Recombinant Proteïne Expressie, Kristallisatie en Biofysische Studies van a Bacillus -conserveerd nucleotide pyrophosphorylase, BcMazG

Het algemene doel van deze procedure is om recombinant eiwit uit niet-pathogene bacteriën te bereiden om biofysische chemische studies zoals eiwit röntgenkristallografie of enzymatische kinetiek te vergemakkelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe recombinant eiwit van belang kan worden bereid met behulp van niet-pathogene bacteriën voor voorlopige biofysische karakterisering. Het grote voordeel van deze techniek is dat biofysische karakterisering voor eiwit van belang kan worden uitgevoerd in elk laboratorium dat is uitgerust met gangbare instrumenten zoals celkweekincubators en spectrofotometers.

Om deze procedure te starten, bereid de ligatiereactie voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Pipetteer drie microliter van de bereide ligatiereactie in een buis met 50 microliter chemisch competente E.coli DH5 alpha cellen. Meng de oplossing voorzichtig met een pipet.

Plaats de oplossing 30 minuten in het ijs. Vervolgens schok de oplossing gedurende 45 seconden bij 42 graden Celsius. Voeg daarna een milliliter LB-medium toe en kweek de cellen onder krachtig schudden bij 250 omwentelingen per minuut, 37 graden Celsius gedurende 45 minuten.

Spreid 100 microliter van de getransformeerde cellen op een LB-augerplaat aangevuld met 100 microgram per milliliter kanamycine. Incubeer 18 uur bij 37 graden Celsius. Gebruik een steriele punt om kolonies van de plaat te plukken.

Laat de cellen groeien in drie milliliter aangevuld LB-medium met krachtig schudden bij 250 omwentelingen per minuut, 18 graden Celsius gedurende 18 uur. Bereid vervolgens plasma-DNA en bevestig de nucleotidesequentie zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het opnieuw transformeren van de E.coli BL21-stam, selecteer een kolonie met een steriele punt en inoculeer 10 milliliter LB-medium met 150 microgram per milliliter kanamycine.

Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 18 uur met krachtig schudden bij 250 omwentelingen per minuut. Breng vervolgens de 10 milliliter overnachtkweek over in één liter LB-medium met kanamycine. Laat groeien bij 37 graden Celsius tot de optische dichtheid bij 600 nanometer 0,7 bereikt.

Dompel de kweek vervolgens 15 minuten in ijs koud water. Voeg IPTG toe aan de kweek, zodat de uiteindelijke concentratie één millimolair is. Incubeer bij 18 graden Celsius gedurende nog eens 16 tot 18 uur.

Centrifugeer daarna bij 5.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig de supernatant. Resuspendeer de cellen in 50 microliter PBS met 10 millimolair imidazool.

Lyseer de cellen vervolgens twee keer op ijs zoals beschreven in het tekstprotocol. Centrifugeer bij 25.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om het cellysaat te verduidelijken. Meng vervolgens drie milliliter nikkelkralen en 47 milliliter PBS met 10 millimolair imidazool in een 50 milliliter conische buis.

Laat de extra buffer door zwaartekracht stromen om de geëquilibreerde kralen in een 2,5 bij 10 centimeter glazen chromatografiekolom te laten bezinken. Breng met behulp van een pipet het supernatant over naar de kolom. Incubeer bij vier graden Celsius gedurende twee uur op een draaitafel bij 20 omwentelingen per minuut.

Laat daarna het supernatant door zwaartekracht weglopen. Was de nikkelkralen drie keer met 100 milliliter PBS met 10 millimolair imidazool voor elke wassing. Breng vervolgens vijf milliliter PBS met 250 millimolair imidazool aan om het RBC 1531-eiwit te elueren.

Analyseer 15 microliter van de elutie via SDS-pagina zoals beschreven in het tekstprotocol. Pipetteer de verzamelde fracties in een dialysebuis. Plaats de buis in een beker met vier liter trombine-splitsingscompatible buffer bij vier graden Celsius voor een nacht.

De volgende dag gebruikt u een pipet om de fracties over te brengen naar een 15 milliliter conische buis. Meet de absorptie bij 280 nanometer om de eiwitconcentratie te schatten zoals beschreven in het tekstprotocol. Breng vervolgens 50 microliter RBC 1531-eiwit over naar verschillende buizen.

Voeg een verschillende hoeveelheid trombine toe aan elke buis en incubeer bij 20 graden Celsius gedurende drie uur. Na het bepalen van de minste hoeveelheid trombine die nodig is, voegt u 10 milligram eiwit en 60 eenheden trombine toe aan een 15 milliliter buis. Incubeer bij 20 graden Celsius gedurende drie uur.

Breng vervolgens het trombine-verterde eiwit over naar een centrifugeerfilterbuis. Centrifugeer bij 3.000 keer G bij vier graden Celsius om het volume te verminderen tot minder dan vijf milliliter. Breng vervolgens het geconcentreerde eiwit aan op een voorbereide kolom voor grootte-uitsluitingschromatografie.

Verzamel 60 elutiefracties met 0,5 milliliter per buis. Laat 15 microliter van elke fractie lopen op een 15% SDS-paginagel zoals beschreven in het tekstprotocol. Combineer vervolgens de fracties die het RBC 1531-eiwit bevatten.

Breng de gecombineerde fracties over naar een centrifugeerfilterbuis. Centrifugeer bij 3.000 keer G bij vier graden Celsius om het eiwit te concentreren tot ongeveer 18,5 milligram per milliliter. Voeg vervolgens 50 microliter van elke oplossing voor kristallisatiescreening toe aan de putjes van een 96-putjes zittende druppelkristallisatieplaat.

Voeg 0,5 microliter van de geconcentreerde eiwitoplossing toe op een zittend bed. Meng de eiwitoplossing afzonderlijk met 0,5 microliter van de putoplossing. Bedek de plaat met heldere zelfklevende film.

Incubeer bij 18 graden Celsius en laat de dampdiffusie toe. Scan de druppels met een lichtmicroscoop bij 20 tot 40 keer vergroting om de kristalvorming dagelijks gedurende twee tot drie weken te monitoren. Voeg na het bereiden van de NTP-substraten elk toe aan een 96-putjesplaat.

Voeg met behulp van een pipet 20 microgram RBC 1531-eiwit toe aan elke put om