Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse
17 april 2017
Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.
Het algemene doel van het isoleren van lipidedruppels voor kwantitatieve massaspectrometrie is om de functie van deze organellen te begrijpen, bijvoorbeeld in de replicatie van pathogenen zoals het hepatitis C-virus. Deze methode kan belangrijke vragen in het veld van infectieziekten beantwoorden, zoals waarom pathogenen zich aan de druppels hechten voor replicatie. De isolatie van lipidedruppels kan in zes tot zeven uur worden uitgevoerd.
En tijdens deze procedure is het belangrijk om de besmetting van keratine te voorkomen. Verwijder om te beginnen 50 milliliter van elke fles DMEM-medium en voeg 50 milliliter gedialyseerde foetaal runder serum toe. Los vervolgens 50 milligram koolstof 13 gelabelde lysine en 50 milligram koolstof 13 gelabelde arginine op in één milliliter medium.
Meng grondig en voeg de aminozuren toe aan het DMEM plus FCS-medium. Voeg vervolgens PenStrep en glutamine-vervanger toe. Filter het medium steriel met een 0,45 micron filter en label de fles als zwaar SILAC-medium.
Om het lichte medium voor te bereiden, herhaalt u deze stappen met behulp van 50 milligram arginine en 50 milligram lysine. Label de fles als licht SILAC-medium. Trypsiniseren de cellen en verdeel ze in twee putjes van een zes-putjescultuurplaat.
Eén putje moet twee milliliter van het zware SILAC-medium bevatten en de andere, twee milliliter van het lichte SILAC-medium. Kweek de cellen gedurende minimaal zes passages. Na zes passages zou de incorporatie van de zware aminozuren meer dan 95% moeten zijn. Haal een miljoen cellen van de zwaar en licht gelabelde celpopulaties om de incorporatie-efficiëntie te analyseren.
Na het wassen van de cellen in 1X PBS, pellet ze door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 160 keer g en vier graden Celsius. Resuspendeer de cel pellets in 150 microliter MS-buffer. Vervolgens, incubeer de cellen gedurende 30 minuten op ijs.
Lyse vervolgens de cellen door sonicatie bij vier graden Celsius. Verwijder het cellulaire puin door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 11.000 keer g en vier graden Celsius. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis en bepaal de eiwitconcentratie met een detergens-compatibel eiwit assay.
Meng vervolgens 75 microgram eiwit met zes x monster buffer. Na het koken bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten, scheid de eiwitten door SDS-PAGE in SDS-loopbuffer bij 180 volt gedurende ongeveer een uur. Na Coomassie-kleuring, snij hetzelfde eiwitbandje uit en analyseer de incorporatie-efficiëntie door MS-analyse.
Besmet de lichte populatie cellen met het hepatitis C-reportervirus door ze gedurende vier uur bij 37 graden Celsius te incuberen met vezelige stocks. Breid HCV-geïnfecteerde lichte cellen en niet-geïnfecteerde zware cellen uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Als u een HCV-stam gebruikt die een blasticidin-resistentiegen draagt, voegt u 10 microgram per milliliter blasticidin S toe aan het lichte medium om HCV-positieve cellen te selecteren.
Een dag voorafgaand aan de isolatie van lipidedruppels, was de cellen met PBS, trypsiniseren en resuspendeer in het corresponderende lichte of zware medium. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-telkamer. Zaai vervolgens zeven miljoen cellen van elke populatie in een 150 vierkante centimeter celcultuurschaal.
Bereid ten minste vijf schalen voor elke lichte en zware celpopulatie. Kweek de cellen in 30 milliliter medium per schaal gedurende een nacht. Verwijder de volgende dag het medium en was de cellen in 1X PBS.
Los de cellen op in 1X PBS met behulp van een celschraper. Tel beide celpopulaties opnieuw zoals eerder beschreven, trek gelijke celnummers in 50 milliliter centrifugeerbuisjes. Pellet de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 160 keer g en vier graden Celsius.
Verwijder de PBS en resuspendeer de celpellet in één milliliter sucrosebuffer. Breng de celsuspensie over naar een strak passende Ounce homogenisator voordat de cellen worden gelyseerd met 200 slagen op ijs. Breng vervolgens het lysaat over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje en centrifugeer de kernen en celdeeltjes gedurende 10 minuten bij 1.000 keer g en vier graden Celsius.
Na centrifugatie, bewaar een aliquot van 25 microliter van de post-nucleaire fractie, of PNS, bij min 20 graden Celsius als een ingangscontrole. Plaats de rest van de PNS-fractie op de bodem van de centrifugeerbuis en bedek deze met ongeveer drie milliliter van de lipidedruppelwasbuffer. Centrifugeer gedurende twee uur bij 100.000 keer g en vier graden Celsius.
Na centrifugatie, oogst de drijvende lipidedruppelfractie vanaf de bovenkant van de buis met behulp van een gebogen stompe canule. Plaats vervolgens de lipidedruppelfractie in een centrifugeerbuisje, bedek met lipidedruppelwasbuffer en herhaal de centrifugatiestap. Het oogsten van de lipidedruppels vanaf de bovenkant van het gradiënt vereist ervaring.
En is gemakkelijker hoe groter de fractie is. Je kunt vetcellen gebruiken om te oefenen. Of je kunt je cellen voeden met oleaat om de hoeveelheid lipidedruppels te verhogen.
Oogst opnieuw de drijvende lipidedruppelfractie met behulp van een gebogen stompe canule vanaf de bovenkant van de buis. Breng de lipidedruppels over naar een nieuw 1,5 milliliter microcentrifugebuisje en voeg 500 microliter lipidedruppelwasbuffer toe. Draai vervolgens het monster gedurende 20 minuten bij 21.000 keer g en vier graden Celsius.
Verwijder de onderliggende wasbuffer met behulp van een gel-loading pipette tip en herhaal de wasstap drie keer. Na de laatste verwijdering van de wasbuffer, meng vijf microliter lipidedruppelfracties met 10 microliter NP 40 lysisbuffer voor bepaling van het eiwitgehalte. Incubeer het monster op ijs gedurende één uur om het virus te inactiveren als u met infectieus materiaal werkt.
Op dit punt kunnen de lipidedruppelfracties worden bewaard bij min 20 graden Celsius. Meng vervolgens het volume dat overeenkomt met minimaal 35 microgram eiwit met 4x ladingskleurstof. Incubeer het mengsel op ijs gedurende één
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van lipidedruppels om hun rol in de replicatie van pathogenen zoals het Hepatitis C Virus (HCV) te bestuderen. Het isolatieproces is cruciaal voor het begrijpen van de interacties tussen pathogenen en lipidedruppels onder verschillende omstandigheden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Besmettelijke ziekten
Achtergrond
- Lipide druppels zijn organellen die betrokken zijn bij de replicatie van verschillende pathogenen.
- Het Hepatitis C Virus (HCV) is afhankelijk van lipide druppels voor zijn replicatie.
- Het begrijpen van lipide druppels dynamiek kan inzichten verschaffen in mechanismen van infectieziekten.
- Besmetting tijdens isolatieprocedures moet worden vermeden voor nauwkeurige resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om lipidedruppels te isoleren voor kwantitatieve massaspectrometrie analyse.
- Om de rol van lipidedruppels in de replicatie van pathogenen te onderzoeken.
- Om belangrijke vragen in het veld van besmettelijke ziekten aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van lipidedruppels kan in zes tot zeven uur worden voltooid.
- Voorbereiding omvat het mengen van DMEM medium met gedialyseerd foetaal runder serum.
- Koolstof 13 gelabeld lysine en arginine worden gebruikt in het isolatieproces.
- Er wordt zorgvuldig voor gezorgd om keratine contaminatie tijdens de procedure te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt kwantitatieve analyse van eiwitten die geassocieerd zijn met lipidedruppels mogelijk.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van HCV replicatie mechanismen verbeteren.
- Mogelijke toepassingen bij het bestuderen van andere pathogenen die lipidedruppels gebruiken.
- Stel een protocol vast dat kan worden aangepast voor verschillende experimentele omstandigheden.
Conclusies
- De isolatiemethode is effectief voor het bestuderen van lipidedruppel-geassocieerde eiwitten.
- Het begrijpen van lipidedruppels dynamiek is cruciaal voor onderzoek naar infectieziekten.
- Deze aanpak kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën tegen HCV en vergelijkbare pathogenen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding lipid droplet proteome dynamics enables target validation in infectious disease research by identifying host factors that pathogens exploit for replication. This method supports mechanistic de-risking through quantitative mass spectrometry, providing predictive confidence in target selection for antiviral strategies. The approach applies to early discovery stages where pathway clarification and biological validation inform portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying protein recruitment to or depletion from lipid droplets during pathogen infection.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for isolating lipid droplets to assess host-pathogen interactions under controlled conditions.
- Strategic Value: Supports target confidence by identifying pro- or antiviral host factors that modulate lipid droplet-associated proteomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative proteomic data from enriched lipid droplet fractions for downstream screening applications.
- Operational Value: Establishes reproducible isolation and washing steps to minimize variability in protein yield and purity.
- Strategic Value: Enables assay standardization for comparing lipid droplet composition across experimental conditions such as infection or drug treatment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker discovery by linking lipid droplet-associated protein changes to pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Supports preclinical model validation through consistent isolation protocols applicable to various cell types and culture conditions.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying host factors that could be modulated therapeutically.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing quantitative insights into organelle-specific proteome remodeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing how pathogens like HCV alter lipid droplet composition.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible lipid droplet fractions enriched for associated proteins via ultracentrifugation and washing steps.
- Analytics: Enables quantitative comparison of protein abundance using SILAC labeling and LC-ESI-MS/MS to detect condition-specific changes.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by identifying dysregulated proteins that may serve as biomarkers or therapeutic targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation protocol adaptable to diverse pathogens, stress conditions, or compound treatments beyond HCV.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in host-pathogen interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized lysis, centrifugation, and washing procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative data on lipid droplet-associated proteins that influence replication efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their functional association with lipid droplets during infection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in SILAC labeling, ultracentrifugation, and mass spectrometry-based proteomics.
- Depends on access to ultracentrifuges, homogenizers, and compatible detergents for protein assays.
- Necessitates cross-team standardization of lipid droplet isolation and washing protocols to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different cell types or pathogen models.
- Includes practical limitations such as the need for technical expertise in harvesting floating lipid droplet fractions and avoiding keratin contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Preparation of Media for Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC)
1:34
SILAC-labeling and Amino Acid Incorporation Control
3:15
Lipid Droplet Isolation of SILAC-labeled Huh7.5 Cells
7:59
Analysis of Lipid Droplets Purity
8:53
Results: Qualitative and Quantitative Analysis of the Lipid Droplets
9:57
Conclusion
