Name: Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer een niet-invasieve impressiecytologiemethode om cellen van het oogoppervlak te isoleren en te immunofenotyperen met flowcytometrie. Deze techniek identificeert T-celsubsets en ondersteunt onderzoek naar oogoppervlakontstekingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Nandini Nallappan en Sharon Yeo bedanken om te helpen met de technische stappen. De studie werd gefinancierd door een Start-Up Grant aan KGC van de Lee Kong Chian School of Medicine, de Nanyang Technologische Universiteit en door een Senior Clinician Scientist Award van het Nationaal Medisch Onderzoeksraad van Singapore van Singapore (NMRC) naar LT (NMRC / CSA / 045/2012) en door een subsidie ​​van het NMRC en beheerd door het National Health Innovation Center aan KGC en LT (NHIC-12D-1409007).

Alle oculaire monsters die in deze studie werden gebruikt werden verzameld uit de Dry Eye Clinic bij het Singapore National Eye Center, goedgekeurd door SingHealth Centralized Institutional Review Board en de Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapore. OPMERKING: Onderwerpen ondergaan klinische tests om de mate van ontsteking en de ernst van de traanstoornis te beoordelen voordat IC werd uitgevoerd. Klinische tests omvatten niet-invasieve traanafbrekingstijd (NI-TBUT) 14 en conjunctival roodheid (hyperemie) 15 , 16 beoordeeld met een diagnostisch instrument, Schirmer&#39;s test 17 , Standaard Patient Evaluation of Eye Dryness (SPEED) vragenlijst 18 en hoornvlies Kleuring 19 . 1. Verzameling van Oculaire Monsters door IC <ol><li> Na het bepalen van de klinische status verdovingDe ogen van de deelnemer door het toepassen van 1 - 2 druppels topical anesthesia, proparacaine hydrochloride, naar de superieure bolletjes conjunctiva en inferior fornix. Wacht tot 4 - 5 minuten voor het steken van de verdoving om af te dragen. </li><li> Verzamel monsters van zowel de nasale en de tijdelijke bolletjes conjunctiva met twee impressie cytologie apparaten. OPMERKING: Eén apparaat wordt gebruikt voor het verzamelen van twee indrukmonsters. Hier werden twee apparaten gebruikt voor het verzamelen van vier indrukmembranen. <ol><li> Plaats het impression cytologie apparaat tangentiaal op de conjunctiva. Druk voorzichtig op de drukknop en houd deze 2 tot 3 seconden ingedrukt. OPMERKING: Het apparaat wordt geleverd met het membraan. Druk wordt automatisch vrijgegeven nadat u op de knop hebt gedrukt. Het duurt slechts enkele seconden om de druk vrij te maken en het apparaat te verwijderen. </li></ol></li><li> Laat het membraan los in een microcentrifugebuis die 1 ml kweekmedium bevat (Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) + 10% foetaal runder serum(FBS) + 1% Penicilline-Streptomycine (Pen Strep)) door een scalpel. </li><li> Isoleren cellen uit het membraan van het apparaat door continu te schrapen gedurende ongeveer 1 minuut met een 10 μL pipet tip. OPMERKING: Het schrapen is voltooid wanneer het oppervlak van het membraan ongelijk wordt. De cijfers van elk membraan zijn variabel (100 - 500 cellen / membraan). Verwerk de monsters binnen 2 tot 3 uur van de collectie. </li></ol> 2. Immunofenotyperende cellen door flowcytometrie <ol><li> Centrifugeer de cellen bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de media te verwijderen. Resuspendeer de celpellet met 50 μL flowcytometriekleuringbuffer (fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) + 0,05% runder serumalbumine (BSA)). </li><li> Vlekcellen met een paneel antilichamen ( bv . CD3 briljante violet (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrine (PE) -A, CD45RO PE-cyaan 7 (PE- Cy7) -A, en levende / dode celmerk 7-ADD) bij kamertemperatuur gedurende 20 - 30 minuten in dedonker. Gebruik antilichamen rechtstreeks uit de voorraad volgens het protocol van de fabrikant. OPMERKING: Gebruik voor de antilichaamconcentratie 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD en 10 μl CCR7-PE. Gebruik perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC&#39;s) om de verschillende concentraties antilichamen te titreren. Voor de titratie moet u de antilichaamconcentratie vermelden die in het protocol van de fabrikant wordt vermeld en gebruik de helft en een kwart van de aanbevolen concentratie. Gebruik de minimale concentratie van antilichamen om te voorkomen dat er overgaat naar andere fluorochroomkanalen. Duidelijke signalen werden waargenomen met de genoemde concentraties van antilichamen. De compensatie werd uitgevoerd door initieel PBMC&#39;s te testen volgens het protocol dat in Williams et al . Genoemd wordt. 20 Voor het testen werden PBMC&#39;s geïncubeerd met dezelfde reeks antilichamen die hier gebruikt worden en gecompenseerd door het vergelijken van enkelvoudige en meervoudige antilichaamvlekken. </li><li> Na de incubatie periOd, voeg 1 ml vlekbuffer aan de buis toe, meng goed en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 450 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in 200 μl kleuring buffer. </li><li> Run monsters op een flow cytometry machine. <ol><li> Voordat u de gegevens verworven kalibreert de flow cytometer kanaal spanningen met cytometer setup en tracking (CS &amp; T) kralen om de data acquisitie op verschillende dagen te normaliseren volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Open de flow-cytometrie-dataverzamelingssoftware, klik op de knop &quot;Instellen &amp; QC&quot;, kies het juiste CS &amp; T-lotnummer, laad de kralen en klik vervolgens op de knop &quot;Start&quot;. </li></ol></li><li> Resuspendeer cellen door de buis voorzichtig te tikken voordat u monsters naar de machine plaatst. Open de gegevensverzamelingssoftware en klik op &#39;Voorbeeld&#39;. Wanneer de drempelwaarde stabiel is, klik op &quot;Acquire&quot;. Controleer het monsterniveau en klik op &quot;Stop&quot; wanneer monsters uitkomen. OPMERKING: Verkrijg 10.000 gebeurtenissen per monster. </li&gt; <li> Na het verwerven van 10.000 gebeurtenissen, genereer een SSC-A en FSC-A dot plot in het werkblad. <ol><li> Klik op de knop &quot;Polygon Gate&quot; en teken een poort (dit is P1) over alle gebeurtenissen met een FSC-A-waarde&gt; 5 x 10 4 om puin uit te sluiten. Klik op de knop Dot plot maken om een ​​nieuw dot plot te genereren, klik met de rechtermuisknop op de dot blot, kies &quot;Properties&quot; om het venster &quot;Plot Editor&quot; te openen en kies dan &quot;P1&quot;. Klik op de FSC-A op de x-as van P1-puntplot, verander het naar CD3-BV510. Teken een &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; om de CD3 + populatie te kiezen en noem het &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li> Klik op de knop &#39;Dot plot&#39; maken om een ​​nieuw dot plot te genereren, klik met de rechtermuisknop op de dot blot, kies &#39;Properties&#39; om het venster &#39;Plot Editor&#39; te openen. Klik op de FSC-A op de x-as van P2-puntplot en verander deze naar 7-AAD. Teken een &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; voor 7-AAD - populatie en kies &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 hier is CD3 +Levende cellen. </li><li> Klik op de knop &#39;Dot plot&#39; maken om een ​​nieuw dot plot te genereren, klik met de rechtermuisknop op de dot blot, kies &#39;Properties&#39; om het venster &#39;Plot Editor&#39; te openen. Klik op de CD3-BV510 op de x-as en de CD4-APCH7 op de y-as van het P3-puntplot. Teken rechthoekpoorten op de boven- en onderkant van het kwadrant en kies respectievelijk &#39;&#39; P4 &#39;&#39; en &#39;&#39; P5 &#39;&#39;. P4 is live CD3 + CD4 + en P5 is live CD3 + CD4 - T cellen. </li><li> Klik op de knop &#39;Dot plot&#39; maken om een ​​nieuw dot plot te genereren, klik met de rechtermuisknop op de dot blot, kies &#39;Properties&#39; om het venster &#39;Plot Editor&#39; te openen. Klik op de CD45RO PE-Cy7 op de x-as en CCR7-PE op de y-as van zowel de P4 als P5 plots. Teken &#39;&#39; Quad Gate &#39;&#39; op deze stip plot. OPMERKING: de bovenste linkerzijde, de rechterbovenhoek, de rechteronderkant en de linkerkant van de linkerkant zijn hier naïeve, centraal geheugen (T CM ), eFfector geheugen (T EM ), respectievelijk terminale gedifferentieerde effector geheugen (T EMRA ) T cellen. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jamaophthalmology/article-abstract/632182">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li>
<li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+conjunctival+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li>
<li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).</li>
<li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li>
<li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li>
<li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li>
<li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://iovs.arvojournals.org/article.aspx?articleid=2150378">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li>
<li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors%3A+review+article%5BTitle%5D)+AND+%22Arq+Bras+Oftalmol%22%5BJournal%5D)">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li>
<li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+of+the+ocular+surface%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li>
<li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+%28IC+score%29+in+patients+with+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li>
<li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li>
<li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph%5BTitle%5D)+AND+%22Cont+Lens+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li>
<li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+ocular+bulbar+redness%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Physiol+Opt%22%5BJournal%5D)">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li>
<li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ocular+Redness+Index%3A+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li>
<li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li>
<li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li>
<li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+tear+syndrome%3A+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li>
<li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Opthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li>
<li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312(2017).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta%2B+T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4%2B+T+cells+increases%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li>
<li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dit is een makkelijke, snelle en minder invasieve techniek die in de klinieken voor de patiënten kan worden gebruikt voor relatief snelle immuunprofielen in tegenstelling tot de conventionele technieken zoals schrapen, zweven, pipetten of absorberend filterpapier 1 , 2 . Een variant van deze techniek wordt al gebruikt in onderzoeksinstellingen 22 . De toekomstige toepassing van de voorgestelde methodologie is voor patiëntstratificatie in klinische studies met oogziekten, met name die welke immunofenotypen vereisen. Een grote uitdaging met deze techniek is de relatief weinig immuuncellen die na het verzamelen van de indruk en het schrapen worden opgehaald. Het totale aantal CD3 + T-cellen die zijn hersteld van vier indrukken per individu, varieerde van ~ 500-1000 cellen. De oculaire monsters werden gewassen voor de flowcytometrie analyse voor een minimaal aantal keren om verder verlies van cel te vermijdens. Kritieke stappen en uitdagingen die binnen het protocol blijven, zijn een efficiënte collectie van oculaire monsters en het juiste schrapen van het membraan om hogere cijfers te bereiken. Desalniettemin is deze beperking onwaarschijnlijk te voorspellen tegen elk specifiek immuunfenotype. Het probleemoplossing dat hier is uitgevoerd om de opbrengst van cellen te maximaliseren was het aantal wasstappen na en vóór de incubatie van antilichamen te verminderen. Er zijn andere beperkingen voor het gebruik van IC. Bij patiënten met ernstig keratiniseerd of fibrosed oculaire oppervlak, zoals in het Steven Johnson syndroom, kan de cellulaire opbrengst zelfs minder zijn dan die in deze studie. Het aandeel van immuuncellen kan veranderen als de monsters worden opgeslagen in plaats van op dezelfde dag geanalyseerd. Het is moeilijk om te voorspellen of bepaalde celtypes meer bestand zijn tegen opslag dan anderen. Vorige studies hebben gemeld verhoogde niveaus van HLA-DR expressie in de conjunctivale epitheelcellen 23 , dus het zou interEsting om de correlatie tussen HLA-DR en niveaus van specifieke immuuncellen te evalueren. Immuuncellen kunnen ook geassocieerd worden met het expressieniveau van chemokines. Deze problemen moeten in toekomstige studies worden aangepakt.

Impressie-cytologie (IC) werd voor het eerst in 1977 uitgevoerd door Thatcher et al . Zij gebruikten een plastic indrukschijf om conjunctivale cellen van patiënten te verzamelen in plaats van andere technieken die op dat moment beschikbaar waren, zoals schrapen, zweven of pipetteren 1 . De huidige techniek van IC gebruikt een absorberend filterpapier 2 om de bulbar en palpebral conjunctiva af te drukken en de meest oppervlakkige laag conjunctivale cellen te verzamelen. Deze cellen, die hun eindfase van differentiatie hebben bereikt, worden continu in tranen gestort 3 . Drie belangrijke populaties van cellen worden gevonden in IC-specimens: epitheelcellen 4 , koppelcellen 3 , 5 en mucosale geassocieerd lymfoïdweefsel , met epithelium geassocieerde effector T-cellen of dendritische cellen 6 . Oculaire oppervlakte cellen in IC samPles kunnen worden geanalyseerd door microscopie, immuun-blotting en reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 7 . Flowcytometrie is recentelijk gebruikt om immuuncellen te analyseren die zijn verzameld door het IC-membraan 8 te schrappen. Interessant is dat IC 6 , 9 gebruikt is om veel oculaire oppervlaktsiektes te evalueren, waaronder keratoconjunctivitis sicca, vitamine A-deficiëntie, cicatricial pemphigoid, atopische ziekte, superieure limbische keratoconjunctivitis, vernal keratoconjunctivitis en epitheliale plaveiselmetaplasia. IC is ook gebruikt voor het evalueren van de invloed van het dragen van contactlenzen, het detecteren van oculaire oppervlakmicrobes en het testen van therapeutische werkzaamheid en tolerantie van therapeutische interventies in longitudinale studies 10 , 11 , 12 . Het medische apparaat (EyePrim) wordt ondersteund door een type polyEthersulfon (PES) 0,2 μm membraan, dat eerder is bekrachtigd voor de techniek van oculaire indrukcycologie met stromingscytometrie (OSIC-stroming) en opent mogelijkheden om longitudinale steekproeven te gebruiken om de ziekteprogressie te monitoren en respons op de behandeling ( bijvoorbeeld de gedetailleerde Analyse van intraepitheliale leukocyten gedefinieerd als vermeende ziekte markers voor progressieve conjunctiva fibrose in mucous membran pemphigoid) 13 . Vroege onderzoekers gebruikten geautoclaveerde PES-filters die handmatige indruk vereisen. Als gevolg hiervan was de opbrengst variabel en afhankelijk van de gebruiker. Het voordeel van dit medisch apparaat is het gebruiksgemak, de gestandaardiseerde druk (Pa of N / m 2 ), en maakt het mogelijk om herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en consistent cellulair herstel te herstellen. Deze techniek is handig in een buitenpatiënt kliniek omdat het niet-chirurgisch, makkelijk te presteren en snel is. Dit is een medisch apparaat van klasse I (steriel) volgens de richtlijn 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Het vereist alleenS actuele verdoving tijdens de procedure, die zorgt voor het behoud van de integriteit van het oculaire oppervlak. Na IC kunnen cellen onmiddellijk worden verwerkt voor flowcytometrie. Bovendien is het mogelijk dat technici en verpleegkundigen die niet in oogheelkunde zijn getraind om het oogoppervlak te proeven. Ondanks de verbetering van IC over andere technieken, blijven er nog enkele uitdagingen. Bijvoorbeeld, er kan variatie zijn door het gebied van de steekproef en regionale verschillen in de bolletjes conjunctiva, afhankelijk van de positie van de IC. Een andere bron van variatie is te danken aan de toepassing van verschillende drukhoeveelheden tijdens IC. Andere methodologische problemen behelzen de standaardisatie van de celverwerking: deze omvatten duur en fixatiemethode en de omstandigheden van mogelijke opslag, die de stabiliteit van het bemonsterde materiaal kunnen beïnvloeden. Het algemene doel van deze techniek is het ontwikkelen van een methode van isolatie van de oculaire indruk monsters thaT is makkelijk te gebruiken, niet invasieve en kan toegepast worden op de immunologische karakterisering van de klinische monsters.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Local Anaesthesia</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium solution</td><td>Bausch &amp; Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Uitrustingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Gleuflamp BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse analysesoftware</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditioneel wordt oculaire oppervlakte cytologie bestudeerd met technieken zoals spateltechnologie en kwasttechnologie. Het probleem met deze technieken is dat ze traumatische letsels op het oppervlak van het oog kunnen veroorzaken, wat kan leiden tot littekens, oogliddeformiteit, limale stamceldeficiëntie en in sommige gevallen een groot ongemak voor het onderwerp veroorzaken. Om deze klinische problemen te vermijden, werd de impressie cytologie (IC) ontwikkeld om de droge oogziekte en later neoplasia, atopische ziekte, vernal keratoconjunctivitis en keratoconjunctivitis sicca te diagnosticeren. Typisch snijden clinici filterpapieren handmatig in de vereiste vormen en toepassen ze op het oculaire oppervlak. Hier beschrijven we hoe u IC met behulp van een in de handel verkrijgbaar medisch apparaat uitvoert. Deze techniek wordt hier verklaard gevolgd door immunofenotyping door flowcytometrie. Deze techniek vereist minder handmatige hantering en veroorzaakt minder letsel op het oculaire oppervlak.

IC door dit klinisch apparaat heeft ons toegestaan ​​om oculaire oppervlak immuuncellen te isoleren, terwijl het oogoppervlak intact blijft. Figuur 1 beschrijft hoe de IC werd uitgevoerd. De verschillende plaatsen van het oog waar de monsters werden verzameld, zijn gemarkeerd. Figuur 2 toont representatief resultaat van stromingscytometrie verzameld uit 10 gezonde controles. Voor de gating, gebruik SSC en 7-AAD om te onderscheiden tussen levende en dode cellen. 7-AAD - cellen worden geïdentificeerd als levende cellen. Deze levende cellen worden verder gekenmerkt door CD3 + en CD4 + markers. Bovendien werden de CD4 + en CD4 populaties verder gekarakteriseerd als Naïve, T EM , T CM en T EMRA met de CCR7 en CD45RO markers. Onder CD3 + T-cellen domineren effectorgeheugen T-cellen in het menselijke oculaire oppervlak. In eerdere eXperimenten, is ook aangetoond dat CD8 + geheugencellen de belangrijkste populaties in de conjunctivale epitheliale T-cellen zijn onder de gezonde personen 20 . Figuur 3 laat zien dat CD4 + en CD8 + effectorgeheugen T-cellen (T EM en T EMRA ) de belangrijkste subset in het menselijke oculaire oppervlak zijn in 10 gezonde controles die zijn onderzocht. Elke populatie die in de figuur wordt genoemd, worden gemeld met hun markerfenotype en namen (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). De cijfers in rood geven het percentage van de bevolking aan. De gegevens in deze figuur zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Figuur 1: Verzameling van IC-monsters van de Oculaire Oppervlakte door het Impression Cytology Device. Monsters werden verzameld uit de tijdelijke gloeilampAr gebied zoals getoond. <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Figuur 2: Dot Plot Graph Using Flow Cytometry. Live 7-AAD - cellen werden geselecteerd. De CD3 + -cellen werden eerst gated, en vervolgens werd deze populatie ingebed in CD4 + en CD4 - subsets. De percentages van naïeve (CCR7 + CD45RO - ), centrale geheugen (CCR7 + CD45RO + ) en effectorgeheugen (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO-) subsets werden bepaald met behulp van CCR7 en CD45RO markers. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FIgure 3: Immuuncel sub-typen in CD4 + en CD8 + T cellen van een gezonde menselijke oculaire oppervlakte. Distributie van conjunctival CD4 + en CD8 + naïeve, centraal geheugen (T CM ) en effector geheugen (T EM en T EMRA ) subsets in gezonde menselijke controles; Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een afzonderlijk individueel gemiddelde ± SEM. Het percentage van de bevolking is gemarkeerd als rood onder de naam van elk van de populaties. Het totale percentage van de bevolking is 98%, omdat de CD4 + T EMRA- populatie niet in de genoemde scatterplot was opgenomen (gewijzigd van Bose et al. 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het blootgestelde normale oculaire oppervlak bestaat uit hoornvlies en conjunctiva. Epitheliale cellen, spekcellen en immuuncellen zijn aanwezig in de conjunctiva. Hier wordt een niet-invasieve techniek van impressie cytologie beschreven met behulp van een impressie cytologie apparaat en flow cytometrie om immuuncellen in de conjunctiva te analyseren.

Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Het algemene doel van deze impressiecytologietechniek is om voldoende cellen te verkrijgen om de cellen die betrokken zijn bij aandoeningen van het botoppervlak immunologisch te fenotyperen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van het botoppervlak, zoals welke immuuncellen belangrijk zijn voor ontstekingen van het botoppervlak. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze relatief niet-invasief is en eenvoudig uit te voeren is in de kliniek en het laboratorium.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van inflammatoire aandoeningen van het oogoppervlak, aangezien het de identificatie van specifieke populaties immuuncellen mogelijk maakt. Deze methode kan inzicht bieden in de immuuncelpopulatie van het oogoppervlak. Daarnaast kan het worden toegepast bij het onderzoek naar okulair toxicologie en okulair fibrose.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege een gebrek aan ervaring bij het hanteren van het geringe aantal cellen dat uit het oog wordt verzameld. Pas, na het vaststellen van de klinische status van de deelnemer, één tot twee druppels lokale anesthesie toe aan de superieure bulbaire conjunctiva en de inferieure fornix van de ogen van de deelnemer. Wacht vier tot vijf minuten totdat het prikkende gevoel van het anestheticum is verdwenen.Plaats vervolgens een apparaat voor impressiecytologie tangentieel op het conjunctiva aan de temporale bulbaire zijde en druk voorzichtig de drukknop twee tot drie seconden in. Laat met een pincet het geoogste bulk aan oculair membraan in een microcentrifugebuis met één milliliter kweekmedium vallen, gevolgd door één minuut continu schrapen van het membraan met een 10 µL pipetpunt om de resterende cellen uit het apparaat te herstellen. Wees voorzichtig bij het schrapen van het membraan, aangezien te veel schrapen zal leiden tot een ophoping van debris, terwijl te weinig schrapen kan resulteren in een laag celrendement.Wanneer het oppervlak van het membraan ongelijk wordt, herhaalt u een tweede collectie uit hetzelfde oog aan de nasale zijde van het oog, zoals zojuist gedemonstreerd. Trek de cellen met de eerste oogmonster-suspensie mee en verzamel twee monsters uit het andere oog van de deelnemer. Centrifugeer de oogcellen binnen twee tot drie uur na collectie en resuspendeer de pellet in 50 µL Flow Cytometry Staining Buffer, bestaande uit fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 0,05% bovine serum albumin.Kleur vervolgens de cellen gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur met een panel van de antilichamen naar keuze, beschermd tegen licht. Was de cellen na afloop van de incubatie met één milliliter kleuringsbuffer en resuspendeer het pellet in 200 microliters verse kleuringsbuffer. Kalibreer de kanaalspanningen van de flowcytometer in het instellingspaneel van de cytometer en stel een buis met tracking beads in om de gegevensverwerving te normaliseren volgens de instructies van de fabrikant.Klik vervolgens in de software voor Flow Cytometrie-gegevensverzameling op Setup QC en kies de juiste Cytometer-instelling en het lotnummer van de tracking-beads. Laad de beads en klik op de Start-knop. Resuspendeer nu de celsuspensie door voorzichtig tegen de buis te tikken en plaats de buis in het apparaat.Open de software voor gegevensverzameling en klik op Preview. Wanneer de Threshold Rate stabiel is, klikt u op Acquire. Houd het monsterniveau in de gaten en klik op Stop zodra het monster op is.Nadat 10.000 events zijn verzameld, genereert u een dot plot van forward scatter area tegenover side scatter area en gebruikt u de polygoon-gate-tool om een gate voor populatie 1 te trekken over alle events met een forward scatter area-waarde groter dan 5 x 10⁴ om detritus uit te sluiten. Klik op 'Create Dot Plot' om een nieuwe dot plot te genereren. Klik met de rechtermuisknop op de plot en kies 'Properties' om het venster Plot Editor te openen.Kies P1 en klik op het gebied van de voorwaartse verstrooiing op de x-as om de weergegeven as te wijzigen naar CD3. Open een nieuwe dot plot voor de P2-populatie en wijzig de x-as naar 7-AAD. Trek een gate rond de 7-AAD-negatieve populatie om de levensvatbare CD3-positieve cellen te selecteren.Noem deze gate P3 en open een nieuwe dotplot. Selecteer in het venster Plot Editor CD3 voor de x-as en CD4 voor de y-as. Gebruik nu de populaties P4 en P5 om twee nieuwe dotplots te openen en stel de x-assen zo in dat ze de CD45RO-positieve cellen weergeven en de y-assen de CCR7-positieve cellen in elke plot.Maak vervolgens een P6-gate rond de CD3-positieve, CD4-positieve, CCR7-positieve, CD45RO-positieve cellen en P7-, P8- en P9-gates rond de CD3-positieve, CD4-negatieve, CCR7-positieve, CD45RO-positieve cellen, de CD45RO-negatieve, CCR7-negatieve, CD4-negatieve, CD3-positieve cellen en de CD45RO-positieve, CCR7-negatieve, CD4-negatieve, CD3-positieve cellen, respectievelijk. De CD4-positieve en CD4-negatieve populaties kunnen worden gekarakteriseerd als CD45RO-positieve, CCR7-positieve centrale geheugen T-cellen en CD45RO-positieve, CCR7-negatieve effector geheugen T-cellen.En CD45RO-negatief, CCR7-negatief, terminaal gedifferentieerde effector memory T-cellen op basis van hun CCR7- en CD45RO-markerexpressie. Van deze subsets zijn de CD4-positieve en CD8-positieve effector memory T-cellen de belangrijkste subpopulatie T-cellen die gewoonlijk op het oogoppervlak van gezonde mensen wordt waargenomen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen twee uur worden voltooid, mits correct uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren hiervan kunnen andere procedures, zoals ELISA, Western blot en andere studies, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de cytokinen en de genen die betrokken zijn bij de signaleringsroute te beantwoorden. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers op het gebied van studies naar het oogoppervlak de verschillende typen immuuncellen evalueren binnen een specifieke patiëntdemografie van belang. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u impressiecytologie uitvoert en hoe u immuuncellen van het oogoppervlak isoleert en verwerkt.

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes a swab-based technique to isolate viable commensal bacteria from the ocular conjunctiva. The technique can be used to profile the commensal bacterial microbiome of the conjunctiva, which plays a defensive role against pathogens.

Swab-based Conjunctival Commensal Bacteria Isolation: A Technique to Isolate Commensal Bacteria from Conjunctiva of Murine Model

In this video, we show a procedure to obtain ocular pigment epithelial cells from a rabbit model. The cells are helpful in developing therapeutic strategies for retinal degenerative diseases.

Isolating IPE and RPE Cells: A Technique for Obtaining Ocular Pigment Epithelial Cells from Rabbit Eye

We hebben cellen verzameld, gekleurd en afbeeldingen gemaakt van de conjunctiva van de binnenrand van het ooglid van menselijke proefpersonen. Door celmorfologie en metabolische activiteit te karakteriseren, kan deze methode ons begrip van droge ogen en de rol die wrijving tussen de oculaire oppervlakken kan spelen bij het waarnemen van oculaire ongemakken, verder verdiepen.

Impressie Cytologie van het deksel Wiper Area

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de muis oogbol met ooglid, oogoppervlak, voorste en posterieure segmenten in relatief intacte positie.

Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en versterking van aerobe en facultatieve anaerobe muisconjunctivale commensale bacteriën met behulp van een uniek oogswab en op cultuur gebaseerde verrijkingsstap met daaropvolgende identificatie door microbiologische methoden en MALDI-TOF massaspectrometrie.

Conjunctivale commensale isolatie en identificatie bij muizen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.

Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

Fenolroodvrij/foetaal runderserumvrij medium is een betere optie dan geavanceerde RPMI om exogene hormonen te elimineren zonder de normale functie van conjunctivale bekercellen te veranderen bij de studie van op geslacht gebaseerde verschillen.

In vitro Methode om op geslacht gebaseerde verschillen in conjunctivale bekercellen te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om de menselijke limbale nichecellen te isoleren en te identificeren.

Isolatie en identificatie van limbale nichecellen

Dit artikel demonstreert de werking en het effect van in vivo confocale microscopie bij de diagnose en behandeling van droge ogen en onderzoekt de toepassing en resultaten van in vivo confocale microscopie om een basis te bieden voor toekomstig onderzoek.

In vivo Confocale microscopie bij de diagnose en behandeling van droge ogen: een focus op beeldvormingsprotocollen en interpretatie

Leer een niet-invasieve impressiecytologiemethode om cellen van het oogoppervlak te isoleren en te immunofenotyperen met flowcytometrie. Deze techniek identificeert T-celsubsets en ondersteunt onderzoek naar oogoppervlakontstekingen.

Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

Meer video's verkennen