Name: Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor high-throughput genotypering van CRISPR/Cas9 knockout mutanten. Deze methode biedt een kosteneffectief alternatief voor sequencing in genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken mevrouw Tan Shi Min, mevrouw Helen Ong, en Dr. Zhao Yi voor het helpen met de capillaire gelelektroforese experimenten. Dit werk werd ondersteund door NMRC / IRG verlenen NMRC / 1314/2011 en MOE ACRF Tier 2 Fund subsidie ​​MOE2011-T2-1-051.

<ol><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2Fcas9%2C+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312(2016).</li>
<li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24157548">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4%2B+T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li>
<li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li>
<li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genotyping+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587(2015).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li>
<li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861(2012).</li>
<li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632(2014).</li>
<li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Het uitspelen van een specifiek gen in een model cellijn keuze heeft routine voor het ophelderen van de rol die het gen speelt in die specifieke cellulaire context te worden. In feite, verschillende genoom-brede schermen zijn beschikbaar die de CRISPR / Cas9 systeem vrijwel alle bekende menselijke genen gericht in het genoom 14, 15, 16. Met deze grote schermen (of zelfs kleine targeting van individuele genen van belang), is het...

Reverse genetische benaderingen zijn toegestaan ​​wetenschappers om de effecten van specifieke veranderingen ontrafelen in het genoom van de cel of het hele organisme. Bijvoorbeeld kan de expressie van een bepaald gen worden verzwakt door gen knockdown 1, 2 (partiële reductie) of gen knockout 3, 4 (complete ablatie) om het effect dat dit heeft op de functie van de cel of het bepalen ontwikkeling van het organisme. Genknockout experimenten gemakkelijker omdat de introductie van sequentiespecifieke programmeerbare nucleasen, zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (talens) worden. Echter, de relatief recente karakterisering van de geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindroom repeat (CRISPR) / Cas9 systeem is het zeer eenvoudig voor elk laboratorium de hele wereld om gen uit te voeren gemaakte knockout experimenten. In wezen is de CRISPR / Cas9 bestaat uit twee essentiële componenten-één hulplijn RNA (sgRNA), die herkent en bindt via basis complementariteit met een specifieke sequentie in het genoom, en een endonuclease genoemd Cas9. Na de specifieke binding en werking van het sgRNA-Cas9 complex op genomisch DNA is dubbelstrengs splitsing van DNA. Dit op zijn beurt activeert de DNA-schade reactiemechanisme in de cel, die vervolgens via de niet-homologe-end-joining (NHEJ) of homologe recombinatie (HR) banen wordt hersteld. Aangezien de NHEJ herstelmechanisme (maar niet de HR mechanisme) resulteert vaak in de willekeurige insertie of deletie van nucleotiden op de plaats van reparatie, waardoor insertie / deletie (indel) mutaties, kan dit leiden tot het leesraam van een exon te verschuiven. Dit kan vervolgens leiden tot de knock-out van het gen door vroegtijdige terminatie van translatie en-nonsense gemedieerde verval 5, 6,7. Ondanks het gemak verschaft door de invoering van de CRISPR / Cas9 systeem kloppen van een gen, genotypering klonen van doelcellen loopt stuk, vooral in een high-throughput instelling 8, 9. Bestaande technieken ofwel enige hinder inherente beperkingen of financieel kostbaar. Bijvoorbeeld, de inspecteur of T7E1 assay, welke een enzymatische test die mismatches detecteert DNA duplexen 10, niet in staat onderscheid te maken tussen wildtype klonen en homozygote mutanten (klonen waarvan de allelen identiek gemuteerd) aangezien deze klonen identieke allelen en derhalve geen mismatches aanwezig in de DNA-sequentie 11. Bovendien, het gebruik van Sanger sequentiebepaling, die wordt beschouwd als de gouden standaard voor het genotyperen van mutante klonen, in een hoge-doorvoer opstelling is ongewenst vanwege de hoge kosten. Hier presenteren we een detailed protocol van de fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek, die de beperkingen van de andere bestaande genotyperingstechnieken kan omzeilen en is vooral nuttig bij het uitvoeren van een high-throughput screen van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Deze methode is technisch eenvoudig uit te voeren en bespaart tijd en kosten.

<table><tbody><tr><td>HEPG2-cellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Foetale boviene serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%), fenol rood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5%), geen fenol rood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Water, moleculaire biologie kwaliteit</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA insert oligonukleotide (sense)</td><td>AITbiotech</td><td>Geen</td><td>Volgorde: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'</td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA insert oligonukleotide (anti-sense)</td><td>AITbiotech</td><td>Geen</td><td>Volgorde: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>Ongelabelde PCR-amplificatie voorwaartse primer</td><td>AITbiotech</td><td>Geen</td><td>Volgorde: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; deze primer wordt ook gebruikt om PCR-versterkte allelen te sequencen</td></tr><tr><td>6-FAM-gelabelde fluorescente PCR voorwaartse primer</td><td>AITbiotech</td><td>Geen</td><td>Volgorde: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'</td></tr><tr><td>HEX-gelabelde fluorescente PCR voorwaartse primer</td><td>AITbiotech</td><td>Geen</td><td>Volgorde: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'</td></tr><tr><td>Ongelabelde PCR reverse primer</td><td>AITbiotech</td><td>Geen</td><td>Volgorde: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'</td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL Genetic Analyzer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 Series 2 programma</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 programma</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 Antilichaam (N-term)</td><td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>Kernmatrix Eiwit p84 antilichaam [5E10]</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Geit Anti-Konijn IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Schaap Anti-Muis IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruikmaking van een fluorescentie pcr-capillaire gelelektroforese techniek voor crispr genotype / cas9-gemedieerde knockout mutanten in een high-throughput format

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

De ontwikkeling van programmeerbare genoom-editing tools is het gebruik van reverse genetics om de rol van specifieke genoomsequenties spelen in het functioneren van cellen en hele organismen te begrijpen vergemakkelijkt. Deze oorzaak is enorm geholpen door de recente invoering van de CRISPR / Cas9 systeem een ​​veelzijdige tool waarmee onderzoekers het genoom en transcriptoom manipuleren om, onder andere, knock-out, knock down, of knock in genen in een gerichte manier. Ten behoeve van kloppen van een gen, CRISPR / Cas9 gemedieerde dubbelstrengsbreuken werven de niet-homologe-DNA-end verbinden herstelweg de leesraamverschuivingsinducerende veroorzaken insertie of deletie van nucleotiden te introduceren in de rust plaats. Echter kan een individuele geleider RNA ongewenste off-target veroorzaken, en deze uit te sluiten, het gebruik van meervoudige geleider RNAs nodig. Deze veelheid aan doelen betekent ook dat een hoog volume screening van klonen vereist, wat op zijn beurt roept de toepassing van een efdoende high-throughput techniek om de knock-out klonen genotype. Huidige genotyperingstechnieken ofwel lijden aan inherente beperkingen of maakt hoge kosten, vandaar waardoor ze ongeschikt zijn voor high-throughput doeleinden. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor het gebruik van fluorescente PCR, die genomisch DNA gebruikt uit ruw cellysaat als sjabloon en oplossen van de PCR-fragmenten via capillaire gelelektroforese. Deze techniek is nauwkeurig genoeg om een ​​basenpaar verschil tussen fragmenten differentiëren en derhalve toereikend is dat de aanwezigheid of afwezigheid van een frameshift in de coderende sequentie van het doelgen. Deze nauwkeurige kennis effectief verzet zich tegen de noodzaak van een bevestigende sequencing stap en stelt gebruikers in staat om tijd en kosten te besparen in het proces. Bovendien is deze techniek bewezen veelzijdig genotypering diverse zoogdiercellen uit verschillende weefsels oorsprong doelwit van gids-RNA&#39;s tegen talrijke genen, zoals hier en elders getoond.

De fluorescente PCR-capillaire gelelektroforese techniek beschreven wordt verwacht toepasbaar op elk getarget gebied in het genoom worden in vrijwel elke cellijn die vatbaar is voor vreemd DNA afgifte. We hebben eerder de toepassing ervan aangetoond door zich te richten drie genen in een colorectale kanker cellijn 12. Hier tonen we de werkzaamheid in genotypering van een hepatocellulair carcinoom cellijn, HEPG2, gericht, met een CRISPR / Cas9 te bouwen tegen de Pr...

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Het algemene doel van deze techniek is om CRISPR/Cas9-geïnduceerde insertie-deletie mutantclonen op een high-throughput-manier te genotyperen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de genetica, zoals het fenotypische effect van het uitschakelen van een specifiek gen in een SAIL-model naar keuze. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er sprake is van een minimale tot high-throughput screening die multifunctioneel is.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de menselijke kankergenetica, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals menselijke cellen, stamcellen en primaire cellen, of cellen van niet-menselijke oorsprong. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we assays voor short tandem repeats of STR-typering uitvoerden. Om de procedure te starten, transfecteert u de gekozen cellen met een plasmide waarin een fluorescent gelabeld cas9 en het single guide RNA worden co-expressie.Trypsiniseer de cellen en selecteer ongeveer 3.500 fluorescentielabelde klonen. Plaats de klonen in porties van 500, 1.000 en 2.000 cellen op 10 centimeter schalen in acht milliliter groeimedium aangevuld met penicilline-streptomycine. Incubeer de cellen in een 5% CO2 atmosfeer bij 37 °C en vervang het medium elke vijf dagen tot er met het blote oog enkelcellige kolonies zichtbaar zijn.Suct daarna individuele kolonies op met een 200 microliter pipette met ongeveer vijf microliters groeimedium. Overbreng elke kolonie naar een aparte put die 200 microliters groeimedium bevat. Pipetteer elk mengsel herhaaldelijk op en neer om de cellen te resuspenderen.Incubeer de cellen onder de eerder beschreven condities totdat de cellen een confluentie van 50 tot 90% bereiken. Verwijder het overtollige cultuurmedium uit de wells en voeg 25 µL 0,05% trypsine EDTA zonder fenolrood toe aan elke well. Incubeer de cellen 7 minuten bij 37 °C.Pipetteer vervolgens de mengsels herhaaldelijk op en neer om de getrypsineerde cellen opnieuw te resuspenderen. Inspecteer de putjes onder een microscoop om te verifiëren dat de cellen los zijn gekomen van de wanden van de putjes. Om replica's van de individuele klonen voor te bereiden, brengt u vijf µL van elke celisuspensie over naar een lege 96-wells kweekplaat.Voeg 200 µL groeimedium toe aan elke well. Vul vervolgens de wells van een lege 96-well PCR-plaat met 10 µL lysisbuffer. Breng nog eens vijf µL van elke celsuspensie over naar deze 96-well plaat.Centrifugeer de plaat kort tot de vloeistof op de bodem van de wells is gezakt. Voeg 200 microliter groeimedium toe aan de resterende 15 microliter van elke celсусpensie. Bewaar de oorspronkelijke suspensie en de replica's onder de incubatiecondities voor latere verificatie van de knockout-status van de klonen.Gebruik vervolgens thermische cycli om de cellen in lysisbuffer volledig te lyseren. Centrifugeer de lysaten kort. Verdun de lysaten met 40 µL nucleasevrij water.Vortex de verdunde lysaten en centrifugeer ze kort. Ontwerp en test, voorafgaand aan het uitvoeren van de fluorescente PCR, de specificiteit van verschillende paren ongelabelde primers op gelyseerde wild-type cellen. Identificeer het optimale primerpaar en verkrijg de met fluorofoor gelabelde forward-primers en de ongelabelde reverse-primer.Zorg ervoor dat de specificiteit van de primers wordt getest met vortex-cellen, gelijst met de zelfgemaakte lysisbuffer, aangezien de resultaten kunnen afwijken van die bij het gebruik van gezuiverd genomisch DNA. Voer met de gelabelde primers fluorescentie-PCR-reacties van 20 µL uit met drie µL van de verdunde lysaten om de doelregio's te amplificeren. Beoordeel de grootte en relatieve hoeveelheden van de PCR-ampliconen door vijf µL van de ampliconen te scheiden op een 1% agarosegel.Om te beginnen met de monstervoorbereiding, gebruik nucleasevrij water om amplicons van wild-type en CRISPR/Cas9-getarget DNA te verdunnen tot een geschatte concentratie van 2,5 nanograms per microliter. Meng gelijke volumes van de verdunde wild-type en getarget DNA-monsters. Vul de putjes van een 96-well PCR-plaat met negen microliters van een 29 op één mengsel van gedeïoniseerd formamide en een kleurgemarkeerde groottestandaard en één microliter van de gemengde amplicons.Sluit de plaat stevig af en verhit de monsters gedurende drie minuten bij 95 °C met een PCR-thermocycler. Koel de plaat direct na het verhitten drie minuten op ijs. Voer capillaire gelelectroforese uit met een genetische analyzer.Nadat de elektroforese is voltooid, importeert u de gegevens in de analysesoftware en plot u de gegevens. Verifieer de kwaliteit van de groottestandaard door de gegevens in hetdesbetreffende kleurkanaal te beoordelen. Exporteer vervolgens de waarden van het kleurkanaal voor de niet-getargete wildtype-controles en de getargete klonen in txt-formaat.Importeer vanuit dit bestand de kleuridentificaties, bestandsnamen van monsters, fragmentgroottes en piekhoogtewearden in een spreadsheetprogramma. Bereken voor elk monster het verschil in fragmentgrootte tussen de doelgericht gekloonde variant en de niet-doelgerichte wildtypecontrole. Identificeer de klonen met indel-mutaties die geen veelvouden zijn van drie basenparen.Breid de geselecteerde klonen uit door middel van seriële passage vanuit de opgeslagen replicaten. Voer Sanger-sequencing en western blot-analyse uit om de genotypes van de klonen te bepalen en de knockout-status van de klonen te verifiëren. De hepatocellulaire carcinoom-cellijn HEPG2 werd getarget met een CRISPR/Cas9-construct tegen het Nap1L1-gen.De niet-getargete wildtype-allelen en de CRISPR/Cas9-getargete allelen werden PCR-geamplificeerd met primers die respectievelijk zijn gelabeld met groene en blauwe fluorforen. Door gebruik te maken van een specifiek geoptimaliseerd fluorescent PCR-protocol werden de amplicons van de getargete klonen met een goede opbrengst verkregen. Er werd geen interferentie waargenomen tussen de groene en blauwe fluorescente kleurstoffen binnen monsters van individuele klonen.Analyse van de fragmentgroottes, bepaald via capillaire gelelektroforese, onthulde de deletie van één en 10 basenparen in de twee hier getoonde klonen. De resultaten van de Sanger-sequencing waren consistent met de analyse via capillaire gelelektroforese. Western blot-analyse bevestigde dat de geselecteerde klonen geen NAP1L1 tot expressie brachten.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de monsters zorgvuldig te labelen, aangezien er veel monsters betrokken zijn, en om de blootstellingstijd van de met fluorofoor gelabelde amplicons te minimaliseren omdat deze lichtgevoelig zijn. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals kwantitatieve RT-PCR, western blot-analyse en Sanger-sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de genen van belang volledig zijn uitgeschakeld. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe CRISPR/Cas9-geïnduceerde mutante klonen op een high-throughput manier kunnen worden genotypeerd met behulp van fluorescente PCR gekoppeld aan capillaire gelelektroforese.

using-fluorescent-pcr-capillary-gel-electrophoresis-technique-to

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Een protocol voor snelle CRISPR/Cas9-gemedieerde gene verstoring van muis en mens primaire hematopoietische cellen wordt beschreven in dit artikel. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins worden ingevoerd via electroporation met sgRNAs gegenereerd via in vitro transcriptie en commerciële Cas9. Hoge bewerken rendementen worden bereikt met beperkte tijd en de financiële kosten.

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Directe levering van voorgemonteerde Cas9/gids RNA RiboNucleoProteïne-complexen is een snel en efficiënt middel voor genoom bewerking in hematopoietische cellen. Hier gebruiken we deze aanpak om een RUNX1 intronic geluiddemper te verwijderen en de transcriptionele responsen in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken.

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

Dit manuscript beschrijft een genoom-schaal celgebaseerde screening benadering om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren.

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

Leer een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor high-throughput genotypering van CRISPR/Cas9 knockout mutanten. Deze methode biedt een kosteneffectief alternatief voor sequencing in genetisch onderzoek.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format (Video) | JoVE Journal

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

Meer video's verkennen