Elektrofysiologische analyse van humane Pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hPSC-CM's) met behulp van multi-elektrode arrays (MEA's)

Het algemene doel van deze procedure is om cardiomyocyten die zijn afgeleid van humane pluripotente stamcellen te scheiden en ze op multi-elektrode arrays te plaatsen om de duur en de frequentie van hun typische elektrische signaal, ook wel het veldpotentiaal genoemd, te meten en te kwantificeren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld te beantwoorden, zoals wat zijn de elektrofysiologische verschillen tussen cardiomyocyten met mutaties en controles. Het grote voordeel van deze techniek is dat het medicijnscreening op humane cardiomyocyten mogelijk maakt die zijn afgeleid van patiëntcellen.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Aangezien de dissociatie- en plateringsstappen essentieel zijn voor een succesvolle opname van elektrische signalen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de identificatie van goede of slechte kwaliteit elektrische signalen niet triviaal is en de analyse van vrij potentiaal ervaring vereist.

Om deze procedure te beginnen, plaatst u de schone chips in een standaard steriele plastic petrischaal met een diameter van 10 centimeter. Voeg vervolgens acht milliliter sterieel gedestilleerd water toe aan de petrischaal om een bevochtigde kamer te vormen die voorkomt dat het kleine volume kweekmedium op de chip uitdroogt wanneer het in de incubator wordt geplaatst. Gebruik vervolgens op maat gemaakte PolyTetraFluoroEthylene-ringen om ervoor te zorgen dat de cardiomyocyten in het midden van de chip worden geplateerd waar de elektrode-array zich bevindt.

In de kweekkap verwijdert u de ringen van de ethanol. Plaats ze in een steriele petrischaal zonder deksel en laat de ringen in de kap drogen. Plaats vervolgens een droge ring in een MEA-chip met behulp van vlamgesteriliseerde pincetten.

Bekleed de elektroden door 50 microliter van 40 microgram per milliliter fibronectine in de ring toe te voegen. Bedek vervolgens de petrischaal met het deksel en breng de schaal met de MEA-chip voorzichtig over in een incubator. Breng vervolgens de schaal met de MEA-chip over in de celkweekkap.

Voordat u de MEA-chip gebruikt, aspireert u 50 microliter fibronectin met behulp van een P200 pipette of een vacuümsysteem in de kap zonder de PTFE-ring te verplaatsen. Zorg ervoor dat geen vaste objecten de elektroden raken door de punt schuin te houden. Voeg vervolgens voorzichtig 950 microliter LI-BPEL-medium toe en zorg ervoor dat het gelijkmatig verdeeld is en dat de ring niet drijft.

Vervolgens brengt u de schaal terug naar de incubator. Dit is de eerste kweek van de kloppende cardiomyocyten. In een weefselkweekkap, aspireert u het medium van de hPSC-CMs kweekput.

Voeg een tot twee milliliter PBS zonder calcium en magnesium toe aan elke put om de kweek te wassen en aspireer de PBS. Voeg vervolgens 500 microliter van het dissociatie-enzym toe aan elke put. Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij 37 graden Celsius.

Na vijf minuten voegt u een milliliter LI-BPEL toe aan elke put om het enzym te verdunnen. Los de monolaag van hPSC-CMs op door ze voorzichtig te krabben met een P1000 pipet. Verzamel vervolgens de celsuspensie in een buis van 15 milliliter.

Spoel vervolgens de put met een milliliter LI-BPEL om alle resterende cellen en celklompjes te verzamelen. Voeg nog eens twee tot drie milliliter LI-BPEL toe om een ​​totaal volume van ongeveer vijf tot zes milliliter te bereiken en pipet gedurende drie tot vijf keer voorzichtig op en neer met een pipet van vijf milliliter om celklompjes te scheiden. Centrifugeer vervolgens de cellen bij kamertemperatuur gedurende drie minuten bij 300 keer g.

Verwijder daarna het supernatant zonder de celpellet te verplaatsen. Resuspendeer vervolgens de celpellet in 250 microliter LI-BPEL. Distribueer vervolgens 50 microliter celsuspensie per MEA door de celsuspensie direct in het midden van de PTFE-ring bovenop de elektrode-array te pipetten.

Breng de MEA's voorzichtig over naar de incubator bij 37 graden Celsius en laat de cellen een nacht lang aanhechten. Een dag na het plateren, verwijdert u voorzichtig de ring in een steriele omgeving met behulp van steriele pincetten. Spoel de ring in 80 procent ethanol.

En bewaar deze in een buis van 50 milliliter die 80 procent vers ethanol bevat. Verwijder vervolgens voorzichtig 500 microliter medium van de MEA-chip. En voeg 500 microliter vers LI-BPEL eraan toe.

Dit zijn de kloppende cardiomyocyten na het verwijderen van de ring. Breng vervolgens de MEA's over naar de incubator bij 37 graden Celsius. Meet vervolgens de elektrische activiteit van hPSC-CMs op MEA's, beginnend vanaf een dag na het verwijderen van de ring en tot een week.

Start nu de softwaresuite die is gekoppeld aan de MEA-setup. Stel vervolgens de temperatuur in op 37 graden Celsius in TCX-Control om de metingen op te nemen. Verwijder daarna de schaal met de MEA-chip uit de incubator.

Haal de MEA-chip uit de schaal en leg hem op een tissue om de resterende water te absorberen. Veeg voorzichtig de externe context van de plaat af met een tissue en maak hem schoon met een wattenstaafje dat is bevochtigd met 100 procent ethanol om eventueel resterend water of puin dat signaalruis kan veroorzaken te verwijderen. Breng vervolgens de MEA-plaat over naar een opnamehoofdstad van 37 graden Celsius om spontane activiteit te detecteren.

Open MC Rack en klik op bewerken om de MEA-hardware te laden. Gebruik het vervolgkeuzemenu bewerken om verschillende recorder en weergavevensters toe te voegen aan het protocol. Start vervolgens het protocol in de afspeelmodus door op de afspeelknop te klikken.

Als de signalen zichtbare R-pieken en T-pieken vertonen, wacht u 10 tot 15 minuten om de aanpassingsfase te voltooien. Om het experiment te starten, klikt u op opnemen en vervolgens op afspelen en verzamelt u gedurende 10 minuten gegevens onder basislijncondities om de stabiele toestand te bepalen. Annoteer de elektroden die het beste signaal hadden, zodat ze later gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en geëxporteerd voor analyse.

Voor een beoordeling van de medicijnrespons, voegt u elke 10 minuten toenemende