Name: Voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei Factor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer de bereiding en karakterisering van HDL-nabootsende nanodeeltjes geladen met zenuwgroeifactor via eenvoudige homogenisatie. Deze schaalbare methode verbetert de insluitingsefficiëntie voor therapeutische toepassingen in de neurowetenschap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R03 NS087322-01 naar Dong, X.

OPMERKING: De dierstudies die bij alle procedures zijn opgenomen, zijn goedgekeurd door het Institusioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee aan de Universiteit van Noord-Texas Health Science Center. 1. Bereiding van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes <ol><li> Los de hulpstoffen, fosfatidylcholine (PC), sfingomyelin (SM), fosfatidylserine (PS), cholesteryloleaat (CO) en D-a-tocopherylpolyethyleenglycolsuccinaat (TPGS) op in ethanol om voorraadoplossingen op 1 mg / ml te bereiden. OPMERKING: De voorraadoplossingen werden geproduceerd en opgeslagen bij -20 ° C. Het cholesteryloleaat werd opgeslagen in donkere flessen. De PC-, SM-, PS- en CO-voorraadoplossingen waren stabiel gedurende respectievelijk 6, 3, 12 en 12 maanden bij -20 ° C. De TPGS-oplossing was gedurende ten minste 12 maanden stabiel bij -20 ° C. </li><li> Meng 10 μL NGF (1 mg / ml in water) met 10 μl protamine USP (1 mg / ml in water) in een 1,5 ml microcentrifugebuis en laat het gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur staan ​​totVorm het complex. OPMERKING: De NGF- en protamine-voorraadoplossingen werden gesalicoteerd en opgeslagen bij -20 ° C. Herhaalde bevriezing en ontdooien wordt niet aanbevolen voor de NGF-voorraad. </li><li> Voeg 59 μl PC, 11 μL SM, 4 μL PS, 15 μL CO en 45 μl TPGS toe aan een glazen flesje. Meng en verdamp de ethanol gedurende ongeveer 5 minuten onder een zachte stikstofstroom; Alle hulpstoffen dienen een vette dunne film aan de onderkant van de glazen flesje te vormen. </li><li> Voeg 1 ml ultraperfect (type 1) water toe aan de flesje en homogeniseer gedurende 5 minuten bij 9.500 rpm (8.600 xg) bij kamertemperatuur om de prototype NP&#39;s te vormen. </li><li> Voeg het in stap 1.2 bereide complex toe aan prototype NP&#39;s en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder roeren door gebruik te maken van een kleine roerbalk in de glazen flesje. <ol><li> Koel de NP&#39;s door nog een 30 minuten bij kamertemperatuur te roeren. Vervolgens voegt u 106 μl Apo AI (1,49 mg / ml) toe en roer bij kamertemperatuur &#39;s nachts om de laatste te vormenNGF HDL-nabootsende NP&#39;s. </li></ol></li></ol> 2. Karakterisering van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes <ol><li> Meet de deeltjesgrootte en zeta-potentieel met behulp van een deeltjesanalysator (zie de materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Gebruik een crosslinked agarosegelfiltreringskromatografiekolom om de geloste NGF van de NGF HDL-nabootsende NP&#39;s te scheiden en de entrapmentefficiëntie van de NGF te bepalen. <ol><li> Voor de kolombereiding, overdragen 15 ml Sepharose 4B-CL suspensie naar een beker van 50 ml. Roer de kraalvering met een glazen staaf en giet wat in een kolom (30 cm lengte × 1 cm diameter, met een glazen frituur onderaan). Tik voorzichtig op de kolom om bellen te ontdoen. Laat het oplosmiddel leeglopen en de kralen om een ​​paar minuten te vestigen. </li><li> Ga door met de resterende ophanging. Spoel de binnenmuur van de kolom om de kralen schoon te maken. Dreineer het oplosmiddel tot het oplosmiddelniveau een beetje a isBove de top van de stationaire fase. Was de kolom met 20 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, die 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2 HPO4 en 2 mM KH2P04) bevatte </li><li> Om de fracties met gelost NGF te bepalen, bel 200 μL NGF-oplossing (10 μg / ml) op de gelfiltreringskolom (25 cm lengte x 1 cm diameter) en eluteer met 1x PBS. </li><li> Verzamel totaal 12 fracties (1 ml per fractie) en meet de concentratie van NGF in elke fractie met een Sandwich ELISA kit voor NGF. </li><li> Ontdek NGF uit fracties 6 tot 10 onder gebruikmaking van de Sandwich ELISA kit. Verkrijg een chromatogram van gelost NGF op de kolom. Was de kolom met 20 ml PBS. </li><li> Om de fracties die NGF HDL-nabootsende NP&#39;s bevatten te bepalen, laden 200 μL van de NP&#39;s op de kolom en elueren met 1x PBS. Verzamel in totaal 12 fracties (1 ml voor elke fractie) en meet de intensiteit van deeltjes in elke fractie uZing de deeltjesgrootte analysator. Ontdek de NGF NP&#39;s uit fracties 2 tot 4. OPMERKING: De intensiteit is een parameter gemeten door de deeltjesanalysator, die vertelt hoeveel nanodeeltjes in de testoplossing kunnen bestaan. Hoe meer NP&#39;s in oplossing bestaan, hoe hoger de intensiteit is. Met deze aanpak kunnen we bevestigen dat de kolom NGF NP&#39;s kan scheiden van gelost NGF. </li><li> Om de entrapment efficiëntie van NGF te meten, laad 200 μL NGF HDL-nabootsende NP&#39;s op de kolom en eluteer met 1x PBS. Verzamel in totaal 12 fracties (1 ml per fractie). </li><li> Meet de geloste NGF-concentratie uit fracties 6 tot 10 met behulp van de Sandwich ELISA-kit. </li><li> Voeg de NGF-hoeveelheden toe die gemeten zijn van fracties 6 tot 10 samen als de geloste NGF en bereken de entrapmentefficiëntie van NGF met behulp van de volgende vergelijking. % EE = (1 - gelost NGF / totaal NGF toegevoegd in NP) x 100% Equation (1) </li></ol></li></ol> 3. In vitro vrijgave van NGF HDL-imiteren nanodeeltjes <ol><li> Bestudeer vrij NGF (10 μg / ml in water; n = 4) en NGF HDL-nabootsende NP&#39;s (10 μg / mL; n = 4). </li><li> Pre-treat 8 dialysebuizen (molecuulgewicht cutoff: 300 kDa) door de instructies van de fabrikant te volgen. </li><li> Bereid 5% boviene serumalbumine (BSA) in PBS als het afgiftemedium. Voeg 30 ml afgiftemedium toe aan een 50 ml centrifugebuis en verwarm het tot 37 ° C in een shaker met een snelheid van 135 rpm. Plaats nog eens 50 ml vrijgegeven medium in de shaker voor vervanging. </li><li> Voeg 400 μl vrijgegeven medium in de dialysebuis toe en voeg 200 μL van het geteste monster snel toe om voldoende volume voor dialyse te maken. </li><li> Sluit de buis en zet de dialysebuis snel in het vrijgegeven medium (de centrifugebuis). Zet 100 μL van het vrijgegeven medium snel uit de buitendialysebuis als het monster voor de tijd 0. Zet het monster onmiddellijk in -20 ° C voor latere analyse. Voeg 100 μL verse reLease medium in de centrifugebuis om het ingetrokken monster te vervangen. Start de timer. </li><li> Bij 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 en 72 uur trekken 100 μL van het afgiftemedium terug en vervangen met 100 μl vers medium. Zet de ingetrokken monsters onmiddellijk in -20 ° C voor latere analyse. </li><li> Verwijder na 72 uur alle monsters van -20 ° C en ontdooi ze bij kamertemperatuur. Meet de NGF concentraties van de afgifte monsters met behulp van de Sandwich ELISA kit. </li></ol> 4. Bioactiviteit van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes (Neurite Outgrowth Study) <ol><li> Cultuur PC12-cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd paarden serum, 5% foetaal runder serum, 100 ug / ml streptomycine en 100 eenheden / ml penicilline. Bewaar de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2. </li><li> Wanneer de cellen ~ 70-80% confluentie bereiken, verwijder het kweekmedium en was de cellen met 1x PBS (ongeveer 2 ml per 10 cm &lt;Sup&gt; 2 cultuuroppervlak). Verwijder de wasoplossing. Trypsineer de cellen door 0,25% trypsine-EDTA-oplossing (0,25% trypsine en 1 mM EDTA, 0,5 ml per 10 cm2 kweekoppervlak) toe te voegen aan de kolf en incuberen bij 37 ° C totdat de meeste cellen losgemaakt zijn. </li><li> Voeg twee volumes cultuurmedium toe en draai gedurende 5 minuten op 180 xg. Verwijder de supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml kweekmedium. Filter de cellen door een 22 G, ½ inch naald om celclusters te breken. </li><li> Verdeel de cellen in een verhouding van 1: 3 in een nieuwe celkweekfles. Na het incuberen gedurende de nacht, verwijder niet-aangesloten PC12-cellen. Laat de bijgevoegde cellen toe om te blijven groeien. </li><li> Herhaal deze procedure voor 3 passages om de subcultuur van PC12 te selecteren die een sterke hechtingseigenschap heeft. Pre-coat een 6-putje plaat met 800 μL / putje van ratstaart collageen type I (100 μg / ml). </li><li> Trypsineer de geselecteerde PC12-cellen zoals beschreven in stap 4.2 en filter ze door een22 G, ½ inch naald om de celclusters te breken. Tel de cellen met een hemocytometer. Zaad de cellen &#39;s nachts bij een dichtheid van 10.000 cellen / putje in de voorbedekte 6-putjesplaat in stap 4.5 om de cellen aan de plaat te bevestigen. </li><li> Verdun vrij NGF (10 μg / ml) en NGF HDL-nabootsende NP&#39;s (10 μg / ml) met het kweekmedium (beschreven in stap 4.1) om 0,5, 1, 5, 10, 50 en 100 ng / ml concentraties te bereiden. Verwijder 2 ml medium uit elke put en vervang met 2 ml van de verdunde vrije NGF of NGF HDL-nabootsende NP&#39;s. Cultuur voor 4 dagen. </li><li> Op dag 4, verander het medium naar vers medium (beschreven in stap 4.1) die de bijbehorende behandeling bevat en de behandeling gedurende nog eens 3 dagen doorgaan. </li><li> Op dag 7 visualiseert u de cellen met een omgekeerde lichtmicroscoop en beeld elke bron op willekeurige plekken onder 10X vergroting. </li></ol> 5. Biodistribusie van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes <ol><li> Gebruik volwassen BALB / c-muizen (mannetje, 25-30 g) tot tIs de weefselverdeling van NGF NP&#39;s. Deel de muizen willekeurig in drie groepen van 3 muizen per groep. Gebruik een kegelvormige plastic behuizing ( bijv. Decapicon) om een ​​muis vast te houden en de staart met ethanol te wrijven om de vasodilatie en de zichtbaarheid van de ader te bevorderen. </li><li> Injecteer 100 μl van zoutoplossing, vrije NGF of NGF HDL-nabootsende NP&#39;s aan elke groep muizen (3 groepen) via de staartvenen bij een dosis van 40 μg / kg NGF. Gebruik een 30½ G-naald die aan een 1 ml spuit is bevestigd. </li><li> Na 30 minuten na de injectie verdoving de muizen met 3% inhalatie van isofluraan (in zuurstof bij een stromingssnelheid van 2 L / min). Voer een staart- en teenknijp om de diepte van de verdoving vast te stellen. Bloed verzamelen door middel van cardiale punctie. <ol><li> Onttrek ongeveer 1 ml bloed uit het hart. Euthanize elke muis door cervicale dislocatie. </li></ol></li><li> Plaats de muiskarkas in dorsale recumbency. Open de buik met chirurgische scharen en verplaats vet en darmGebruik maken van een katoenen zwabber om de lever, milt en nier bloot te stellen. Oog deze weefsels op en spoel ze in 1x PBS om het bloed schoon te maken. </li><li> Centrifugeer de bloedmonsters onmiddellijk bij 3,400 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten om het plasma te verkrijgen. Bewaar het plasma en weefsels bij -80 ° C tot de analyses. </li><li> Om de weefselmonsters te analyseren, verplaats de monsters van -80 ° C tot 4 ° C en schud 100 mg weefselmonster in een 10x volume extractiebuffer (0,05 M natriumacetaat, 1,0 M natriumchloride, 1% Triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM fenylmethaansulfonylfluoride en 0,2 mM benzethoniumchloride). Homogeniseren bij 10.000 rpm en 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Offer twee onbehandelde muizen om leeg plasma en weefsels te verzamelen, zoals beschreven in stappen 5.3 en 5.4. Bereid NGF standaardoplossingen aan met blanco plasma of blanco weefselhomogenaten. </li><li> Bepaal de concentraties van NGF in de plasma- en weefselhomogenaten met behulp van de Sandwich ELISA-kit, zoals hierboven beschreven. </li></ol>

<ol><li>Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+and+recent+advances+in+peptide+and+protein+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Deliv%22%5BJournal%5D)">Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery.</a> Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).</li>
<li>Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-density+lipoprotein-mediated+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).</li>
<li>Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+as+a+drug+and+nucleic+acid+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle.</a> Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).</li>
<li>Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+delivery+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Long-term delivery of protein therapeutics.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).</li>
<li>Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLasic%2C+DD+%22Medical+application+of+liposomes%22">Medical application of liposomes</a>. , Elsevier. (1998).</li>
<li>Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+an+update+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: an update review.</a> Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).</li>
<li>Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+for+protein+delivery+prepared+from+amphiphilic+multiblock+copolymers%3A+2.+Modulation+of+release+rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate.</a> J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).</li>
<li>Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+protein+and+peptide+drug+delivery%3A+a+special+emphasis+on+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+lett%22%5BJournal%5D)">Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles.</a> Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).</li>
<li>Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoproteins%3A+nature%27s+multifunctional+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles.</a> ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).</li>
<li>Gursky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+stability+and+functional+remodeling+of+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).</li>
<li>McMahon, K. M., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoproteins+for+the+systemic+delivery+of+short+interfering+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA.</a> Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).</li>
<li>McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+as+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy.</a> Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).</li>
<li>Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+a+reconstituted+high+density+lipoprotein+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications.</a> Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).</li>
<li>Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mimicking+peptide-lipid+nanoparticles+with+improved+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting.</a> Small. 6 (3), 430-437 (2010).</li>
<li>Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+step+reconstitution+of+multifunctional+high-density+lipoprotein-derived+nanomaterials+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics.</a> ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).</li>
<li>Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+HDL-mimicking+%CE%B1-tocopherol-coated+nanoparticles+to+encapsulate+nerve+growth+factor+and+evaluation+of+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+and+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution.</a> Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie tonen we een eenvoudige methode om HDL-nabootsende NP&#39;s voor NGF-inkapseling te bereiden. Verschillende NP leveringssystemen zijn onderzocht om eiwitten te leveren. Momenteel betrekken veel NP-preparaten dialyse, oplosmiddelafbreking en filmhydratatie. Deze processen zijn over het algemeen gecompliceerd en uitdagend bij opschalen. Tijdens deze NP-ontwikkeling werd vastgesteld dat de lipiden sterke hechting hadden aan de glazen wand van de houder, wat leidde tot de moeilijkheden bij het hydrateren van ...

Macromoleculen, zoals eiwitten, peptiden en nucleïnezuren, zijn ontstaan ​​als veelbelovende medicijnen en hebben in de afgelopen decennia 1 , 2 veel aandacht gekregen . Door hun hoge werkzaamheids- en specifieke actiemodi hebben ze een groot therapeutisch potentieel voor de behandelingen van kanker, immuunziekte, HIV en aanverwante aandoeningen 3 , 4 . Echter, fysiochemische eigenschappen, zoals hun grote moleculaire grootte, driedimensionale structuur, oppervlakkosten en hydrofiele natuur maken de in vivo afgifte van deze macromoleculen zeer uitdagend. Dit belemmert hun klinische gebruik 4 aanzienlijk. Recente ontwikkelingen in drug delivery systemen, zoals microdeeltjes, polymeer nanodeeltjes (NP&#39;s), liposomen en lipide NP&#39;s, overwinnen deze uitdagingen en verbeterde de in vivo levering van macromoleculen aanzienlijk. HoWever, sommige nadeel ten aanzien van deze leveringslading is aangetoond, met inbegrip van lage laadcapaciteit, lage opname efficiëntie, korte halveringstijd, verlies van bioactiviteit en ongewenste bijwerkingen 5 , 6 , 7 , 8 . Effectieve draagstersystemen blijven een gebied van onderzoeksbelang. Bovendien is de ontwikkeling van analytische methoden om medicijnbelaste NP&#39;s te karakteriseren, meer uitdagend voor macromoleculen dan voor kleine moleculen. High-density lipoprotein (HDL) is een natuurlijke NP samengesteld uit een lipidekern die wordt bekleed door apolipoproteïnen en een fosfolipide monolaag. Endogene HDL speelt een kritische rol in het transport van lipiden, eiwitten en nucleïnezuren door de interactie met doelreceptoren, zoals SR-BI, ABCAI en ABCG1. Het is onderzocht als een middel voor de levering van verschillende therapeutische middelen 9, 10 , 11 , 12 . Verschillende methoden zijn ontwikkeld om HDL-nabootsende NP&#39;s te bereiden. Dialyse is een populaire aanpak. Bij deze werkwijze worden NP&#39;s gevormd door hydrateren van een lipidfilm onder toepassing van natriumcholaatoplossing. Het zout wordt vervolgens verwijderd door middel van een tweedaagse dialyse met drie buffers 13 . Sonicatiemethoden vervaardigen NP&#39;s door een lipidmengsel gedurende 60 minuten te soniciseren onder een verwarmingsconditie; De NP&#39;s worden verder gezuiverd door gelchromatografie 14 . Microfluidica genereert NP&#39;s via een microfluïdisch apparaat, dat fosfolipiden en apolipoproteïne AI (Apo AI) oplossingen mengt door microvortices in een focuspatroon 15 te maken . Het is duidelijk dat deze methoden tijdrovend, hard en moeilijk zijn voor industriële opschaling. In dit artikel introduceren we de voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende NP&#39;s voor zenuwenGroei factor (NGF) inkapseling. NGF is een disulfide-gekoppelde polypeptide homodimeer die twee 13,6-kDa polypeptide monomeren bevat. Een nieuwe procedure voor het bereiden van de NP&#39;s door homogenisatie, gevolgd door de inkapseling van NGF in de NP&#39;s, werd ontwikkeld. De NGF HDL-nabootsende NP&#39;s werden gekenmerkt voor deeltjesgrootte, grootteverdeling, zeta-potentieel en in vitro vrijlating. Hun bioactiviteit werd geëvalueerd voor neurietgroei in PC12-cellen. De biodistributie van NGF HDL-nabootsende NP&#39;s werd vergeleken met die van vrij NGF na intraveneuze injectie in muizen.

<table><tbody><tr><td>Recombinant Human Beta-NGF</td><td>Creative Biomart</td><td>NGF-05H</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Phosphatidylcholine (PC)</td><td>Avanti</td><td>131601P</td><td>95%, Egg, Chicken</td></tr><tr><td>Sphingomyeline (SM)</td><td>Avanti</td><td>860062P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Fosfatidylserine (PS)</td><td>Avanti</td><td>840032P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Cholesteryl oleate (CO)</td><td>Sigma</td><td>C9253</td><td></td></tr><tr><td>D-&alpha;-Tocoferyl polyethyleenglycolsuccinaat (TPGS)</td><td>BASF</td><td>9002-96-4</td><td>Vitamin E Polyethyleen Glycol Succinaat</td></tr><tr><td>Protaminesulfaat</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>voldoet aan USP-testspecificaties</td></tr><tr><td>Apolipoproteïne A1, Menselijke plasma</td><td>Athens Research &amp; Technology</td><td>16-16-120101</td><td>1 mg in 671 &micro;L 10 mM NH4HCO3, pH 7.4</td></tr><tr><td>Sepharose 4B-CL</td><td>Sigma</td><td>CL4B200</td><td>Gecrosslinkte agarose,&nbsp; vulmateriaal voor gelfiltratiechromatografiekolom</td></tr><tr><td>Sandwich ELISA-kit voor NGF</td><td>R&amp;D system</td><td>DY008</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30096.02</td><td></td></tr><tr><td>Paardenserum</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>PC12 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Rattenstaart collageen type I</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>31414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethaansulfonytfluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzethoniumchloride</td><td>Sigma</td><td>B8879</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Tekmar</td><td>T 25-S1</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano HC deeltjesanalysator</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Delsa Nano HC</td><td></td></tr><tr><td>Float-A-Lyzer G2 dialyse-apparaat</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>G235036</td><td>Molecule doorsnee 300 kDa</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendoff</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenisator</td><td>Kinematica</td><td>PT 1200C</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCone</td><td>&nbsp;Braintree Scientific Inc.</td><td>DC-M200</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding en karakterisering van nieuwe hdl-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei factor

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

Het doel van dit artikel is de voorbereiding en karakterisering van nervegroeifactoren (NGF) geladen, hoge dichtheid, lipoproteïne (HDL) -mimicerende nanodeeltjes (NP&#39;s) te introduceren. HDL&#39;s zijn endogene NP&#39;s en zijn onderzocht als voertuigen voor de levering van therapeutische middelen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld om HDL-nabootsende NP&#39;s te bereiden. Ze zijn echter over het algemeen gecompliceerd, tijdrovend en moeilijk voor industriële opschaling. In deze studie werd één stap homogenisatie gebruikt om de hulpstoffen te mengen en de prototype NP&#39;s te vormen. NGF is een in water oplosbaar eiwit van 26 kDa. Om de inkapseling van NGF in de lipidomgeving van HDL-nabootsende NP&#39;s te vergemakkelijken, werd protamine USP gebruikt om een ​​ionpaarcomplex te vormen met NGF om de ladingen op het NGF-oppervlak te neutraliseren. Het NGF / protamine complex werd vervolgens ingevoerd in het prototype NPs. Apolipoproteïne Al werd uiteindelijk op het oppervlak van de NP&#39;s gecoat. NGF HDL-nabootsende NP&#39;s vertoonden de voorkeurse eigenschappen in termenS met deeltjesgrootte, grootteverdeling, entrapmentefficiëntie, in vitro release, bioactiviteit en biodistributie. Met het zorgvuldige ontwerp en verkenning van homogenisatie in HDL-nabootsende NP&#39;s, werd de procedure sterk vereenvoudigd en werden de NP&#39;s schaalbaar gemaakt. Bovendien werden verschillende uitdagingen, zoals het scheiden van gelost NGF uit de NP&#39;s, het uitvoeren van betrouwbare in vitro vrijlatingstudies en het meten van de bioactiviteit van de NP&#39;s overwonnen.

De techniekschema van HDL-nabootsende, a-tocoferol gecoate NGF NP&#39;s bereid door een ionpaarstrategie is getoond in Figuur 1 . Om de oppervlakte-ladingen van NGF te neutraliseren werd protamine USP gebruikt als een ionpaarmiddel om een ​​complex te vormen met NGF. Om de bioactiviteit te beschermen werden prototype HDL-nabootsende NP&#39;s ontworpen, eerst met behulp van homogenisatie; Dan werd het NGF / protamine complex ingekapseld in de prototype NP&#39;s. Homogenis...

Eenvoudige homogenisatie werd gebruikt om nieuwe, hoge dichtheid, lipoproteïne-nabootsende nanodeeltjes te bereiden om de zenuwgroeifactor te inkapselen. Uitdagingen, gedetailleerde protocollen voor nanodeeltjespreparatie, in vitro karakterisering en in vivo studies worden beschreven in dit artikel.

Voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei Factor

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Het algemene doel van dit artikel is het introduceren van preparatie- en karakteriseringsmethoden voor nanodeeltjes die zenuwgroeifactor bevatten en high-density lipoprotein nabootsen. Eenvoudige homogenisatie werd gebruikt om normale, high-density lipoprotein-nabootsende nanodeeltjes te prepareren. De procedure is eenvoudig en schaalbaar.Bovendien verbeterde het nanodeeltje de inkapselingsefficiëntie van zowel NGF als APOA1 in de nanodeeltjes aanzienlijk. Diverse uitdagingen bij het karakteriseren van een nanodeeltje werden overwonnen, waaronder het scheiden van het niet-beladen NGF van de NGF-nanodeeltjes, het uitvoeren van betrouwbare in vitro radiusstudies en de biobeschikbaarheid van NGF-nanodeeltjes. Meng om te beginnen 10 µL NGF met 10 µL protamine USP in een 1,5 mL microcentrifugebuis en laat dit 10 minuten bij kamertemperatuur staan om het complex te vormen.Voeg vervolgens 59 µL fosfatidylcholine en 11 µL sphingomyeline toe aan een glazen vial. Voeg daarnaast vier µL fosfatidylserine, 15 µL cholesterylolieaat en 45 µL tocopherylpolyethyleenglycolsuccinaat toe. Meng het geheel en laat de ethanol gedurende ongeveer vijf minuten verdampen onder een zachte stroom stikstof.Alle hulpstoffen moeten een dunne olieachtige film vormen op de bodem van het glazen vial. Voeg één milliliter ultrapuur water toe aan het vial en homogeniseer gedurende vijf minuten bij 9.500 rpm bij kamertemperatuur om de prototype-nanodeeltjes, of NPs, te vormen. Voeg vervolgens het bereide complex toe aan de prototype-NPs.Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten bij 37 °C onder stirring, met gebruik van een kleine roerstaaf in het glazen vial. Koel de NP's af door nog eens 30 minuten te roeren bij kamertemperatuur. Voeg na het afkoelen 106 µL apolipoproteïne A-1 toe en roer dit gedurende de nacht bij kamertemperatuur om de uiteindelijke NGF HDL-nabotsende NP's te vormen.Meet de deeltjesgrootte en het zeta-potentiaal met een deeltjesanalyse-apparaat volgens de instructies van de fabrikant. Een cross-linked gelfiltratie-chromatografiekolom wordt gebruikt om het niet-gebonden NGF te scheiden van de NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes en om de inkapselingsefficiëntie van het NGF te bepalen. Voor de bereiding van de kolom brengt u 15 milliliters sepharose 4B CL-suspensie over in een bekerglas van 50 milliliter.Roer de kralensuspensie en giet een hoeveelheid in een kolom. Tik voorzichtig tegen de kolom om luchtbellen te verwijderen. Laat het oplosmiddel weglopen en de kralen enkele minuten bezinken.Voeg de resterende suspensie toe. Spoel de binnenwand van de kolom om de kralen te reinigen. Laat het oplosmiddel weglopen totdat het niveau van het oplosmiddel zich net boven de bovenkant van de stationaire fase bevindt.Was daarna de kolom en conditioneer deze met 20 milliliters 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing. Om de inkapselingsefficiëntie van NGF te meten, brengt u 200 microliters NGF HDL-nabotsende NP's aan op de kolom en elueert u met 1X PBS. Verzamel, zoals voorheen, in totaal 12 fracties van één milliliter.Behandel acht dialysetubes voor volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 30 milliliters release-medium toe aan een 50 milliliter centrifugebuis. Verwarm dit vervolgens tot 37 °C in een shaker met een schudsnelheid van 135 rpm.Sluit de dialysebuis en plaats deze in het vrijmakingsmedium. Neem snel 100 µL van het vrijmakingsmedium buiten de dialysebuis af als monster voor tijdstip nul. Plaats het monster onmiddellijk bij -20 °C voor latere analyse.Voeg 100 µL vers release-medium toe aan de centrifugebuis om het onttrokken monster te vervangen. Start vervolgens de timer. Onttrek na 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 en 72 uur telkens 100 µL van het release-medium en vervang dit door 100 µL vers medium.Plaats de afgenomen monsters onmiddellijk bij -20 °C voor latere analyse. Na een homogenisatie van drie minuten werden consistente partikelgroottes verkregen voor de prototype-nanodeeltjes. De uiteindelijke NGF-nanodeeltjes hadden partikelgroottes van 170 nm met een nauwe en monodisperse grootteverdeling.Onbeladen NGF en nanodeeltjes werden volledig gescheiden op de gelfiltratiekolom. Nanodeeltjes werden geëlueerd in fracties twee tot en met vier. ELISA-meting wees uit dat vrij NGF werd geëlueerd in fractie 7 tot en met fractie 10.De berekende inkapselingsefficiëntie van NGF was ongeveer 66%. De in vitro afgifte van NGF-nanodeeltjes wordt hier weergegeven. Door PBS en BSA toe te voegen aan het afgiftemedium, passeerde vrij NGF door het dialysemembraan met een herstel van meer dan 85%. Omgekeerd vertoonden NGF-nanodeeltjes een traag afgifteprofiel, waarbij ongeveer 10% van het NGF gedurende 72 uur uit de nanodeeltjes werd vrijgegeven. NGF-nanodeeltjes stimuleerden de uitgroei van neurieten in PC12-cellen in een vergelijkbare mate als vrij NGF.Neurietuitgroei werd duidelijk waargenomen onder de microscoop voor beide groepen bij een dosering van 50 ng/mL. NGF-nanodeeltjes verhoogden de plasmaconcentratie aanzienlijk en verminderden de opname van NGF in de lever, nieren en milt van de muizen. HDL-nabotsende nanodeeltjes ondersteunden NGF, waardoor een lange halfwaardetijd in de in vivo stabiliteit werd gerealiseerd.Eenmaal beheerst, kunnen monodisperse nanodeeltjes in drie minuten worden bereid met behulp van een homogenisatiemethode, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een zachte stikstofstroom te gebruiken om het oplosmiddel te verdampen en ervoor te zorgen dat er na homogenisatie geen lipiderestanten aan de wand van de container kleven. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe HDL-nabootsende nanodeeltjes kunnen worden gemaakt met een homogenisatiemethode en hoe NGF-geladen nanodeeltjes kunnen worden gekarakteriseerd.

preparation-characterization-novel-hdl-mimicking-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Rosenberg, M., et al. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a degradable nanostructured porous silicon (PSi) film for the sustained release of nerve growth factor (NGF) to support PC12 cell differentiation. NGF is adsorbed onto the film’s pores through electrostatic interactions and is gradually released into the media by diffusion and scaffold degradation. This controlled delivery promotes PC12 cell...

Sustained Delivery of Nerve Growth Factor Using a Porous Silicon Film in Rat Pheochromocytoma 12 Cells

Source: Zhu, J., et. al., Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the stepwise assembly of NGF-loaded HDL-mimicking nanoparticles using protamine-assisted encapsulation and lipid-based self-assembly for potential neurotrophic delivery applications.

Encapsulating Nerve Growth Factor in High-Density Lipoprotein-Mimicking Nanoparticles

Dit protocol combineert elektrospinnen en microsferen om weefselgeëngineerde scaffolds te ontwikkelen om neuronen te richten. Het zenuwgroeifactor werd ingekapseld in PLGA-microsferen en elektrogespunnen in hyaluronzuur (HA) vezelige scaffolds. De bioactiviteit van het eiwit werd getest door de scaffolds te zaaien met primaire kippendorsaalwortelganglia en 4-6 dagen te kweken.

Elektrospinproces Growth Factor Releasing microsferen in Stapel- Steigers

Het doel van dit protocol is om SDF-1α, een stamcel-home-factor, te integreren in dextransulfaat-chitosan nanodeeltjes.  De resulterende deeltjes worden gemeten op hun grootte en zetapotentiaal, evenals de inhoud, activiteit en in vitro afgiftesnelheid van SDF-1α uit de nanodeeltjes.

Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes

Vloeibaar kristal nanodeeltje (LCNP) Nanodrager wordt benut als middel voor de gecontroleerde afgifte van een hydrofoob lading naar de plasmamembraan van levende cellen.

Gerichte plasmamembraan Levering van een hydrofobe Cargo ingekapseld in een Liquid Crystal nanodeeltjes Carrier

Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en te fabriceren nanostructured poreuze silicium (PSi) films als afbreekbaar dragers voor de zenuw groeifactor (NGF). Neuronale differentiatie en uitgroei van PC12 cellen en muizen achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen worden gekenmerkt op een behandeling met de NGF-geladen PSi vervoerders.

Ontwerpen van poreuze Silicon Films als dragers van de zenuw groeifactor

Dit artikel beschrijft de inkapseling van falcarindiol in lipide-gecoate 74 nm nanodeeltjes. De mobiele opname van de nanodeeltjes door menselijke stamcellen in lipide druppels wordt gecontroleerd door fluorescerende en confocal beeldvorming. Nanodeeltjes worden vervaardigd door de snelle injectie methode van oplosmiddel verschuiven, en hun grootte wordt gemeten met de Dynamische lichtverstrooiing techniek.

Opname van nieuwe lipide-gecoate nanodeeltjes met Falcarindiol door menselijke mesenchymale stamcellen

Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.

Voorbereiding en karakterisering van Nanoliposomes voor de Entrapment van bioactieve hydrofiele bolvormige eiwitten

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

Hier beschrijven we de productie en karakterisering van bioactieve stoffen die nanoschijven bevatten. Amfotericine B nanoschijven worden als voorbeeld genomen om het protocol stapsgewijs te beschrijven.

Formulering en karakterisering van bioactieve stof die nanoschijven bevat

Leer de bereiding en karakterisering van HDL-nabootsende nanodeeltjes geladen met zenuwgroeifactor via eenvoudige homogenisatie. Deze schaalbare methode verbetert de insluitingsefficiëntie voor therapeutische toepassingen in de neurowetenschap.

Voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei Factor

Meer video's verkennen