Een Chronisch Autoimmuun Droog Oog Rat Model Met Toename In Effector Geheugen T Cellen In Oogappel Weefsel

Het algemene doel van deze procedure is om klinische kenmerken van traanfunctiestoornissen en ontsteking van de traanklier bij ratten te induceren door middel van subcutane immunisatie en subconjunctivale en intralacrimale klierinjectie van extracten van de traanklier voor de beoordeling van therapieën bij auto-immuun droog oog. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen over droog oog te beantwoorden, zoals of geneesmiddelen die T-cellen onderdrukken bij auto-immuunziekten effectief zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tekenen van oculaire ziekte vertoont die vergelijkbaar zijn met menselijk droog oog en ook de T-cellen kwantificeren die de traanklier en het oog binnendringen.

De implicaties van dit diermodel strekken zich uit tot het begrijpen van lymfocyt-traffic omdat milt en lymfeklieren kunnen worden bestudeerd. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege het ontbreken van geschikte instrumenten om veranderingen in het kleine rattenoog te documenteren. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat bepaalde stappen moeilijk te leren zijn vanwege het snelle uitdrogen van het rattenoog en het ontbreken van knikken na anesthesie.

Na het euthanaseren van een vrouwelijke Sprague Dawley-rat volgens het tekstprotocol, plaats het dier plat met één oor tegen de tafel en de andere naar boven gericht. Maak met een schaar een insnijding van 10 millimeter superieur-inferieur onder het blootgestelde oor. Verwijder vervolgens de traanklier door deze te dissecteren uit het omliggende bindweefsel en uit de afvoerkanaal.

Gebruik vervolgens een schaar om het weefsel zo fijn mogelijk op ijs te hakken. Voeg vervolgens 150 microliters PBS met 1X proteaseremmer per traanklier toe. Met de sonicator ingesteld op 10 seconden aan, 10 seconden uit en 30% amplitude, soniceer de monsters op ijs bij 20 kilohertz gedurende vijf minuten.

Centrifugeer vervolgens de gesoniceerde monsters bij 13.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Verdeel vervolgens de supernatant in 1,5 milliliter buizen en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.

Breng compleet Freund's adjuvant met vijf milligram per milliliter Mycobacterium tuberculosis H37Ra of onvolledig Freund's adjuvant over naar een 50 milliliter buis, waarbij u ervoor zorgt dat het volume van het adjuvant tot het antigeenmengsel in een een-op-een-verhouding staat. Voeg het antigeenmengsel met twee milligram per milliliter ovalbumine en 10 milligram per milliliter traanklier extract druppel voor druppel toe aan de adjuvantoplossing terwijl u met de hoogste snelheid klopt die geen morsen veroorzaakt. Blijf vijf minuten kloppen nadat alle antigeen is toegevoegd.

Breng de emulsie over naar een vijf milliliter spuit en gebruik een spuitconnector om deze te verbinden met een andere vijf milliliter spuit. Duw vervolgens de emulsie van de ene spuit naar de andere om het te mengen. Op dag nul verdeel 200 microliters van de emulsie, die één milligram traanklierextract en 200 microgram ovalbumine bevat in compleet Freund's adjuvant, in één milliliter Luer lock spuiten en bewapen de spuiten met 27 gauge naalden.

Injecteer de emulsie zonder anesthesie subcutaan aan de basis van de rattenstaarten. Injecteer vervolgens op dag 14, op een vergelijkbare manier, 200 microliters van hetzelfde antigeen in onvolledig Freund's adjuvant. Op dezelfde dag injecteert u intraperitoneaal 300 nanogram pertussistoxine in 100 microliters PBS.

Op dag 48 weegt u de benodigde hoeveelheid ovalbumine en lost deze op in PBS. Combineer vervolgens ovalbumine met het ontdooide traanklierextract dat eerder in deze video is voorbereid, waardoor een antigeenoplossing ontstaat met een milligram per milliliter ovalbumine en een milligram per milliliter traanklierextract. Nadat u de rat heeft verdoofd, injecteert u vijf microliters antigeen in de forniceale subconjunctiva van het oog.

Injecteer vervolgens 20 microliters antigeen in de traanklier. Terwijl u een verdoofde rat houdt volgens het tekstprotocol, om het traanvolume te meten met fenolrode draad, gebruikt u één paar pincetten om de draad vast te houden en een ander om het onderste ooglid van de rat te trekken. Plaats de draad een minuut lang in de proximale hoek van het onderste fornix en verwijder vervolgens de draad.

Plaats vervolgens de draad naast een liniaal met millimetermarkeringen en neem een ​​afbeelding van de lengte van het bevochtigde deel van de draad. Om de gladheid van de traan op de hoornvlies te meten, plaatst u de rat onder een stereomicroscoop uitgerust met een ringverlichter en een camera. Breng vervolgens vijf microliters zoutoplossing aan op het rattenhoornvlies.

Met gehandschoende vingers, knipper passief door de bovenste en onderste oogleden ongeveer vijf keer te bewegen om de zoutoplossing te verspreiden. Onder 1,6 keer vergroting, focus de ringverlichter op het midden van het hoornvliesoppervlak. Verwerf vervolgens na 10 seconden fotografische beelden.

Gebruik fluoresceïnescanning om schade aan het hoornvlies te meten door twee microliters van 0,2% fluoresceïne toe te voegen aan het rattenhoornvlies. Open en sluit met een gehandschoende vinger passief drie keer de rattenoogleden om de fluoresceïnekleurstof op het oppervlak van het oog te verspreiden. Gebruik na een minuut een drie milliliter spuit om één milliliter zoutoplossing te trekken.

Plaats vervolgens de spuit ongeveer twee tot drie millimeter voor het hoornvlies en breng zachtjes zoutoplossing aan op het oog. Met de achtergrondverlichting uitgeschakeld, verwerf beelden onder de kobaltblauwe filter van een oculaire beeldvormingsmicroscoop. Na het euthanaseren van de rat volgens het tekstprotocol, gebruikt u een schaar om de bovenste en onderste oogleden te verwijderen.

Bevrijd de globe door de extraoculaire spieren, de oogzenuw en de forniceale conjunctiva door te snijden. Maak een incisie om het oogbol te openen. Verwijder de lens in