Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Het algemene doel van het isoleren van lipiddruppels voor kwantitatieve massaspectrometrie is het begrijpen van de functie van deze organellen, bijvoorbeeld bij de replicatie van pathogenen zoals het hepatitise C-virus. Deze methode kan cruciale vragen in het veld van infectieziekten beantwoorden, zoals de reden waarom pathogenen zich aan de druppels binden voor replicatie. De isolatie van lipiddruppels kan in zes tot zeven uur worden voltooid.

Tijdens deze procedure is het belangrijk om contaminatie met keratine te vermijden. Begin met het verwijderen van 50 milliliters uit elke fles DMEM-medium en voeg 50 milliliters gedialyseerd foetaal kalfsserum toe. Los vervolgens 50 milligrams koolstof-13 gelabelde lysine en 50 milligrams koolstof-13 gelabelde arginine op in één milliliter medium.

Meng grondig en voeg de aminozuren toe aan het DMEM plus FCS-medium. Voeg vervolgens PenStrep en glutamine-substituut toe. Steriliseer het medium door middel van filtratie met een 0,45 micron filter en label de fles als zwaar SILAC-medium.

Om het lichte medium te bereiden, herhaalt u deze stappen met 50 milligram arginine en 50 milligram lysine. Label de fles als licht SILAC-medium. Trypsiniseer de cellen en verdeel deze over twee putjes van een zes-putjes cultuurplaat.

Eén put moet twee milliliter van het zware SILAC-medium bevatten, en de andere put twee milliliter van het lichte SILAC-medium. Kweek de cellen gedurende ten minste zes passages. Na zes passages moet de incorporatie van de zware aminozuren meer dan 95% zijn. Oogst één miljoen cellen van de zwaar en licht gelabelde celpopulaties om de efficiëntie van de incorporatie te analyseren.

Na het wassen van de cellen in 1X PBS, worden deze gepelleteerd door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 160 ×g en vier °C. Resuspendeer de celpellets in 150 µL MS-buffer. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 30 minuten op ijs.

Lyseer vervolgens de cellen door middel van sonicatie bij vier graden Celsius. Verwijder het celdebris door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 11, 000 ×g en vier graden Celsius. Draag het supernatant over naar een nieuwe buis en bepaal de eiwitconcentratie met een detergent-compatibele eiwitassay.

Meng vervolgens 75 µg proteïne met six x monsterbuffer. Na het koken bij 95 °C gedurende vijf minuten, worden de proteïnen gescheiden via SDS-PAGE in SDS-runbuffer bij 180 V gedurende ongeveer één uur. Na Coomassie-kleuring wordt de betreffende proteïneband uitgesneden en wordt de incorporatie-efficiëntie geanalyseerd via MS-analyse.

Infecteer de lichte celpopulatie met het hepatitis C reportervirus door deze vier uur lang bij 37 °C te incuberen met fibreuze stocks. Breid de HCV-geïnfecteerde lichte cellen en de niet-geïnfecteerde zware cellen uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Indien er een HCV-stam wordt gebruikt die een blasticidine-resistentiegen bevat, voeg dan 10 µg/mL blasticidine S toe aan het lichte medium om te selecteren op HCV-positieve cellen.

Was één dag voor de isolatie van lipidedruppels de cellen met PBS, trypsiniseer ze en resuspendeer ze in het overeenkomstige lichte of zware medium. Tel de cellen met een Neubauer-telkamer. Zaai vervolgens zeven miljoen cellen van elke populatie in een celkweekschaal van 150 vierkante centimeter.

Bereid ten minste vijf schalen voor per lichte en zware celpopulatie. Kweek de cellen gedurende één nacht in 30 milliliters medium per schaal. Verwijder de volgende dag het medium en was de cellen in 1X PBS.

Los de cellen los in 1X PBS met een celschraper. Tel beide celpopulaties zoals voorheen en breng gelijke aantallen cellen over in centrifugebuisjes van 50 milliliter. Pelleteer de cellen door middel van centrifugatie gedurende vijf minuten bij 160 times g en vier graden Celsius.

Verwijder de PBS en resuspendeer de celpellet in één milliliter sucrosebuffer. Breng de celsuspensie over naar een nauwsluitende Ounce homogenisator en lyseer de cellen vervolgens met 200 slagen op ijs. Breng het lysaat daarna over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer de kernen en celresten gedurende 10 minuten bij 1.000 ×g en vier graden Celsius.

Bewaar na centrifugatie een aliquot van 25 µL van de post-nucleaire fractie, of PNS, bij -20 °C als inputcontrole. Plaats de rest van de PNS-fractie op de bodem van de centrifugebuis en voeg hier ongeveer 3 mL van de lipid droplet wash buffer aan toe. Centrifugeer gedurende twee uur bij 100.000 ×g en 4 °C.

Oogst na centrifugatie de drijvende fractie lipidedruppels van de bovenkant van de buis met een gebogen stompe canule. Plaats de fractie lipidedruppels vervolgens in een centrifugebuis, voeg een laagje wasbuffer voor lipidedruppels toe en herhaal de centrifugatiestap. Het oogsten van de lipidedruppels van de bovenkant van de gradiënt vereist ervaring.

En hoe groter de fractie is, hoe gemakkelijker dit is. U kunt vetcellen gebruiken om te oefenen. Of u kunt uw cellen voeden met oleaat om de hoeveelheid lipidedruppels te verhogen.

Oogst opnieuw de drijvende lipidedruppelfractie van de bovenkant van de buis met behulp van een gebogen stompe canule. Draag de lipidedruppels over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg 500 microliters lipidedruppelwasbuffer toe. Centrifugeer het monster vervolgens 20 minuten bij 21.000 ×g en vier graden Celsius.

Verwijder de onderliggende wasbuffer met een gel-laadpipetpunt en herhaal de wasstap drie keer. Meng na de laatste verwijdering van de wasbuffer vijf microliters van de lipidedruppelfracties met 10 microliters NP 40 lysisbuffer voor de bepaling van het eiwitgehalte. Incubeer het monster een uur op ijs om het virus te inactiveren indien er met infectieus materiaal wordt gewerkt.

Op dit punt kunnen de lipidendruppelfracties worden bewaard bij -20 °C. Meng vervolgens het volume dat overeenkomt met ten minste 35 µg eiwit met 4x loading dye. Incubeer het mengsel gedurende één uur op ijs om het virus te inactiveren indien er met infectieus materiaal wordt gewerkt.

Kook het monster vijf minuten lang bij 95 °C. Voer vervolgens SDS-PAGE uit gevolgd door Coomassie-kleuring om het monster voor te bereiden op vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de zuiverheid van de lipidedruppels te analyseren, worden aliquoten van de lipidedruppelfracties, één tot twee, verdund met NP 40 lysisbuffer.

Verdun de input-controlefracties één op tien met dezelfde buffer. Incubeer de monsters één uur op ijs om het virus te inactiveren indien er met infectieus materiaal wordt gewerkt. Bepaal vervolgens het proteïneniveau met een detergent-compatibele proteïne-assay.

Meng vervolgens een gelijke hoeveelheid eiwit met 6x monsterbuffer en incubeer de monsters gedurende één uur op ijs om het virus te inactiveren indien er met infectieus materiaal wordt gewerkt. Voer daarna een SDS-PAGE uit en breng de eiwitten over naar een nitrocellulosemembraan via tank blotting bij 80 volt gedurende 90 minuten. Hier wordt een representatieve western blot-analyse van post-nucleaire fracties en lipiddruppel-fracties getoond.

De western blot laat duidelijk een verrijking zien van de lipidedruppelmarker-eiwitten perilipine twee en perilipine drie in lipidedruppelfracties, en een uitputting van markers van andere cellulaire compartimenten. Post-nucleaire en lipidedruppelfracties kunnen aanvullend worden geanalyseerd met Coomassie-blauw en zilverkleuring. Deze heat map illustreert het aantal peptiden en het percentage eiwitdekking van eiwitten die zijn geïdentificeerd in lipidedruppelfracties van de geanalyseerde cellen.

De uiteindelijke heatmap laat zien hoe een HCV-infectie de lipidendruppels per dag verandert. Verrijkte eiwitten geassocieerd met lipidendruppels zijn in het rood aangegeven, en uitgeputte eiwitten geassocieerd met lipidendruppels zijn in het blauw aangegeven. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat we de cellen mengen vóór de isolatie en vóór de isolatie van de lipidendruppels, waardoor we fouten kunnen minimaliseren die kunnen optreden tijdens de cellyse en tijdens de isolatiestappen.