Name: Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer chirurgische ablatie van planaria-ogen met minimale verstoring van omliggend weefsel. Deze methode ondersteunt onderzoek naar regeneratieprocessen en stamcelbiologie in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Michelle Deochand bedanken voor het perfectioneren van dit oog ablatie techniek, Taylor Birkholz voor hulp met de functionele assay, Michael Levin voor de anti-arrestin antilichaam en Junji Morokuma voor informatie over de Peltier platen. Dit werk werd ondersteund door een SFSA subsidie ​​van Western Michigan University te WSB.

1. Dierlijke Cultuur en Handling Opmerking: In dit protocol wordt Schmidtea mediterranea, een diploïde planarian soort met een genoom gesequenced 16, 17 die gewoonlijk wordt gebruikt voor regeneratie onderzoek. De test is even succesvol bij andere soorten, zoals tijgerplatworm en girardia dorotocephala (die commercieel verkrijgbaar zijn). <ol><li> Handhaven wormen &quot;worm water&quot; van de 0,5 g / l zeezouten in ultrazuiver (of gefilterd gedeïoniseerd) water. Gebruik steriele polypropyleen of glazen containers naar de worm water vast te houden. Zie <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">aanvullend bestand 1</a> voor meer informatie over worm water voorbereiding. LET OP: Gebruik nooit zeep om containers (of andere benodigdheden) als zeep te reinigen is giftig voor wormen; plaats af met 70% ethanol en aan de lucht drogen. &lt;ol&gt; <li> Draag handschoenen tijdens het werken met planaria om hen te beschermen tegen besmetting. LET OP: Worms zijn erg gevoelig voor milieu-toxines en chemicaliën, met inbegrip van zeep, bleekmiddel, shampoo, conditioner, en met de hand lotion. </li></ol></li><li> Huis kolonies in polypropyleen houders, waarbij het deksel gedeeltelijk open gelaten voor luchtuitwisseling bij ~ 20 ° C (kamertemperatuur). Opslag experimentele wormen in beide petrischalen (20 wormen per 100 mm plaat) of niet-behandelde weefsel-kweekplaten (1 worm per putje voor platen met 12 putjes). Om stress te verminderen, houd beide kolonies en experimenten in het donker. LET OP: Colonies mag niet meer dan 500-1000 wormen per liter worm water te hebben. Voor experimenten, laat deksels volledig op zijn plaats, omdat de luchtstroom is ontworpen om in deze gerechten. </li><li> Feed niet-experimentele wormen een keer per week met gepureerde biologisch rundvlees of kip lever door het droppen van puree van een transfer pipet, het plaatsen van druppels van voedsel door de container. Toestaan ​​wormen 2 uur om voedsel te consumeren in dedonker vóór het reinigen out container (zie stap 1.4). Voorafgaand aan gebruik, opslag puree bij -20 ° C voor korte termijn (weken) of -80 ° C voor lange termijn (maanden); do puree niet opnieuw invriezen voor hergebruik (zoals bacteriën kunnen bloeien en schadelijk zijn voor de wormen). OPMERKING: Liver mag geen hormonen of antibiotica bevatten en bij voorkeur niet eerder worden ingevroren. Centrifuge puree voor het invriezen (of vóór het voeren) om lucht te verwijderen en te voorkomen dat voedsel drijven. Voedsel moet zinken naar de bodem van de container. 1 ml puree volstaat 500-1000 wormen. </li><li> Exchange water een keer per week met verse worm water voor zowel de kolonies en experimenten. Colony containers moeten ook naar beneden worden afgeveegd met een ongebleekt papieren handdoek (om slijm resten te verwijderen die val afval) een keer per week voor uitgehongerde wormen, of twee keer per week voor het voeden van wormen (2 uur na het voeden en weer 2 dagen later). Om de biofilm behouden door niet met meer dan 80% van de houder. </li><li> Verplaats wormen tussen de containers (of een operatie Setup) met een transferpipet. Om vrij wormen gehecht aan houderoppervlakken, spuiten water boven / achter de worm om deze uit het oppervlak. zuigen vervolgens de worm in de pipet, terwijl het proberen om de worm in de bodem inch (dunner) gedeelte van de pipet te houden. <ol><li> Backload pipetten met een kleine hoeveelheid van de worm water voordat zuigen ze op. </li><li> Probeer om het water rond de worm te verplaatsen, in plaats van de worm zelf, om te voorkomen dat scheuren soft-bodied wormen door ze aan te raken met de pipet. </li><li> Houd experimentele gerechten vallen, tenzij de overdracht van wormen of het vervangen van water. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding <ol><li> Stop het voeden wormen ten minste een week voorafgaand aan de experimenten. <ol><li> Selecteer wormen die zijn niet gevoed ≥1 week en ten minste 5-7 mm in lengte. Breng de wormen een petrischaal 2/3 met water worm en bevestig worm lengte door er met een liniaal onder de schotel. meten wOrms met volledige uitgeschoven en bewegen. OPMERKING: Tijdens kleiner (5-7 mm) wormen werken beter bij het uitvoeren van latere immunofluorescentie en in situ hybridisatie analyses, grotere wormen (8-10 mm) zijn gemakkelijker om mee te werken - met name bij het leren ablate. </li><li> Zorg ervoor dat de wormen zijn geheel, onbeschadigd en niet recent regenereren. OPMERKING: Regenereren wormen zal veel lichter (of geen) pigment in het hoofd en / of de staart regio in vergelijking met normale wormen. </li><li> Als het uitvoeren van RNAi of farmacologische behandelingen op wormen, doe dat dan op dit moment. Indien wormen werden toegevoerd als onderdeel van de behandeling (zoals voor RNAi), wacht ten minste 7 dagen na de laatste voeding alvorens verder met stap 2.2. </li></ol></li><li> Reinig de werkruimte en dissectiemicroscoop basis met 70% ethanol en laat het dan volledig opdrogen. Zet de schaal van de geselecteerde wormen aan de linkerkant van de scope. Rechts van het toepassingsgebied, plaats een paar # 5 tang, een 31 G 5/16 inch insuline naald met een 1ml spuit en een schone overdracht pipet. <ol><li> Waarborgen dat de instrumenten niet tegen de bank (die verontreinigingen kan voorstellen) worden gehouden. Met een stijf voorwerp (bijvoorbeeld een eetstokje rust) om de tang, naald, pipet en schoon te houden. Als alternatief, plaats instrumenten op de top van een verse bruine (ongebleekt) papieren handdoek. LET OP: Deze en volgende instructies zijn geschreven als ze betrekking hebben op rechtshandig personen. Linkshandige mensen moeten de links / rechts richting te keren. </li></ol></li><li> Naast de werkruimte, plaats een doos met pluisvrij doekje doekjes, een bron van zoet worm water, en een aantal extra pipetten (beschermd tegen de bank boven). Plaats worm water in een plastic spuitfles voor het gemak van doseren. Plaats ook een gelabelde 12-putjesplaat (of 100 mm petrischaal) rechts van de mogelijkheden voor het verzamelen van dieren geablateerd. </li><li> Bij gebruik van een op maat gemaakte Peltier plaat wormen immobiliseren, plaats de Peltier plaat in de holte in tHij onderkant van de dissectiemicroscoop en stel de uitgang van de DC-voeding tot het werkoppervlak van de Peltier plaat voldoende is afgekoeld (gewoonlijk -5 V) .Alternatively, maak een koude plaat vult een 100 mm petrischaal ½ vol met water en vries gedurende ten minste 24 uur. Gooi het deksel en plaats de bodem van de schaal van 100 mm op basis van het ontleden scope en plaats het deksel van een 60 mm petrischaal omgekeerd direct op het oppervlak van het ijs (Figuur 1A). <ol><li> Nadat het water is bevroren in de schaal van 100 mm, een &quot;vulkaan&quot; ijs verschijnen in het midden van de plaat. Als dit gebeurt, gebruik een scheermesje om het ijs vlakke schrapen, om eventuele onregelmatigheden van het oppervlak te verwijderen. LET OP: Tijdens operaties het ijs zal smelten, waardoor ablaties veel moeilijker. Bereid een aantal ijs gerechten op voorhand, en vervang diepvriesproducten voor het smelten van degenen die tijdens de test zodra het deksel van de 60 mm gerecht begint zweven. </li></ol></li><li> Bereid dechirurgie oppervlak. Snijd een 5 cm x 10 cm stuk plastic paraffinefilm (4 cm2 bij gebruik van de petrischaal koude plaat) en plaats het op het midden van de fixeerinrichting. Vouw een pluisvrije tissue wipe in een vierkant ongeveer 2 cm2 en plaatst deze bovenop de film. Snijd een stuk wit filterpapier 1,5-2 cm2 en zet deze boven van het afveegdoekje. Zie Figuur 1B-1E. <ol><li> Houd de gevouwen vegen op zijn plaats met een gehandschoende vinger, en gebruik worm water om licht te dempen het doekje te zorgen dat het blijft gevouwen. Met de zijkant van een transferpipet te rollen het doekje flat. OPMERKING: Cold temperatuur helpt om wormen in beweging te houden. Werken &quot;droge&quot; helpt ook bij immobilisatie. Het weefsel wipe werkt om water opzuigen door het filterpapier, waarbij de worm vochtig tijdens de operatie zonder dat wormen volledig laten drogen (die dodelijk). </li></ol></li></ol> 3. Chirurgische Ablatie <ol><li> Gebruik een transfer pipet om op te plaatsene worm dorsale zijde naar boven op de filter papier. Draai de lichtbron en richt de goosenecks zodat het licht is gericht op de worm. Stel het ontleden scope focus en vergroting, zodat de ogen zijn duidelijk zichtbaar (het hele worm niet hoeft te worden in het oog); 5X vergroting is een goed uitgangspunt. Oriënteren de worm door aan de paraffinefilm zodat de kop gericht is naar de onderzoeker (naar de voorzijde van de microscoop), hoekig 30-40 graden naar rechts. <ol><li> Vermijd het gebruik van felle licht om overtollige worm beweging te voorkomen. Planarians tonen negatieve phototaxis en zal proberen aan fel licht te ontwijken. </li><li> Indien de worm gepositioneerd ventrale zijde naar boven (met faryngeale opening zichtbaar) Gebruik de doffe kant van de tang voorzichtig positie van de worm dorsale zijde naar boven (met de ogen zichtbaar). Vermijd het naderen van het dier met de scherpe punt van de tang om de kans op scheuren door zachte weefsels bij de herpositionering van de dieren zo weinig mogelijk. </li><li&gt; Pas de microscoop scherpstelling zodat de ogen zijn duidelijk in focus. Ook voor zorgen dat zowel de ogen en de omliggende hoofd weefsels in het zicht staan. </li></ol></li><li> Houd een nieuwe naald / spuit in de rechterhand alsof het een pen (tussen duim en wijsvinger). Brace de linker duim tegen de Peltier plaat (of petrischaal koude plaat) en gebruikt de linker duim als een draaipunt, waarop de bodem van de spuit rusten (figuur 2A). Kijk door de microscoop, en zorg ervoor dat de schuine kant van de naald zichtbaar is. LET OP: Naalden zijn erg scherp. Wees voorzichtig bij de omgang met hen. Het dragen van latex of nitril kan enige bescherming bieden. <ol><li> Gebruik de linker duim te helpen houden de naald / spuit stabiel gedurende de procedure en te voorkomen dat handen schudden. </li><li> Maak een hoek van ongeveer 40 ° met de linker duim en linker wijsvinger (met de wijsvinger op de operatie oppervlak) om te helpen houden de operatie oppervlak stabiel. </li></ol></li><li> Metde schuine kant van de naald naar boven gericht (zoals een lepel), plaatst de naald loodrecht op het oog (figuur 2B). Met de punt van de naald subtiel in de dunne laag weefsel boven de optische kop (wit gepigmenteerde gebied) van het oog, scheppen van rechts naar links. Zeer verwijder voorzichtig gepigmenteerde weefsel zich in de optische kop, verzorgen de bodem niet te doorboren en de grenzen van de optische kop te vernietigen. <ol><li> Indien de worm op het filtreerpapier gedurende&gt; 1-2 min is op enig moment tijdens de procedure, één druppel water worm de worm rehydrateren. OPMERKING: Uitdroging zal de gevoeligheid van de worm te verhogen tot scheuren verwondingen. </li></ol></li><li> Herhaal stap 3.3 totdat alle zwart gepigmenteerd weefsels (pigmentcellen), alsook elk van witte weefsels van de optische kop (dendrieten van de fotoreceptor cellen) worden verwijderd. Verwijderen uitgesneden weefsels vast aan het uiteinde van de naald door voorzichtig afvegen met een tissue afvegen. Als dubbele oog ablatie is gewenst ablatie het tweede oog op dit punt. Opmerking: Om verwonding te voorkomen, kunnen naalden worden gereinigd door het grijpen van de naald met een schone tissue wipe gehouden met de duim en wijsvinger, vervolgens met de andere hand de naald te trekken door het wegvegen van de duim en wijsvinger. Als alternatief kan de naald worden geveegd op het oppervlak van een natte tissue wipe en onderzocht op reinheid. </li><li> Wanneer u klaar bent, gebruik maken van een transfer pipet om de worm te verplaatsen naar een gelabeld schaal met vers worm water. Wanneer het analyseren groepsgegevens plaatst tot 20 wormen in een 100 mm petrischaal. Indien het volgen regeneratie in dezelfde individuen de tijd, plaats 1 worm in elk putje van een 12-wells plaat. Zodra alle wormen worden overgebracht, spoel wormen door alle worm water van de borden / putten en te vervangen door meer verse worm water. <ol><li> Wormen uit het filter te verwijderen, backload de pipet met een kleine hoeveelheid water worm en het water vrij op de schroef. Dit moet tillen tHij worm uit het filterpapier onmiddellijk wordt gezogen in de pipet voor de overdracht. </li></ol></li><li> Incubeer experimenten bij ~ 20 ° C (kamertemperatuur) beschermd tegen licht en volg het regeneratieve proces. OPMERKING: Wormen kunnen worden opgeslagen in een thermisch geïsoleerde incubator om een ​​constante temperatuur te handhaven, maar dit is niet strikt noodzakelijk. De meeste kamer temperatuur varieert alleen 5 ° C, die niet van invloed op het vermogen van de worm te regenereren. </li><li> Desgewenst vast wormen voor immunohistochemie (zie figuren 3-4) en / of in situ hybridisatie analyse van genexpressie. Verschillende bevestigingsmethoden aanwezig voor planarian immunohistochemie 18, 19, 20 en in situ hybridisatie 21, 22, 23 protocollen. </li><li> Wanneer experimenten worden gesloten, sacrifice leven wormen door het verwijderen worm water uit de schaal en te vervangen door 70% ethanol. Incubeer wormen gedurende 3-5 minuten, het controleren op wormen lyseren en draai grijsachtig. </li><li> Plaats de niet-behandelde wormen in de normale afvalstroom eenmaal opgeofferd. Voorkomen dat er levende wormen in het milieu, met name niet-inheemse soorten. </li></ol>

<ol><li>Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+planarian+flatworm%3A+an+in+vivo+model+for+stem+cell+biology+and+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration.</a> Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).</li>
<li>Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+enduring+contributions+of+planarians+to+the+study+of+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).</li>
<li>Emili Saló, R. B. Chapter 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmili+Sal%C3%B3%2C+RB+%22Animal+Models+in+Eye+Research%22">Animal Models in Eye Research</a>. Tsonis, P. A. , Academic Press. 15-26 (2008).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dlx+and+sp6-9+Control+optic+cup+regeneration+in+a+prototypic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye.</a> PLoS Genet. 7 (8), e1002226(2011).</li>
<li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+planarian+eye+identifies+ovo+as+a+specific+regulator+of+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration.</a> Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+recovery+of+the+planarian+photosensing+system+during+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration.</a> Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).</li>
<li>Pineda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+network+of+prototypic+planarian+eye+regeneration+is+Pax6+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent.</a> Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).</li>
<li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9 (12), e114708(2014).</li>
<li>Raffa, R. B., Martley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+increase+in+planarian+locomotor+activity+and+block+by+UV+light%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light.</a> Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).</li>
<li>Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-regeneration+transcriptome+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Genome Biol. 12 (8), R76(2011).</li>
<li>Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NuRD+complex+component+p66+suppresses+photoreceptor+neuron+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians.</a> Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).</li>
<li>Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+planarian+eye+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of planarian eye regeneration.</a> Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).</li>
<li>Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regeneration+ability+of+spontaneous+supernumerary+eyes+in+planarians+-eye+regeneration+field+and+pathway+selection+by+optic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves.</a> Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).</li>
<li>Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-like+proteins+in+planarian+eye+and+auricle%3A+detection+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis.</a> J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).</li>
<li>Cross, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Maintenance+and+Regeneration+of+Planarian+Eyes+by+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD+2.0%3A+The+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database.</a> Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).</li>
<li>Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+planar+cell+polarity+extends+neural+growth+during+regeneration%2C+homeostasis%2C+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development.</a> Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cell+type-specific+monoclonal+antibodies+for+the+planarian+and+optimization+of+sample+processing+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling.</a> BMC Dev Biol. 14, 45(2014).</li>
<li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+monoclonal+antibodies+to+study+tissue+regeneration+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians.</a> BMC Dev Biol. 15, 2(2015).</li>
<li>Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+situ+hybridization+protocol+for+planarian+embryos%3A+monitoring+myosin+heavy+chain+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression.</a> Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).</li>
<li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev Biol. 13, 8(2013).</li>
<li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit oog ablatietechniek verbetert de huidige methoden (bijvoorbeeld gaten) door het uitsluiten hersenweefsels en beperken excisie voornamelijk aan de oogweefsels. Met de praktijk, kan deze techniek worden uitgevoerd door de meeste mensen, van technici met ervaring in microsurgeries te onervaren maar gewetensvolle undergraduate studenten. Aanbevolen wordt deze techniek vele malen worden uitgevoerd voor het gebruik in ablaties experimenten, waaronder (indien mogelijk) is bevestigd door volledige verwijdering van alle oogw...

Planarians een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van volwassen stamcellen celgemedieerde regeneratie. Deze niet-parasitaire zoetwater platwormen bezitten het vermogen om alle ontbrekende weefsels, waaronder het centrale zenuwstelsel en de hersenen 1 regenereren. Bestudeerde al in 1700 2, technologische ontwikkelingen op het gebied planarian de afgelopen 10-15 jaar (zoals een gesequenced genoom, in situ hybridisatie, immunohistochemie, RNA interferentie (RNAi) en transcriptomics) hebben deze historische modelorganisme bijgewerkt . In het bijzonder, hebben planarians onlangs steeds populairder geworden als een opkomend model voor oog onderzoek 3. Planarians hebben prototypische ogen met twee weefseltypen de fotoreceptor neuronen en pigmentcellen; Dit is de karakterisering van zijn oog stamcellen populatie ingeschakeld en toonden dat veel van de genen die de vertebrate eyekeling zijn geconserveerd in planarians 4, 5. De optische bekers dorsaal gelegen en uit de witte, ongepigmenteerde dendrieten van de fotoreceptor neuronen en halve maanvormige zwarte pigmentcellen en de ogen innerveren de hersenen via een optische opticum. Naast het feit dat een model voor het ophelderen van regeneratieve processen 6, planarian het oog is geschikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van automomous 7, gedragsreacties licht (planarians weer negatief phototaxis) 8 en de neurologische basis van het gedrag 9. Eye regeneratie planarians is grotendeels bestudeerd in twee situaties: in het kader van kopregeneratie onthoofding na 4, 10, en na excisie van alleen de oogweefsels 11, 12 </sup&gt;. De meeste planarian studies op het oog van de regeneratie hebben de onthoofding methode, want het is eenvoudig en ongecompliceerd. De meest voorkomende planarian oog excisie methode tot nu toe was verbindingsgat buisje met een fijne glazen capillaire buis 13, 14, hoewel sommige studies hebben ook uitgevoerd amputaties net achter de ogen (gedeeltelijke onthoofding) 15. Echter, al deze methoden omvatten het verlies van andere dan alleen het oog vele weefsels (zoals de hersenen, darmen, en nephridia), potentieel complicerende interpretatie van de resultaten. Het oog ablatie protocol hier gepresenteerde beperkt excisie aan de oogweefsels (met uitzondering van met hersenen), wat resulteert in gegevens die specifieker zijn voor het oog. Bovendien, in tegenstelling onthoofd wormen die 7-14 dagen om voeding te beginnen, zal Eye weggenomen wormen voeden binnen 24 uur ablatie 12, waardoor RNAi experimenten (waar RNAi via voedsel wordt geleverd) wordt performed gelijktijdig. Hoewel oog ablatie is technisch moeilijker om met succes uit te voeren dan onthoofding, hebben de huidige studies met oog uitsnijding niet inbegrepen gedetailleerde instructies over hun procedures. Het doel van deze video artikel is onderzoekers in staat te stellen de planarian optische kop consequent te verwijderen zonder de onderliggende hersenweefsel en het verwijderen van zo weinig andere weefsels mogelijk te maken. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor zowel enkele als dubbele oog ablatie en is toepasbaar op een groot aantal onderzoeken. Zoals de meeste regeneratie testen oog wordt ablatie goed geschikt voor combinatie met zowel farmacologische en genetische (RNAi) schermen en gedragsonderzoek. Hier beschrijven we methoden voor de behandeling van wormen, het handhaven van een planarian kolonie, en het oog ablatie techniek zelf.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean sea salts</td><td>Spectrum Brands&nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>"10 Gallon" box&nbsp; (nettogewicht 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 filter paper</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Cirkels, 125 mm diameter, wit</td></tr><tr><td>Easy Touch Insulin syringe (met naald)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&nbsp;U-100 1 cc spuit, 31 G 5/16 inch naald</td></tr><tr><td>100 mm Petri schaal</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petri schaal</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&nbsp; pincet&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, rechte punt, 11 cm</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&nbsp;</td><td>Samco Scientific&nbsp;</td><td>225</td><td>Gegradueerd, grote kop, 7.5 mL, niet steriel</td></tr><tr><td>Parafilm M paraffinefolie</td><td>Brand&nbsp;</td><td>701606</td><td>&nbsp;4 inch x 125 voet rol</td></tr><tr><td>12-wels onbehandelde weefselkweekplaat</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Onbehandeld, platte bodem, sterieel, Falcon merk</td></tr><tr><td>Kunststof voedselcontainers (voor kolonie)&nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Grote rechthoek</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"&nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (Girardia tigrina)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Verkocht als "Bruin" Planaria; meestal zijn ze G. tigrina (aka Dugesia tigrina), maar soms zijn ze G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); beide zullen werken.</td></tr><tr><td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>S. mediterranea zijn niet commercieel verkrijgbaar. Op dit moment zijn dieren alleen verkrijgbaar bij laboratoria die ze gebruiken en extra dieren hebben.</td></tr><tr><td>Bruine papieren handdoeken&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td></tr><tr><td>Wasfles (voor wormwater), optioneel</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Wasflessen, lagedichtheid Polyethyleen, Breed Mond, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-synapsin antilichaam, optioneel</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>Anti-arrestin antilichaam, optioneel</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Niet commercieel verkrijgbaar. Vriendelijk geschenk van Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy carboy met kraan (voor het bewaren van wormwater), optioneel</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&nbsp; polypropyleen, lage profiel maakt het gemakkelijker om plastic koloniecontainers&nbsp; te vullen</td></tr><tr><td>Aangepaste Peltier plaat, optioneel</td><td>Williams Machine, Foxboro, MA&nbsp;</td><td>n/a</td><td>Ontwerpspecificaties met dank aan Junji Morokuma, Tufts University:&nbsp; De Peltier plaat is geconstrueerd uit een standaard thermo-elektrische warmtepomp (bijvoorbeeld, All Electronics Corp Catalogus # PJT-1, 30 mm2).&nbsp; De vierkante warmtepomp is bedekt met een dunne gespiegelde oppervlakte, vervolgens geplaatst in een 30 mm2 vierkante gat in een ronde plexiglas vorm (~50 mm in diameter). Deze vorm is van vergelijkbare dikte als de warmtepomp, en past strak in een uitgefreesd in het centrum van een ronde warmtesink (~115 mm in diameter). De vorm/warmtepomp wordt&nbsp; "verankerd" aan de goot met siliconen basis warmtesink compound. De kabels worden door gaten getrokken die door zowel de vorm als de warmtesink zijn geboord. De onderste helft van de warmtesink is uitgefreesd in een "voet" die past in de opening van de basisplaat van uw microscoop's.&nbsp;</td></tr><tr><td>DC-stroombron (voor Peltier plaat), optioneel</td><td>B &amp; K Precision</td><td>1665</td><td>Geregelde lage spanning DC-voeding, 1-18 V (DC), 1-10 ampère.</td></tr><tr><td>Andere gebruikelijke benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scheermesje&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie microscoop met zwanenhalsverlichting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stokjeshouder, optioneel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgische ablation assay voor het bestuderen van eye regeneratie in planarians

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In de studie van volwassen stamcellen en regeneratieve mechanismen, planarian platwormen zijn een nietje in vivo modelsysteem. Dit is grotendeels te danken aan hun overvloedige pluripotente stamcellen bevolking en het vermogen om alle cellen en weefsels types na verwondingen die katastrofisch voor de meeste dieren zou regenereren. Onlangs hebben planarians populairder geworden als een model voor oog regeneratie. Hun vermogen om het gehele oog regenereren (bestaande uit twee weefseltypen: pigmentcellen en fotoreceptoren) maakt de dissectie van de mechanismen reguleren visuele systeem regeneratie. ablatie oog heeft verschillende voordelen boven andere technieken (zoals onthoofding of gaten) voor de behandeling oogspecifieke pathways en mechanismen, de belangrijkste daarvan is dat regeneratie grotendeels beperkt tot alleen oogweefsels. Het doel van deze video artikel is om te demonstreren hoe de planarian optische kop op betrouwbare wijze te verwijderen zonder de hersenen verstoren of de omliggende weefsels.De behandeling van wormen en het onderhoud van een gevestigde kolonie wordt ook beschreven. Deze techniek maakt gebruik van een 31 G 5/16 inch insuline naald operatief schep de optische kop planarians geïmmobiliseerd op een koude plaat. Deze werkwijze omvat zowel enkele als dubbele oog ablatie, met de ogen regenereren binnen 1-2 weken, waardoor een groot aantal toepassingen. In het bijzonder kan deze ablatietechniek goed te combineren met farmacologische en genetische (RNA interferentie) schermen voor een beter begrip van regeneratieve mechanismen en hun evolutie, oog stamcellen en hun onderhoud en phototaxic gedragsreacties en de neurologische basis.

Voor de eerste 1-2 uur na de operatie, kunnen dieren vertonen verminderde beweging ten opzichte van intacte wormen (maar ze zullen nog bewegen). Indien gewenst, wormen eet binnen 24 uur van chirurgie (bijvoorbeeld voor RNAi voeding). Bij het volgen van eye regeneratie in dezelfde individuen over de tijd, zorg ervoor dat je een foto van elke worm te nemen, zowel voorafgaand aan de operatie (intact) en op 1 uur na ablatie (HPA). Per 4 dagen na ablatie (dpa) regenereren van pigmentcellen zi...

Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.

Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe de optische beker van de planaria betrouwbaar verwijderd kan worden zonder het brein of het omliggende weefsel te verstoren, zodat de techniek kan worden toegepast door onderzoekers en studenten op alle opleidingsniveaus. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van regeneratie, zoals het bepalen van de mechanismen die de instandhouding en differentiatie van endogene oogstamcellen in vivo reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om uitsluitend het oogweefsel te verwijderen met minimale verstoring van andere weefsels.Over het algemeen is oefening vereist voordat personen die nieuw zijn met deze methode betrouwbaar de juiste hoeveelheid weefsel kunnen verwijderen, waarbij het volledige oog wordt geablateerd terwijl ablatie van het omringende weefsel wordt vermeden. Begin met het selecteren van wormen die minstens een week niet gevoed zijn en minstens vijf tot zeven millimeter lang zijn. Breng 15 tot 30 wormen over naar een Petri-schaal van 100 millimeter die voor twee derde gevuld is met wormwater en plaats onmiddellijk het deksel terug.Inspecteer de wormen op ontbrekende of ongepigmenteerde weefsels, zoals witte koppen of staarten, om er zeker van te zijn dat ze onbeschadigd zijn en niet recentelijk zijn geregenereerd. Veeg eerst de werkruimte en de voet van de dissectiemicroscoop af met een 70% ethanol-oplossing en laat dit volledig drogen. Plaats de schaal met de geselecteerde wormen aan de linkerkant van de microscoop.Plaats vervolgens aan de rechterkant van de microscoop een pincet nummer vijf, een insulienaald van 31 gauge en 5/16 inch met een spuit van 1 ml, een schone transferpipet en een gelabelde 12-well plaat voor het verzamelen van de geablateerde wormen. Plaats een doos pluisvrije tissues, een plastic spuitfles gevuld met vers wormwater en extra transferpipetten zodanig dat ze tijdens de operatie gemakkelijk toegankelijk zijn. Positioneer een Peltier-plaat in het midden van de voet van de dissectiemicroscoop en stel de output van de DC-stroombron zo in dat het oppervlak van de Peltier-plaat voldoende koel is om de wormen te immobiliseren.Als alternatief kan een met ijs gevulde Petrischaal worden gebruikt in plaats van een Peltier-plaat. Om het operatievlak voor te bereiden, knipt u eerst een stuk plastic paraffinefolie van vijf centimeter bij tien centimeter en plaatst u dit over het midden van de Peltier-plaat. Vouw vervolgens een pluisvrije tissue in een vierkant van ongeveer twee centimeter en plaats deze bovenop de folie.Houd vervolgens het gevouwen doekje op zijn plaats, bevochtig het met wormwater en rol het doekje plat met een transferpipet. Knip tot slot een stukje wit filterpapier van 1,5 tot 2 cm² af en leg dit bovenop het doekje. Om de operatie te beginnen, plaatst u met de transferpipet één worm met de rugzijde naar boven op het filterpapier.Schakel de lamp in en richt de lichtstraal op de worm. Stel de focus en vergroting van het dissectiemicroscoop zo in dat de ogen van de worm duidelijk zichtbaar zijn. Draai de paraffinefolie om de positie van de worm aan te passen, zodat de kop naar de onderzoeker is gericht en onder een hoek van 30 tot 40 graden naar rechts staat.Als de worm zo is gepositioneerd dat de ventrale zijde naar boven is gericht en de faryngeale opening zichtbaar is, gebruik dan de stompe zijde van de pincet om de positie van de worm voorzichtig te veranderen naar de dorsale zijde naar boven, zodat de ogen zichtbaar zijn. Pas de instellingen van de microscoop opnieuw aan zodat de ogen duidelijk in focus zijn. Zorg er daarnaast voor dat zowel de ogen als het omliggende kopweefsel in beeld zijn.Houd een schone spuit in de rechterhand tussen de duim en wijsvinger. Ondersteun het onderste deel van de spuit met de linkerduim, waarbij deze tegen de Peltier-plaat wordt gestut. Kijk door de microscoop om te controleren of de schuine zijde van de naald zichtbaar is.Plaats de linkerwijsvinger op het operatievlak zodanig dat deze een hoek van 40 graden vormt met de linkerduim om ervoor te zorgen dat het vlak tijdens de procedure stabiel blijft. Positioneer de naald in een hoek van 90 graden ten opzichte van het oog, met de schuine zijde van de naald naar boven gericht. Penetreer met de naaldpunt voorzichtig de dunne weeflaag die over de oogbeker ligt en zichtbaar is als een wit, niet-gepigmenteerd gebied.Verwijder met een scheppende beweging van rechts naar links zeer voorzichtig al het zwart gepigmenteerd weefsel in de oogbeker, evenals alle witte weefsels. Indien een dubbele oogablatie wordt uitgevoerd, ableer dan nu het tweede oog. Nadat de operatie is voltooid, vult u de pipet opnieuw met een kleine hoeveelheid wormwater en laat u het water op de worm vallen om deze van het filterpapier te tillen.Zuig de worm direct op met de transferpipet. Verplaats de worm naar een gelabelde 12-wellplaat die voor twee derde gevuld is met vers wormwater. Wanneer alle wormen zijn overgeplaatst, worden ze gewassen door het water in de wells te vervangen door vers wormwater.Incubeer de wormen, beschermd tegen licht, in een incubator van 20 °C en volg het regeneratieproces. Om levende wormen te sacrificeeren, verwijdert u het wormwater van de plaat en vervangt u dit door 70% ethanol. Incubeer de wormen gedurende drie tot vijf minuten en observeer of de wormen lyseren en grijs worden.Hier worden foto's gepresenteerd van platwormen die zijn onderworpen aan dubbele oogablatie en enkele oogablatie, genomen vóór, vier dagen na en twee weken na de chirurgische procedure. De afbeeldingen tonen de voortgang van de regeneratie in de tijd. Oogregeneratie in de geablateerde wormen werd tevens bevestigd door immunohistochemische kleuring van arrestin en nieuw ontwikkelde fotoreceptorneuronen.Het herstel van het visuele systeem bij platwormen na dubbele oogablatie werd tevens bestudeerd in een functionele assay gebaseerd op de fotofobe reactie van het wildtype op licht. 24 uur na de ablatie vermijden wormen zonder ogen het licht niet en bewegen zij zich door lichtvlekken. De fotofobie is zeven dagen na de procedure hersteld, wat aangeeft dat het geregenereerde visuele systeem functioneel is.Zodra de procedure is beheerst, kan de dubbele oogablatie van één worm in ongeveer drie minuten worden uitgevoerd. Tijdens de ablatie is het belangrijk om alle gepigmenteerde en ongepigmenteerde weefsels van het oog te verwijderen, terwijl men erop let dat het weefsel tussen de ogen niet beschadigd raakt of dat het weefsel verder naar binnen in het oog wordt gescheurd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie en RNA-interferentie, worden uitgevoerd om de rol van specifieke genen en hun regeneratieproces te onderzoeken.Bovendien kunnen gedragstesten worden uitgevoerd om de oogfunctie na regeneratie te testen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u planaria-ogen kunt excideren zonder het omliggende weefsel te beschadigen. Vergeet niet dat werken met naalden gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en het vasthouden van de naald in een richting van u af, moeten worden genomen.

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Acute nierschade (AKI) bij de mens is een veel voorkomend klinisch probleem wordt veroorzaakt door schade aan de epitheliale cellen die de nieren nefronen bevatten, en de AKI wordt geassocieerd met een hoge sterfte van...

Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

Een aantrekkelijk model voor het bestuderen van stamcellen differentiatie binnen een levend dier is de planarian platworm. Regeneratie wordt bestudeerd door eenvoudige amputatie experimenten die gemakkelijk worden uitgevoerd in een basic laboratorium en zijn vatbaar voor farmacologische en genetische...

Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica</em

Een effectieve methode voor het enten van weefsel van gedefinieerde en consistente grootte tussen planaria wordt beschreven. Ook inbegrepen is een beschrijving van de immobilisatie technieken gebruikt voor transplantatie kan worden aangepast in samenhang met lood schilden de gedeeltelijke bestraling van levende dieren.

Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

Source: Volpe, B. A., et al. Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates monitoring interneuromast cell recovery in zebrafish using confocal microscopy, tracking cell death and repair through time-lapse fluorescence imaging.

Monitoring Recovery of Laser-Ablated Interneuromast Cells in Zebrafish Using Confocal Microscopy

Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vissen dan het embryo / larven ontwikkelden we een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve test die kan worden toegepast bij de zebravis ziektemodellen volwassene. De test betrokken resolutie bij de 1) neuromast en 2) individuele haar cel niveaus.

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.

Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis

De planarian Schmidtea mediterranea is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcellen en weefselregeneratie. Deze publicatie beschrijft een methode om selectief verwijderen van één orgaan, de keelholte, door dieren naar de chemische natriumazide bloot te leggen. Dit protocol wordt ook uitgelegd welke methoden voor de controle van de keelholte regeneratie.

Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea

Laserablatie is een breed toepasbare technologie voor het bestuderen van regeneratie in biologische systemen. Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van een standaard laserscanning confocale microscoop voor laserablatie en de daaropvolgende time-lapse beeldvorming van het regenereren van interneuromastcellen in de zebravis laterale lijn.

Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Hier stellen we drie verschillende methoden voor om de sensorische vezels die het hoornvlies innerveren te beschadigen. Deze methoden vergemakkelijken de studie van axonregeneratie bij muizen. Deze drie methoden, die kunnen worden aangepast aan andere diermodellen, zijn ideaal voor de studie van de fysiologie en regeneratie van de innervatie van het hoornvlies.

Drie strategieën om neurotrofe keratitis en zenuwregeneratie in het hoornvlies van muizen te induceren

Leer chirurgische ablatie van planaria-ogen met minimale verstoring van omliggend weefsel. Deze methode ondersteunt onderzoek naar regeneratieprocessen en stamcelbiologie in vivo.

Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

Meer video's verkennen