A). </li><li> Plaats de punt van de sonde voorzichtig leggen over het midden dorsale oppervlak van de larve met de sonde ongeveer 45 ° hoek met de microscoop podium. </li><li> Bij sonde contact, start een laboratorium timer. Breng voldoende neerwaartse druk enigszins inspringen het oppervlak van het larvale cuticula terwijl voorwaartse of achterwaartse beweging mogelijk. </li><li> Houd de sonde in plaats maximaal 10 seconden of totdat een koude opgewekte gedragsreactie waargenomen - wat het eerste optreedt. verwijder de sonde. </li><li> Noteer de waargenomen gedrags-respons en de respons latency. Larven die niet reageren binnen 10 s worden beschouwd als &quot;non-responders&quot;. Latentie kan worden opgenomen responders en gebruikt om veranderingen in reactie robuustheid / amplitude te meten. </li><li> Gooi larve en de voorbereiding van de volgende. </li><li> Herhaal stap 2,3-2,11 totdat het gewenste aantal larven-test is bereikt (drie reeksen n = 20-40 larven waren used hier). </li></ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).</li>
<li>Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+tetanus+toxin+light+chain+in+Drosophila+specifically+eliminates+synaptic+transmission+and+causes+behavioral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects.</a> Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).</li>
<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li>
<li>Im, S. H., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pokes%2C+sunburn%2C+and+hot+sauce%3A+Drosophila+as+an+emerging+model+for+the+biology+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception.</a> Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).</li>
<li>Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+tool+for+studying+the+conserved+genetics+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain.</a> Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).</li>
<li>Turner, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRP+Channels+Pkd2%2C+NompC%2C+and+Trpm+Act+in+Cold-Sensing+Neurons+to+Mediate+Unique+Aversive+Behaviors+to+Noxious+Cold+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).</li>
<li>Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+filopodia%2C+Ripped+Pocket%2C+NOMPC%2C+and+NMDARs+contribute+to+the+sense+of+touch+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).</li>
<li>Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
<li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (63), e3837(2012).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).</li>
<li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pickpocket+is+a+DEG%2FENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li>
<li>Neely, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrpA1+regulates+thermal+nociception+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (8), e24343(2011).</li>
<li>Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+directional+change+after+mechanical+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila.</a> Mol Brain. 5, 39(2012).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> Elife. 4, e10735(2015).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li>
<li>Berrigan, D., Pepin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/002219109400113U">How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera.</a> J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).</li>
<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+discovery+of+targets+and+anti-targets+for+cancer+polypharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology.</a> Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Gill, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistate+life-tables+and+regression+models%5BTitle%5D)+AND+%22Math+Popul+Stud%22%5BJournal%5D)">Multistate life-tables and regression models.</a> Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).</li>
<li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ranking+procedures+for+arbitrarily+restricted+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Ranking procedures for arbitrarily restricted observation.</a> Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).</li>
<li>Breslow, N. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2334776?seq=1#page_scan_tab_contents">A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship.</a> Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).</li>
<li>Gehan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+wilcoxon+test+for+comparing+arbitrarily+singly-censored+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrika%22%5BJournal%5D)">A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples.</a> Biometrika. 52, 203-223 (1965).</li>
</ol>

Een Amerikaanse octrooiaanvrage (CL) wordt in afwachting op het ontwerp van de koude sonde. Bijkomende informatie over de details van de koude sonde onderdeelnummers en de bouw, evenals extra advies over het hulpmiddel ontwerp zal worden verstrekt op aanvraag.

De hier beschreven test kan worden gebruikt om nociceptie of nociceptieve sensibilisatie kwalitatief en kwantitatief beoordelen larven van verschillende genetische achtergronden, omgevingsinvloeden en / of beschadiging geïnduceerde omstandigheden. Aangezien deze test maakt voor focale toepassing van een koude stimulus, dit gereedschap kan men de functie van een subset van perifere sensorische neuronen evalueren specifiek reageren op lage temperaturen. Interessant is dat deze koud opgewekte gedrag lijken verschillende kl...

Drosophila heeft bewezen zeer nuttig voor de identificatie van nieuwe geconserveerde genen en neuronale circuits die complexe gedrag ten grondslag liggen zijn. Vliegen te verfijnde genetische toolkit en een vereenvoudigd zenuwstelsel waarmee nauwkeurige genetische manipulatie en neuronale 1, 2, 3, 4 om de cellulaire en moleculaire basis van nociceptie 5, 6, 7 ontleden. Larven zijn bijzonder bruikbaar voor deze analyses, aangezien behavioral tests voor zachte aanraking 8, 9, 10, schadelijke warmte 11, 12, 13 en mechanische sensatie van schadelijke stimuli 4, </sup&gt; 11 zijn reeds vastgesteld, en de transparante larvale cuticula maakt levende of vaste beeldvorming van de onderliggende epidermis en sensorische neuronen. Onlangs is een test voor schadelijke koud is ook ontwikkeld 7, die we in meer detail beschrijven hier. Met een fijne, conisch getipt koude probe wordt aangetoond dat vertonen Drosophila larven een aantal koude-specifieke reactieve gedrag, verschillend van gedragingen die tijdens normaal voortbewegen, na zachte aanraking, of na zware mechanische of hoge temperatuur stimuli 7, 8, 11 . De koude-specifieke gedragingen, zoals een robuust full-body contractie (CT), een 45-90º verhoging van de achterste segmenten (PR) en een gelijktijdige verhoging van de voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US). De prevalentie van deze gedragingen toeneemt met afnemende temperatuur, maar elke pieken bij slichtjes verschillende koude temperaturen. Recent onderzoek suggereert dat CT responsen gemedieerd door verschillende perifere sensorische neuronen dan die reageren op schadelijke warmte of agressieve mechanische stimuli 7. Net als nociceptoren vertebraat, Drosophila meerdere dendritische (md) perifere sensorische neuronen complexe dendritische structuren die arborize via epidermis 1. md neuronen aanwezig in alle larvale lichaamssegment, projecteren de axonen op de ventrale zenuwkoord 14. md sensorische neuronen worden gescheiden in vier verschillende klassen (I-IV) op basis van dendritische morfologie en hebben verschillende gevoelsfuncties 4, 9, 10, 15, 16, 17. En klasse IV neuronen vereist larven zijdelingse rolbewegingen reactieshoge temperaturen of zware mechanische stimuli 4, klasse III neuronen vereist voor zachte aanraking reacties 9, 10 en worden niet alleen geactiveerd door koude, maar ook vereist voor de koude opgewekte gedragsreacties 7. Zowel klasse III en klasse IV neuronen gebruiken discrete transient receptor potential (TRP) kanalen gedragsreacties aan schadelijke 7, 11, 18 en onschadelijke stimuli 9, 10, 17, 19 te vergemakkelijken. Verder wordt larvale nociceptie gesensibiliseerd volgende blessure, op het cellulaire 20 en gedragsmatige niveaus 12, 21. De hier beschreven test maakt de quantification hetzij normaal of potentieel veranderd gedragsreacties op koude temperaturen van schadelijke koude (≤ 10 ° C), onschadelijke koel (11-17 ° C), bij omgevingstemperatuur (18-22 ° C). De koude temperaturen die in deze assay die direct activeren III sensorische neuronen, uitlokken robuust, reproduceerbaar calcium verhoogt en koud opgewekte gedragsreacties, die kwalitatief en kwantitatief kan worden geanalyseerd 7. Deze test kan worden toegepast op larven van vrijwel elke genotype en larven blootgesteld aan verschillende omgevingsomstandigheden (veranderde voeding, verwonding, farmacologische middelen) zowel genetische en omgevingsfactoren die invloed koude nociceptie, nociceptieve sensibilisatie of nociceptieve plasticiteit bepalen. Aangezien thermosensation alomtegenwoordig in vele soorten, deze test een waardevol hulpmiddel voor de studie van nociceptie en kunnen nieuw gen doelen of neuronale interacties verbetert ontdekkenons begrip van gewervelde nociceptie. De op maat gemaakte koude probe (zie koude sonde, Table of Materials) gebruikt een gesloten lus geïsoleerde Peltier-inrichting, waarbij de aluminium schacht en conische punt met warmtegeleiding afkoelt. Een thermistor is ingebed in het aluminium kegelpunt meldt de real-time temperatuur op de bedieningseenheid. Een koelelement en de ventilator zijn verbonden aan de thermo-module warmtebelasting het Peltier effect is (Qc) zodat het gewenste temperatuurbereik van (22-0 ° C) worden bereikt regelen (zie Thermal regeleenheid, tabel of Materials). De schadelijke stimulus koude van de sondepunt koude wordt handmatig aangebracht op de dorsale middellijn, om segment (en) op gelijke afstand van voorste en achterste einden (ruwweg segment A4, zie Figuur 1A) van de larve. In reactie op koude stimuli, larven produceren in het algemeen een van de drie koude opgewekte gedrag binnen een 10 s cutoff: een full bodycontractie (CT), een 45-90º verhoging van voorste en achterste segmenten in een U-vorm (US) of een verhoging van het achterste segmenten (PR) (Results beschreven). Geen van deze gedragingen worden uitgevoerd tijdens de normale peristaltische beweging of foerageergedrag. Dit gedrag ook verschillend van zachte aanraking reacties en de rollen aversieve respons op hoge temperaturen of schadelijke mechanische stimuli.

<table><tbody><tr><td>Cold Probe</td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>Op bestelling speciaal gemaakt</td><td>Artikelnummers en bouwdetails kunnen op aanvraag worden verstrekt</td></tr><tr><td>Thermal Control Unit</td><td>TE Technology</td><td>Op bestelling gebouwde behuizing</td><td>Artikelnummers en bouwdetails kunnen op aanvraag worden verstrekt</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000 microscoop</td><td>Zeiss</td><td>NT55-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator</td><td>Dolan-Jenner Industries.</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide</td><td>Schott North America, Inc.</td><td>Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>FST</td><td>FS-1670</td><td>Wordt gebruikt om larven te sorteren en te hanteren. Zorg ervoor dat de punten van het pincet enigszins glad en stomp zijn om het risico op het per ongeluk puncteren of verwonden van de larven te verminderen</td></tr><tr><td>Schilderskwast</td><td>Dick Blick Art Materials</td><td>06762-1002</td><td>Wordt gebruikt om larven te sorteren en te hanteren. Het is handig als de schilderskwast tijdens gebruik vochtig is.</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Polystyreen Petri-schaaltje</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 10 mm Polystyreen Petri-schaaltje</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Stuk zwart vinyl (minstens 2 inch x 2 inch)</td><td></td><td></td><td>Wordt gebruikt om contrast te bieden en larven op de koude sonde te oriënteren</td></tr><tr><td>Fisherbrand Scoopula Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>Wordt gebruikt om voedsel te verplaatsen</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Wordt gebruikt om de larven en de koude sonde te drogen als er overtollig vocht is</td></tr></tbody></table>

nieuwe test voor cold nociceptie in<em&gt; drosophila</em&gt; larven

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Hoe organismen voelen en te reageren op schadelijke temperaturen is nog steeds slecht begrepen. Verder zijn de onderliggende mechanismen sensibilisatie van de sensorische machines, zoals bij patiënten met perifere neuropathie of letsel geïnduceerde sensibilisatie, zijn niet goed gekarakteriseerd. De genetisch handelbaar Drosophila model is gebruikt om de cellen en genen die nodig zijn voor schadelijke tochtdetectie bestuderen die meerdere geconserveerde genen van belang heeft opgeleverd. Weinig is echter bekend over de cellen en receptoren belangrijk voor schadelijke koud detectie. Hoewel, Drosophila langdurige blootstelling aan koude temperaturen (≤10 ºC) niet overleeft, en wordt voorkomen dat cool, liever warmere temperaturen in behavioral voorkeur assays, hoe ze aanvoelen en eventueel te voorkomen schadelijke koude stimuli is pas sinds kort onderzocht. Hier beschrijven wij en karakteriseren de eerste schadelijke koud (≤10 ºC) behavioral test inDrosophila. Met behulp van deze tool en assay tonen we een onderzoeker hoe koud nociceptieve gedrag kwalitatief en kwantitatief te beoordelen. Dit kan gedaan worden onder normale / gezonde kweekomstandigheden, of vermoedelijk in het kader van ziekte, verwonding of sensibilisatie. Verder kan deze bepaling worden toegepast op larven geselecteerd voor gewenste genotypes, wat kan beïnvloeden thermosensation, pijn of nociceptieve sensibilisatie. Aangezien pijn een sterk behouden proces met behulp van deze bepaling voor verdere studie thermische nociceptie waarschijnlijk vergaren belangrijke inzicht pijn processen in andere soorten, waaronder vertebraten.

Drosophila larven bewegen met een peristaltische beweging die incidenteel pauzes, hoofd bochten en richtingsveranderingen 22 omvat. In reactie op focale toepassing van een schadelijke stimulus koude vertonen echter larven een reeks unieke gedrag, in tegenstelling tot de aversieve laterale rol op pijnlijke hitte en mechanische stimuli. Dit gedrag ook verschillend van reacties op zachte aanraking 8, ...

Hier laten we zien een nieuwe test om koude nociceptie in Drosophila larven te bestuderen. Deze test maakt gebruik van een op maat gemaakte Peltier probe kunnen toepassen middelpunt schadelijke stimulus koude en resulteert in meetbare koud-specifiek gedrag. Deze techniek zal verder cellulaire en moleculaire dissectie van koude nociceptie mogelijk te maken.

Nieuwe test voor Cold Nociceptie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Het algemene doel van deze assay voor schadelijke kou is om veranderingen in de detectie van onschadelijke tot schadelijke kou te kunnen kwantificeren en beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de nociceptie, waaronder het faciliteren van de identificatie van nieuwe, geconserveerde genen voor koude-nociceptie en modulatoren van pijnresponsen bij ziekte en/of letsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een precieze manipulatie van de schadelijke koudeprikkel en kwantificering van door kou opgewekte responsen mogelijk maakt over een verscheidenheid aan omgevings- en genetische contexten.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode oefenen met de consistente toepassing van de probe voordat ze aan een experiment beginnen. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ontdekten dat drosophila-larven reageren op schadelige hitte en we nieuwsgierig werden of ze hetzelfde doen bij schadelijke kou. Kweek stammen of genetische kruisingen van drosophila in een incubator van 25 °C.Let op: gebruik bij het kweken van een kruising 20 tot 25 maagdelijke vrouwtjes en 15 tot 20 mannetjes per flacon met reguliere maïsmeel-vliegmedia en kweek deze gedurende ongeveer 48 uur voordat de vliegen naar een nieuwe flacon met voedsel worden overgebracht. Vijf dagen nadat de kweek is gestart, worden derdestadiumlarven van het gewenste genotype verzameld door voorzichtig een straal water in het zachte voedsel en de larven te spuiten. Giet vervolgens de inhoud in een middelgrote, schone Petrischaal.Sorteer vervolgens voorzichtig de larven op grootte en gebruik een pincet om te voorkomen dat grotere, ronddwalende derde-instar larven of kleine, zieke larven worden getest. Verwijder larven die ongewenste genetische markers of balancers bevatten. Laat een ander laboratoriumlid de containers labelen waarin de gesorteerde larven worden geplaatst, zodat de experimentator blind blijft voor de experimentele conditie of het genotype van de larven.Gebruik een scoopula om een kleine hoeveelheid vers voedsel over te brengen naar een schone, gelabelde Petrischaal die halverwege is gevuld met water op kamertemperatuur. Gebruik ten slotte een pincet om de gesorteerde larven voorzichtig op het voedsel te plaatsen om uithongering of uitdroging te voorkomen, indien wordt verwacht dat het testen langer dan 20 minuten zal duren. Begin met het inschakelen van de koude probe-eenheid en laat deze enkele minuten afkoelen tot de gewenste temperatuur.Veeg eventueel overtollig vocht van de probe af met een laboratoriumdoekje. Wanneer de probe niet onmiddellijk wordt gebruikt, plaatst u een isolatiekapje op de probe om deze te isoleren, de punt schoon te houden en schade te voorkomen. Plaats vervolgens een larve in het midden van het derde instarstadium op een dun stukje donker, beweegbaar vinyl om het contrast bij de visualisatie te verbeteren en de probe correct uit te lijnen.Plaats vervolgens dit stuk vinyl met de larve onder een lichtveldmicroscoop. Stel de microscoop en de lichtbron in op een gemiddelde helderheid om contrast te bieden en te voorkomen dat de larve te snel uitdroogt. Zorg er met een vochtige penseel voor dat de larve vochtig is met water uit de petrischaal, zodat deze niet aan het vinyl blijft plakken, en verwijder eventueel overtollig water eromheen met een KimWipe.Beweeg de probe handmatig naar de larve toe in een hoek van 90 graden ten opzichte van de anteroposterieure lichaamsas, waarbij het vinyl wordt gebruikt om de larve in de juiste positie te brengen. Richt de punt van de probe vervolgens zo dat deze voorzichtig op het midden-dorsale oppervlak van de larve rust, met de probe onder een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van de microscooptafel. Start een timer zodra de probe contact maakt.Oefen voldoende neerwaartse druk uit om het oppervlak van de larvale cuticula licht in te drukken, terwijl voorwaartse of achterwaartse beweging nog steeds mogelijk blijft. Houd vervolgens de probe maximaal 10 seconden op zijn plaats of totdat er een door kou opgewekte gedragsreactie wordt waargenomen, afhankelijk van wat het eerst gebeurt. Verwijder daarna de probe.Noteer de waargenomen gedragsreactie en de latentietijd van de reactie. Houd rekening met eventuele non-responders of larven die niet binnen 10 seconden reageren. Verwijder ten slotte de larve en bereid de volgende voor.Herhaal de procedure totdat het gewenste aantal testlarven is bereikt. Na contact met de koude probe geven de resultaten van dit experiment aan dat de larven reageren met de volgende door koude opgewekte gedragingen: het samentrekken van hun anterieure en posterieure segmenten richting het centrum van hun lichaam in een contractie, CT; het optillen van hun anterieure en posterieure segmenten in de lucht om een U-vorm te vormen, US; en het uitsluitend optillen van de posterieure segmenten in de lucht, PR. Bovendien pieken verschillende gedragingen bij variërende koudebereiken, zodanig dat PR en US pieken bij drie tot acht graden Celsius, terwijl CT piekt rond negen tot 14 graden Celsius. Ten slotte laten deze gegevens bij het vergelijken van de latenties van de verschillende koudegedragingen zien dat CT-responsen significant verschilden van PR en US bij drie graden Celsius en 10 graden Celsius, en van US bij 20 graden Celsius.Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer 30 tot 40 minuten worden voltooid voor één set van 30 larven. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alert te zijn op abnormale voortbeweging, het vochtigheidsgehalte van de larve en de druk en plaatsing van de koudeprobe op de larve. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien onjuiste toepassing van de koudeprobe kan leiden tot verschillende dosis-responscurves of een gebrek aan koudresponsgedrag.Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals fluorescentie-beeldvorming, genexpressieanalyse en gedragsassays. Al deze methoden zullen bepalen hoe blootstelling aan kou de cellulaire activiteit, morfologie, genexpressie of andere gedragingen beïnvloedt. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van koude-nociceptie om de genetische, omgevingsgebonden en ziekte-effecten bij drosophila te bestuderen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het gebruik van de cold probe-tool en de bijbehorende assay om door koude opgewekte responsen te analyseren en de cellulaire en genetische mechanismen van koude nociceptie te begrijpen.

novel-assay-for-cold-nociception-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

In dit artikel tonen we aan testen van thermische nociceptie studeren...

Lokale en globale methoden voor de beoordeling Thermische Nociceptie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Drosophila-larven hebben speciale sensorische neuronen - nociceptoren - waarvan de reactie op potentieel schadelijke thermische stimuli aversief - of zogenaamd "nocifensief" - gedrag bij het dier veroorzaakt. Deze video beschrijft een methode om thermische nociceptie te beoordelen door larvaal gedrag op te nemen als reactie op lokale toepassing van een warmtesonde op de cuticula. Deze methode wordt daarom de lokale hittesondetest genoemd.

Lokale hittesondetest: een methode om nociceptie van hoge temperaturen bij Drosophila-larven te beoordelen

In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster.

A Single-fly test voor foerageergedrag in Drosophila

De niveaus van het ontstekingssignaalmolecuul stikstofmonoxide (NO) worden gewoonlijk gemeten met behulp van Griess reagens. In dit protocol hebben we een aangepaste Griess-test gemaakt die gebruik maakt van levend Drosophila hersenweefsel om de afscheiding van NO op een eenvoudige, meetbare en zeer herhaalbare manier te detecteren.

Nieuwe kwantitatieve analyse van het gehele weefsel van stikstofmonoxideniveaus bij de Drosophila neuro-inflammatoire respons

Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.

Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een verbeterde test voor mechanische nociceptie in Drosophila-larven kan worden uitgevoerd. We gebruiken de test hier om aan te tonen dat mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) bestaat in Drosophila-larven.

Een verbeterde test en tools voor het meten van mechanische nociceptie in Drosophila-larven

Dit artikel presenteert methoden voor optogenetische manipulatie in Drosophila melanogaster, waarbij CsChrimson en GtACR2 worden gebruikt om specifieke neuronen te activeren en tot zwijgen te brengen. Er worden vier experimenten beschreven om optogenetica te gebruiken om thermotactisch en smaakgedrag te onderzoeken, en inzicht te geven in de onderliggende neurale mechanismen die deze processen beheersen.

Gedragstesten voor optogenetische manipulatie van neurale circuits in Drosophila melanogaster

Een methode om immunostain en chordotonal organen te visualiseren in de larven en poppen...

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Drosophila larven zijn in staat om geur stimuli associëren met smaak beloning. Hier beschrijven we een eenvoudige gedragsmatige paradigma dat de analyse van appetitieve associatief olfactorische leren mogelijk maakt.

Appetitieve Associatieve Olfactorische Learning in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Leer een nieuwe test voor koude nociceptie in Drosophila larven met een Peltier-probe. Deze methode kwantificeert koud-geïnduceerde gedragingen en helpt bij het identificeren van genen betrokken bij pijnperceptie.

Nieuwe test voor Cold Nociceptie in

Meer video's verkennen