Name: Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Leer multiparameter fluorescentie-immunohistochemie voor T-celsubpopulaties in orofaryngeaal plaveiselcelcarcinoom. Deze methode visualiseert meerdere biomarkers tegelijk voor prognostisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Simone Punt werd ondersteund door subsidie ​​UL2010-4801 van de Nederlandse Kankervereniging. Wij bedanken alle co-auteurs van het originele papier dat dit JoVE-protocol is gebaseerd op: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter en Sjoerd van Der Burg.

Patientmonsters werden behandeld volgens de medische ethische richtlijnen die zijn beschreven in de Gedragscode voor Proper Secondary Use of Human Weefsel van de Nederlandse Federatie Biomedische Wetenschappelijke Verenigingen (www.federa.org). 1. Maak een dia op <ol><li> Verkrijg geresecteerd weefselmateriaal (elke vorm van weefsel) van een pathologie afdeling na het verkrijgen van medische ethische commissie toestemming om gereserveerd materiaal te gebruiken. OPMERKING: Voor het huidige experiment werden voorbehandelde tumormonsters verkregen uit primaire orofaryngeale tumoren gediagnosticeerd in het Leids Universitair Medisch Centrum Leiden, Nederland tussen 1970 en 2011, geselecteerd zoals eerder beschreven (n = 162) 13 . De grootte van het weefsel was slechts beperkt door de vereiste voor een voldoende hoeveelheid tumorweefsel om op een betrouwbare manier 4 microscopische beelden in de tumor te nemen. </li><li> Bevestig het weefsel in 4% gebufferde formaline gedurende minimaal 12 uur. Verwijder het weefsel in agRaded-serie ethanol. Was het in xyleen en plaats het in paraffinewas met behulp van een geautomatiseerde weefselprocessor. </li><li> Snijd 4 μm dikke formaline-vast, paraffine-ingebedde (FFPE) weefselsecties op glazen glijbanen met behulp van een microtome. Plaats het weefselblok in de microtonweefselhouder met behulp van standaardprocedures. <ol><li> Snijd linten van weefsel en leg ze op de oppervlakte van een waterbad met gedeïoniseerd water bij 45 ºC. Gebruik een glijbaan die geschikt is voor immunohistochemische kleuring om een ​​gedeelte uit te vissen door de glijbaan direct in het water in het water te plaatsen. Zet de glijbaan voorzichtig omhoog, neem de sectie uit het water en steek het op de glijbaan. </li></ol></li><li> Laat de glijbanen overnacht drogen bij 37 ° C. </li><li> Deparaffinize de FFPE glijbanen door ze volledig in vers 100% xyleen te dompelen, drie keer voor 5 minuten elk. Rehydrateer de glijbanen door ze gedurende 5 minuten elk twee keer in verse 100% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol te onderdompelen. </li></ol> 2. Voer Antigen Herwinning <ol><li> Was de glijbanen in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten. </li><li> Voorverhit Tris-ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) buffer (10 mM Tris plus 1 mM EDTA, pH 9,0) tot kooktemperatuur met behulp van een magnetron. Voer antigeenherriepen door de dia&#39;s in de voorverwarmde EDTA-buffer te onderdompelen en de buffer bij deze temperatuur gedurende 10 minuten in de magnetron te houden. OPMERKING: Elke magnetron met een vermogen van 900 W kan gebruikt worden. </li><li> Laat de glijbanen gedurende 2 uur in de buffer afkoelen. </li></ol> 3. Slijpvliesbladen <ol><li> Was de slides tweemaal met 5 minuten fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Teken een cirkel rond het weefsel met een hydrofobe pen om te voorkomen dat de verdunde antilichamen van de glijbaan morsen. Wassen opnieuw met PBS; Dit is optioneel. </li><li> Incubeer het weefsel met primaire antilichamen (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 en anti-IL-17 1:50) verdund in 1% w / v runder serum aLbumine (BSA) in PBS bij kamertemperatuur overnacht. OPMERKING: Het volume per dia hangt af van de grootte van het weefsel, maar het is gewoonlijk 50 - 150 μL. Vervang de primaire antilichamen met antilichamen van dezelfde isotype-klasse met een onbekende specificiteit voor de negatieve controle-glijbanen bij dezelfde verdunning als de CD3-, CD8- en FoxP3-antilichamen ( dwz konijn Ig-isotype controle antilichaam, IgG1 isotype controle antilichaam en geiten IgG isotype controle antilichaam). </li><li> Was de glijbanen driemaal met PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Incubeer het weefsel met een combinatie van fluorescent gemerkte secundaire antilichamen die de primaire antilichaamsproducten en / of isotypen richten ( dwz 1: 200 ezel anti-geiten IgG Alexa 488, ezel anti-konijn IgG A546 en ezel anti-muis A647) verdund in 1% BSA in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. OPMERKING: Het volume per dia hangt af van de grootte van het weefsel, maar is typisch 50-150 μl. <ol><li> NaVoeg het secundaire antilichaam toe, houd de dia&#39;s zoveel mogelijk tegen het licht beschermd door ze in een donkere doos op te slaan of door de doos in aluminiumfolie te verpakken. </li></ol></li></ol> 4. Tissue Slides monteren en tegenwerken <ol><li> Was de slides drie keer in PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Monteer de glijbanen met behulp van een waterig anti-fade montage medium met een nucleaire tegenstaining ( bijv. DAPI). Analyseer de glijbanen zo snel mogelijk met behulp van een fluorescerende microscoop (binnen twee weken). Bewaar de glijbanen in het donker bij 4 ° C tot analyse. </li></ol> 5. Analyseer Gebleekte Weefsel Slides <ol><li> Verkrijg vier afbeeldingen van elke dia met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20 - 25X objectief. Neem afbeeldingen op willekeurige plaatsen in het totale tumorgebied dat in de dia is opgenomen om een ​​representatieve fractie van de tumor vast te leggen. OPMERKING: een standaardvergroting van 250x moet worden gebruikt. Enige fluorescerende oR laserscanningsmicroscoop kan worden gebruikt, mits het de filters en lasers heeft die nodig zijn om de gebruikte fluorochromen te visualiseren. <ol><li> Voor visualisatie van Alexa 488, gebruik een excitatie maximum van 490 en een emissie maximum van 525; Voor visualisatie van Alexa 546, gebruik een excitatie maximum van 556 en een emissie maximum van 573; Voor visualisatie van Alexa 647, gebruik een excitatie maximum van 650 en een emissie maximum van 665; En voor visualisatie van DAPI, gebruik een excitatie maximum van 358 en een emissie maximum van 461. </li><li> Sla de afbeeldingen op als beeldbestanden ( dwz jpeg en tiff) in de software die beschikbaar is voor de gebruiker. </li></ol></li><li> Discrimineren tussen tumorepitheel- en tumorstroma-gebieden op basis van de nucleaire en cellulaire vormen van tumorepitheel versus stromale cellen na raadpleging van een patholoog. <ol><li> Om het totale stromale oppervlak te bepalen, teken een lijn rond alle door de stromale cellen (in plaats van tumorcellen) bezet gebied (en) en recorD het oppervlak gebruiken met behulp van de beeldanalysesoftware die door de microscoopfabrikant wordt geleverd. <ol><li> Klik op het tabblad Overlay onder de afbeelding; Kies de vorm &quot;Closed Poly-line&quot; en klik erop. Beperk de grens tussen tumorepitheliale en stromale velden door het gebied rond te klikken tot u het eerste punt weer bereikt. Dit geeft een maatregel voor dat gebied. OPMERKING: Nadat de vorm is gesloten, verschijnt er een nummer naast de vorm die het oppervlak van het geselecteerde beeld omringt (A = x μm 2 ). </li></ol></li><li> Trek deze oppervlakte af van het totale beeldoppervlak (in beeldeigenschappen) om het epitheliale oppervlak te berekenen. Exclusief vasculaire, necrotische en autofluorescerende gebieden door een lijn rond hen te tekenen, de grootte van het voorziene gebied op te nemen en af ​​te trekken van het epitheliale oppervlak. </li><li> Sla alle oppervlaknummers op in een spreadsheetbestand om de gemiddelde oppervlakten en de berekeningen te berekenenCeltallen per dia. </li><li> Bepaal met behulp van de beeldanalysesoftware of de cellen single-, double- of triple-positief zijn door de fluorescentie van alle vier kanalen te controleren. <ol><li> Tel de single-, double- en triple-positive cellen in elke afbeelding met behulp van ImageJ. <ol><li> Download ImageJ. Open een afbeelding door op &quot;File&quot; en &quot;Open&quot; te klikken en de te analyseren afbeelding te selecteren. Klik met de rechtermuisknop op het &quot;Point Tool&quot; (een rood vierkant in het midden van vier lijnen) en selecteer het &quot;Multi-Point Tool.&quot; Dubbelklik op het &quot;Multi-Point Tool&quot; en tel het aantal verschillende celtypen in de afbeelding door een ander tellernummer voor elk celtype te selecteren. OPMERKING: Tel alle cellen van elk ander celtype, zoals aangegeven door de aanwezigheid van een, twee of alle drie fluorescerende kleuren. Sluit DAPI uit, aangezien deze nucleaire tegenstamper aanwezig is in alle cellen en gebruikt wordt om tumorcellen van immuuncellen te discrimineren. Elk celtype wordt geteldMet een ander tellernummer. Tel de celgetallen van elk celtype afzonderlijk in de tumorepitheliale en stromale gebieden door telkens een ander tellernummer te kiezen. Tellen geen cellen binnen bloedvaten en grotendeels autofluorescerende gebieden. </li><li> Noteer het aantal cellen dat in elke teller voor elke afbeelding in een spreadsheetbestand is geanalyseerd. </li><li> Verdeel het totale aantal cellen voor elk celtype over het totale oppervlak van tumorepitheel en tumorstroma geanalyseerd. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. Statistische analyse OPMERKING: Alle statistische analyses moeten worden besproken met een statisticus om de kwaliteit van de gegevens te verzekeren. Voor algemene statistieken gebruik een medische statistische handleiding 14 . <ol><li> Test de correlaties tussen celfrequenties met behulp van een Spearman&#39;s rangcorrelatie rho-test. </li><li> Test de statistische verschillen in de aantallen positieve celLs tussen patiëntengroepen met behulp van de Wilcoxon Mann-Whitney test. </li><li> Test de correlaties tussen celtallen en ziektevrije overleving ( dwz tijd van diagnose tot lokale of verre herhaling van dood of ziekte) door de patiënten in groepen te verdelen op basis van een aantal cellen met behulp van de Kaplan-Meier-curve generatie en log Ranganalyse 15 . </li><li> Voer multivariate analyses uit met behulp van Cox proportionele hazard regressie analyse. </li></ol>

<ol><li>Westra, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+face+of+head+and+neck+cancer+in+the+21st+century%3A+the+impact+of+HPV+on+the+epidemiology+and+pathology+of+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Pathol%22%5BJournal%5D)">The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer.</a> Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).</li>
<li>Rietbergen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+detection+and+comorbidity%3A+critical+issues+in+selection+of+patients+with+oropharyngeal+cancer+for+treatment+De-escalation+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials.</a> Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).</li>
<li>Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+immune+parameters+in+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers.</a> Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).</li>
<li>Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+regulation+of+human+Th17+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity.</a> Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+of+pancreatic+cancer-infiltrating+T+lymphocytes+reveals+that+ENO-specific+Tregs+accumulate+in+tumor+tissue+and+inhibit+Th1%2FTh17+effector+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+regulatory+T+cells+%28Treg%29+regulating+in+cancer+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?</a> Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angels+and+demons%3A+Th17+cells+represent+a+beneficial+response%2C+while+neutrophil+IL-17+is+associated+with+poor+prognosis+in+squamous+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer.</a> Oncoimmunology. 4 (1), e984539(2015).</li>
<li>Bamias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+differences+of+lymphocytes+isolated+from+ascites+of+patients+with+ovarian+cancer+compared+to+blood+and+tumor+lymphocytes.+Association+of+CD3%2BCD56%2B+cells+with+platinum+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance.</a> Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).</li>
<li>Gasparoto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma+are+characterized+by+increased+frequency+of+suppressive+regulatory+T+cells+in+the+blood+and+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).</li>
<li>Jordanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I%2C+MHC+class+I+chain-related+molecule+A%2C+and+CD8%2B%2Fregulatory+T-cell+ratio%3A+which+variable+determines+survival+of+cervical+cancer+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?</a> Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).</li>
<li>van Esch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+classical+and+nonclassical+HLA+expression+in+recurrent+and+progressive+HPV-induced+usual+vulvar+intraepithelial+neoplasia+and+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).</li>
<li>Heeren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+effect+of+different+PD-L1+expression+patterns+in+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+of+the+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix.</a> Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).</li>
<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beneficial+tumor+microenvironment+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+is+characterized+by+a+high+T+cell+and+low+IL-17%28%2B%29+cell+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency.</a> Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).</li>
<li>Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirkwood%2C+BR+%22Essential+Medical+Statistics%22">Essential Medical Statistics</a>. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).</li>
<li>Kleinbaum, D. G., Klein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinbaum%2C+DG+%22Survival+Analysis%3A+A+Self-Learning+Text%22">Survival Analysis: A Self-Learning Text</a>. , 2nd ed, Springer. (2005).</li>
<li>Fabre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Tumor+Microenvironment%3A+The+Protumor+Effects+of+IL-17+Related+to+Cancer+Type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type.</a> Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen commercieel of financieel belangenconflict.

Voor het beschreven protocol is een van de meest kritische stappen om de juiste verdunning van de gebruikte primaire antilichamen te bepalen. De verdunning van de gemerkte secundaire antilichamen was 1: 200, zoals aanbevolen door de fabrikant van deze specifieke Alexa-gemerkte antilichamen. De verdunning van de primaire antilichamen moet dan worden bepaald door een seriële verdunning, bij voorkeur met gebruikmaking van twee verschillende monsters van het beoogde weefseltype (in dit geval OPSCC). De optimale werkverdunni...

Orofaryngeale plaveiselcelcarcinomen (OPSCC&#39;s) zijn een heterogene groep van plaveiselcellencankers die afkomstig zijn uit de orofarynx. Risicofactoren voor OPSCC omvatten humane papillomavirus (HPV) infectie en alcohol en tabak gebruik 1 , 2 . De rol van het immuunrespons en hoe dit in een klinische omgeving gebruikt wordt, wordt net begonnen te worden onderzocht. De tumor micro-omgeving wordt geïnfiltreerd door immuuncellen die aangetrokken zijn tot de kankerplaats. Hoewel een hoge CD8 + cytotoxische T-celfrequentie is gecorreleerd met verbeterde overleving bij OPSCC-patiënten 3 , is de rol van andere T-cel subsets, waaronder Tregs en Th17 cellen, nog steeds onduidelijk 4 . Terwijl Th1 en Th17 cellen moeten helpen bij de immuunrespons gericht op tumorcellen, zijn Tregs bekend om hun vermogen om de activiteit van andere T-cellen 5 te onderdrukken. Echter, de aanwezigheid van TRegs is gebleken te correleeren met zowel gunstige als ongunstige reacties in verschillende tumor typen 6 . Aangezien niet alle immuuncellen in het bloed aanwezig zijn, infiltreert de tumor in dezelfde mate, het bestuderen van de lokale tumor micro-omgeving biedt de meest betrouwbare maatregel van de immuunrespons gericht tegen de tumor. Het doel van deze studie is om de correlatie tussen de aantallen en typen immuuncellen en de klinische uitkomst te bepalen. We gebruikten vier kleuren fluorescentie IHC imaging om het aantal en lokalisatie van verschillende T-cel subpopulaties in menselijke OPSCC te analyseren. We richten ons op totale T-lymfocyten (CD3 + ), Th17-cellen en immunosuppressieve FoxP3 + Tregs, waarvan de differentieringsweg nauw verwant is aan Th17-cellen. Th17 cellen worden gekenmerkt door de combinatie van CD3 en IL-17. Het cytokine IL-17 kan ook worden geproduceerd door niet-T-cellen 7 . We bepalen de verdeling van intra-epitheelHeliale en stromale T-cellen, Tregs, Th17 en IL-17 + niet-T-cellen in een grote reeks OPSCC-gevallen en analyseerde de correlaties met de overleving van de patiënt. Multicolor fluorescentie IHC werd gebruikt om de expressie van CD3, Foxp3 en IL-17 te identificeren, in combinatie met een DAPI-tegensterkte. Deze analyse is toegestaan ​​voor de makkelijke en duidelijke identificatie van beide tumorcellen (met behulp van DAPI nucleaire kleuring) en de infiltrerende T-celpopulaties (met behulp van een combinatie van verschillende markers). Na de voorbereiding en het kleuren van de monsters werden een fluorescerende microscoop en beeldsoftware gebruikt om de verschillende fluorescerende kleuren te gebruiken en het aantal en type cellen die aanwezig zijn in zowel het tumorepitheel als het tumorgeassocieerde stroma te bepalen. Een alternatieve analyse om de immuuncellenpopulaties te kwantificeren en fenotype is flowcytometrie analyse of cytometrie op basis van de tijd van de vlucht (CyTOF) analyse van tumor of perifere monsters (dat wil zeggen bloed of ascites). Hiermee gebruik makenTechniek, alle informatie over lokalisatie en relatieve verdeling van de verschillende celtypes is verloren. Het gebruik en de analyse van perifere monsters geeft ook geen informatie over welke cellen de tumor micro-omgeving kunnen infiltreren. Bloed- en ascite immuun-celanalyses zijn aangetoond dat het fenotype en de frequentie van immuuncelinfectie van het tumorweefsel 8 , 9 niet weerspiegelen. Een ander alternatief is het gebruik van heldere veld microscopie. Een voordeel van deze techniek over fluorescentie beeldvorming is de afwezigheid van weefsel autofluorescentie. Hoewel sommige monsters meer autofluorescentie bevatten, met name erythrocyten, maar ook andere celsoorten, inclusief neutrofiele granulocyten, kunnen deze gebieden gemakkelijk worden verwijderd in de analyse van bijna alle monsters. Immunofluorescentie biedt het voordeel om meerdere markers in één monster te analyseren door gebruik te maken van een paneel gerichte fluoresceerNt golflengten. Dit is momenteel onmogelijk in dezelfde mate voor lichte veldmicroscopie door het gebrek aan voldoende etiketten en in de handel verkrijgbare antilichaam-isotypen voor een bepaald antigeen. De multicolor-fluorescentie-IHC-techniek die hier beschreven is, is in veel verschillende soorten kanker en antilichamen gecombineerd om verschillende immuuncellenpopulaties te bestuderen, evenals tumorceluitgedrukte moleculen, zoals humane leukocytantigenen (HLA) en PD-L1 10 , 11 , 12 . Het protocol is vastgesteld en gevalideerd met behulp van veel verschillende soorten monsters en antilichamen.

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor</td><td>Milestone and Histostar</td><td></td><td>Geautomatiseerde weefselprocessor</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Weefsellootsmachine</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ water</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffine was/Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom weefselhouder</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC zijde</td><td>Dako</td><td></td><td>Weefselschuif</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1.083.821.000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>Verdunning van het vereiste antilichaam titrateren</td></tr><tr><td>Muis IgG1 anti-FoxP3</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>Verdunning van het vereiste antilichaam titrateren</td></tr><tr><td>Geit IgG anti-IL-17</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF-317-NA</td><td>Verdunning van het vereiste antilichaam titrateren</td></tr><tr><td>Konijn Ig isotype controle antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>Gebruik bij dezelfde eindconcentratie als anti-CD3</td></tr><tr><td>Muis IgG1 isotype controle antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>Gebruik bij dezelfde eindconcentratie als anti-FoxP3</td></tr><tr><td>Geit IgG isotype controle antilichaam</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td><td>Gebruik bij dezelfde eindconcentratie als anti-IL-17</td></tr><tr><td>Ezel anti-konijn IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Verdun 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Ezel anti-muis-A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Verdun 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Ezel anti-geit IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Verdun 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>VectaShield met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 confocale laserscanningmicroscoop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objectief</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen Software</td><td>Zeiss</td><td>versie 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss</td><td>versie 4.2.0.121</td><td>Beschikbaar om te downloaden op www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Corp.</td><td>versie 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>versie 1.50i</td><td>Beschikbaar om te downloaden op http://rsb.info.nih.gov/ij.</td></tr></tbody></table>

vier-kleur fluorescentie immunohistochemie van t-cel subpopulations in archival formalin-fixed, paraffine-embedded human oropharyngeal squamous cell carcinoma monsters

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

De vierkleurige fluorescentie immunohistochemie (IHC) techniek is een methode om celpopulaties van belang te kwantificeren, rekening houdend met hun relatieve verdeling en hun lokalisatie in het weefsel. Deze techniek is uitgebreid toegepast om het immuun infiltraat in verschillende tumortypen te bestuderen. De tumor micro-omgeving wordt geïnfiltreerd door immuuncellen die aangetrokken zijn tot de tumorplaats. Verschillende immuuncellenpopulaties hebben gevonden verschillende rollen in de micro-omgeving van de tumor en hebben een andere invloed op het resultaat van de ziekte. Dit manuscript beschrijft het gebruik van multiparameter fluorescentie IHC op orofaryngeale plaveiselcarcinoom (OPSCC) als voorbeeld. Deze techniek kan uitgebreid worden naar andere weefselmonsters en celtypes van belang. In de gepresenteerde studie analyseerden we het intraepitheliale en stromale compartiment van een grote OPSCC cohort (n = 162). We richten ons op totale T-lymfocyten (CD3 + ), immunosuppressieve regulatOry T-cellen (Tregs, dat wil zeggen FoxP3 + ) en T helper 17 (Th17) cellen ( dwz IL-17 + CD3 + ) met behulp van een nucleaire tegensterking om tumorepitheel van stroma te onderscheiden. Een groot aantal T-cellen bleek gecorreleerd te zijn met verbeterd ziektevrij overleving bij patiënten met een laag aantal intratumorale IL-17 + niet-T-cellen. Dit suggereert dat IL-17 + niet-T-cellen kunnen worden gecorreleerd met een slechte immuunrespons in OPSCC, die in overeenstemming is met de correlatie die wordt beschreven tussen IL-17 en slecht overleving bij kankerpatiënten. Momenteel worden nieuwe multiparameter fluorescentie IHC technieken ontwikkeld met maximaal 7 verschillende fluorochromen en zal de nauwkeuriger karakterisering en lokalisatie van immuuncellen in de tumor micro-omgeving mogelijk maken.

Een reeks FFPE-voorbehandelings tumor monsters verkregen uit primaire orofaryngeale tumoren gediagnosticeerd in Leiden University Medical Center, Leiden, Nederland tussen 1970 en 2011, geselecteerd zoals eerder beschreven (n = 162), werd gekleurd met behulp van het beschreven protocol 13 . Eén of vier willekeurige afbeeldingen van elke dia werden geanalyseerd ( Figuur 1 ). Sommige autofluorescente cellen zijn aangegeven, die duidelijk...

Multiparameter fluorescentie immunohistochemie kan worden gebruikt om het aantal, relatieve verdeling en lokalisatie van immuuncellenpopulaties in de tumor micro-omgeving te beoordelen. Dit manuscript beschrijft het gebruik van deze techniek om T-cel subpopulaties in orofaryngeale kanker te analyseren.

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Het algemene doel van dit experiment is om multicolor immunohistochemische visualisatie en telling van verschillende T-lymfocyten subpopulaties uit te voeren in archiefformaline-gefixeerde paraffine-ingebedden weefselsecties van orofaryngeale plaveiselcarcioommonsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van immuno-oncologie, zoals of er een verband bestaat tussen tumorweefselinfiltrerende immuuncel subpopulaties en de prognose van de patiënt. Met deze techniek kunt u verschillende biomarkers in één weefselsectie visualiseren.De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar kankertherapie, aangezien de gelijktijdige evaluatie van meerdere immuuncellen of immuungerelateerde factoren kan helpen bij de stratificatie van patiënten voor specifieke immuuntherapieën. Begin door een microtong te gebruiken om vier micrometer dikke formaline-gefixeerde paraffine-ingebedden weefselsecties te verkrijgen, waarbij de weefselbanden op het oppervlak van een 45 graden celsius gede-ioniseerde waterbad worden gelegd terwijl ze worden verkregen. Om de secties vast te leggen, plaatst u een glazen plaat in het water, direct onder het weefselmonster en beweegt u de plaat voorzichtig onder een hoek omhoog.Deze sectie zal aan het glazen oppervlak blijven plakken terwijl de plaat uit het water wordt gehaald. Na het overnacht drogen van de monsters bij 37 graden celsius, de-paraffiniseer de weefsels met drie totaal 5 minuten durende onderdompelingen in 100% xylol. Wanneer de secties volledig gede-paraffiniseerd zijn, rehydrateer de weefselmonsters met drie dalende ethanolonderdompelingen.Gevolgd door een 5 minuten durende wassing in gede-ioniseerd water. Dompel vervolgens de monsters gedurende 10 minuten in kokend EDTA-buffer in de magnetron en laat de plaatjes twee uur afkoelen in de buffer. Voor het labelen van de antigenen van belang, spoel de monsters met twee 5 minuten durende PBS-wasbeurten.Na de tweede wasbeurt, incubeer de weefsels met de primaire antilichamen van belang verdund in 1% bovien serumalbumine in PBS bij kamertemperatuur, overnacht. De volgende ochtend, spoel de secties met drie 5 minuten durende PBS-wasbeurten en incubeer de monsters met de geschikte secundaire antilichamen verdund in 1% serum in PBS bij kamertemperatuur gedurende een uur. Aan het einde van de incubatie, was de plaatjes drie keer in PBS zoals net gedemonstreerd en monteer de plaatjes met een waterige antifade montagemiddel dat een nucleaire tegensteek bevat.Om de monsters te analyseren, selecteer eerst de 20 tot 25 keer objectief op een fluorescentiemicroscoop en leg vier afbeeldingen per plaatje vast met behulp van de geschikte filters voor de secundaire antilichamen en tegensteek. Sla de afbeeldingen op zodra ze zijn verkregen. Open vervolgens in de juiste beeldanalysesoftware de eerste afbeelding van belang en klik op het overlegtabblad.Selecteer de gesloten polylijnvorm om de grens van het gebied van belang af te bakenen. Wanneer de vorm gesloten is, zal het meetoppervlak verschijnen naast het gebied van belang. Sla alle oppervlaktegegevens op in het spreadsheetbestand om de gemiddelde oppervlakte en geluidsnummers per plaatje te berekenen.Exporteer de afbeelding als een TIFF- of JPG-bestand om in ImageJ te worden geopend. Open vervolgens in ImageJ de eerste afbeelding van belang en selecteer de celteller onder het plug-ins menu. Klik vervolgens op initialiseren, klik op type een en klik op elke cel die als type een is aangewezen.Selecteer een ander type voor elk celtype om het aantal verschillende celtypen in de afbeelding te tellen volgens de fluorochroomexpressie. Noteer ten slotte het aantal cellen dat in elke tellerbak voor elke afbeelding is geanalyseerd in het spreadsheetbestand. In dit representatieve experiment werden vier willekeurige afbeeldingen geanalyseerd uit een reeks formaline-gefixeerde paraffine-ingebedden voorbehandeling tumormonsters verkregen van primaire orofaryngeale tumoren, gediagnosticeerd in het Leids Universitair Medisch Centrum tussen 1970 en 2011, die zojuist zijn voorbereid.In dit experimentele monster werden enkele autofluorescente cellen waargenomen, onderscheiden door hun volledig gele uiterlijk, terwijl negatieve controleplaatjes geen specifieke kleuring vertoonden boven de achtergrondweefselautofluorescentie. Alle tumormonsters bleken geïnfiltreerd te zijn door variërende aantallen fox p3 positieve, CD3 positieve T-cellen, waarbij slechts een kleine T-celsubset IL-17 toonde. Monster van patiënten met een hoog aantal totale infiltrerende CD3 positieve T-cellen laten een trend zien naar een correlatie met een verbeterde ziektevrije overleving vergeleken met patiëntmonsters met een laag aantal T-cellen.Verder is in monsters met een laag aantal IL-17 positieve cellen een hoog aantal totale infiltrerende T-cellen ook gecorreleerd met een verbeterde ziektevrije overleving, wat suggereert dat de effectieve tumorinfiltrerende T-cellen in orofaryngeale plaveiselcarcioom mogelijk gerelateerd zijn aan het lage aantal IL-17 positieve cellen dat aanwezig is. Eenmaal onder de knie, kunnen deze monstervoorbereidingsstappen in anderhalve dag worden voltooid voor maximaal 25 plaatjes per kleuringssessie. Het is erg belangrijk om het monster te de-paraffineren, anders krijg je veel achtergrond.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van pathologie en immunologie. Voor het verkennen van de micro-omgeving voor de lokalisatie van verschillende immuuncel subpopulaties. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u verschillende eiwitten en celtypen in een enkele archiefweefselsectie kunt visualiseren.Vergeet niet dat het werken met silo erg gevaarlijk is, u moet altijd in een stroomkast werken.

four-color-fluorescence-immunohistochemistry-t-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Hier beschrijven we een methode om moleculaire heterogeniteit kwantificeren in histologische secties van tumor materiaal met behulp van kwantitatieve immunofluorescentie, beeldanalyse, en een statistische maatstaf voor heterogeniteit. De methode is bedoeld voor gebruik in klinische biomarker ontwikkeling en analyse.

Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

Een gedetailleerd protocol voor een zes-marker multiplex immunofluorescentie paneel is geoptimaliseerd en uitgevoerd, met behulp van een geautomatiseerde stainer voor meer consistente resultaten en een kortere tijd van de procedure. Deze aanpak kan direct worden aangepast door elk laboratorium voor immuno-oncologie studies.

Geautomatiseerde Multiplex immunofluorescentie paneel voor Immuno-oncologie Studies over formaline-vaste Carcinoma weefsel Specimens

Humaan papillomavirus (HPV) RNA chromogene in situ hybridisatie wordt beschouwd als een van de gouden normen voor actieve menselijke papillomavirus infectie detectie binnen tumoren. Het staat de visualisatie van HPV E6-E7 mRNA uitdrukking met localisatie en semiquantitative evaluatie van zijn signaal toe.

Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose

Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.

Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

In het tijdperk van kankerimmunotherapie is de interesse in het ophelderen van de micro-omgevingsdynamiek van tumoren opvallend toegenomen. Dit protocol beschrijft een massaspectrometrie beeldvormingstechniek met betrekking tot de kleurings- en beeldvormingsstappen, die een zeer gemultiplexte ruimtelijke analyse mogelijk maken.

Uitbreiding van het begrip van de tumormicro-omgeving met behulp van massaspectrometrie Beeldvorming van formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefselmonsters

Het huidige protocol beschrijft een methode van RNA-fluorescentie in situ hybridisatie om de lncRNA's te lokaliseren in menselijke osteosarcoomcellen.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie voor lange niet-coderende RNA-lokalisatie in menselijke osteosarcoomcellen

Dit experimentele protocol beschrijft en optimaliseert een multiplex immunohistochemie (IHC) kleuringsmethode, voornamelijk door de incubatieomstandigheden van eenkanaals antilichamen te optimaliseren en de instellingen van antilichamen en kanalen aan te passen om de problemen van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longkankerweefsels van klinische oorsprong op te lossen.

Multiplex immunohistochemiekleuring voor in paraffine ingebed longkankerweefsel

Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.

Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Leer multiparameter fluorescentie-immunohistochemie voor T-celsubpopulaties in orofaryngeaal plaveiselcelcarcinoom. Deze methode visualiseert meerdere biomarkers tegelijk voor prognostisch onderzoek.

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters (Video) | JoVE Journal

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

Meer video's verkennen