Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum
13 december 2017
Dit werk beschrijft een nanoimprinting lithografie methode om kwalitatief hoogwaardige sensing matrices die op het principe van buitengewone optische transmissie werken. De biosensor is lage kosten, robuust, makkelijk te gebruiken, en kan detecteren cardiale troponine ik in serum op klinisch relevante concentraties (99th percentiel cutoff ∼10-400 pg/mL, afhankelijk van de test).
Het algemene doel van deze techniek is om biomarkers te meten die aanwezig zijn in een complexe biologische vloeistofondergrond bij klinisch relevante concentraties in een point-of-care-omgeving zonder de noodzaak van ingewikkelde optische of elektrische setups. Deze methode kan helpen bij het realiseren van biosensoren op basis van buitengewone transmissie in point-of-care-scenario's. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er geen ingewikkelde elektrische of optische setups nodig zijn.
In onze experimenten kon het betrouwbaar biomarkers detecteren bij klinisch relevante concentraties. De fabricage van de sensorchip wordt uitgevoerd in de cleanroom en kan niet worden gefilmd. Voor demonstratiedoeleinden wordt de procedure hier weergegeven door een animatie.
Voor de voorbereiding van de nikkelvormlaag wordt een 220 nanometer dikke laag van negatief elektrostraal-weerstand op een 600 micron dikke vierduims siliciumwafer aangebracht. Schrijf het ontworpen nanogattenarray op deze wafer, met behulp van een elektronenstraal-lithografiesysteem. Om het elektronenstraalschrijven te versnellen, schrijf de patronen met een lage dotmap van 20.000 voor elk 300 micron veldformaat.
Ontwikkel de weerstand door de vierduims siliciumwafer 10 seconden in de ontwikkelingsoplossing te dompelen en de wafer in de lucht te laten drogen. Deponeer een zaadlaag van een metaal, zoals nikkel, koper of aluminium op de siliciumwafer. Elektroplateer vervolgens de wafer in een plateersysteem in een nikkelsulfaamatbad in twee stappen.
Separeer de nikkelvorm van de siliciumsubstraat door zachte mechanische kracht toe te passen. Vervolgens, met behulp van een nano-imprinter, druk de nanopatronen op een vierduims glazen wafer die is bedekt met een 300 nanometer dikke laag foto-hardende nano-imprinting-lithografie-weerstand. Breng de mal, de fotoweerstand en de glazen wafer over naar een UV-licht-uithardingssysteem en foto-hard.
Als alle stappen correct zijn gevolgd, zou de nikkelvorm gemakkelijk uit de fotoweerstand moeten kunnen worden gehaald. Na het uitvoeren van een blanco etch van de fotoweerstand op de glazen substraat, op de glazen wafer, in een elektronenstraal-depositionsmachine, deponeer een laag chroom voor metaalaanhankelijkheid en een laag goud voor de plasmonische sensor. Voer een lift-off van de fotoweerstand uit door drie minuten in zuurstofplasma-etsen, gevolgd door een 15 seconden durende sonificatiestap in aceton.
Snijd vervolgens het monster in vijf millimeter bij vijf millimeter chips. Het nanogattenarray zal het centrale, twee millimeter bij twee millimeter vierkant van de chip bezetten. Om de gegevens te verkrijgen, stelt u de inrichting in om de optische metingen uit te voeren, zodat een straal wit licht die uit het uiteinde van de zenderoptische vezel komt, is gekolommeerd en met 90 graden op het sensoroppervlak valt.
Het licht wordt door het hele nanogattenarray getransporteerd. Verzamel het getransporteerde signaal met de ontvangeroptische vezel en neem het op met een UV-zichtbare spectrometer die werkt binnen het bereik van 300 tot 1.000 nanometer. Voor de gevoeligheidstest van de sensorbulk, deponeer de standaard, brekingsindex vloeistof in de vloeistofcel met de brekingsindexen variërend van 1,31 tot 1,39.
Dompel de sensorchip in de standaard brekingsindex vloeistof en lijn hem uit met de straal wit licht. Verkrijg vervolgens het transmissiespectrum. Reinig de sensorchip na elke meting met een oppervlakte-actief reinigingsmiddel en droog het met stikstofgas.
Voor de modificatie van het sensoroppervlak, reinig de sensorchips door sequentiële immersie in isopropanol, aceton en gedeïoniseerd water vóór enige chemische modificaties. Droog vervolgens de sensorchips op kamertemperatuur in een stroom van droge stikstofgas. Vervolgens incubeer de sensorchips in een ethanolische oplossing gedurende 12 uur op kamertemperatuur.
Dit zal een amine-reactieve, zelf-assemblerende monolaag vormen. Gebruik na incubatie ethanol om de chips grondig te spoelen en droog ze bij kamertemperatuur. Dompel vervolgens de chips gedurende 15 minuten in een mengsel van 75 millimolar sulfo n hydroxysuccinimide en 15 millimolar EDC.
Dit activeert de carboxsilic-groep van de zelf-assemblerende monolaag. Breng vervolgens 50 microliter van een 200 microgram per milliliter anti-tripontine antilichaamoplossing aan die is gemaakt in een Ph 4,5 aciaatbuffer op het oppervlak van de sensor. Deactiveer na incubatie gedurende 30 minuten de niet-reactieve esters door de sensorchip 15 minuten in een 1 molaire ethanolamine HCL-oplossing te dompelen.
Spoel vervolgens de chip met gedeïoniseerd water en droog hem in een stroom van droge stikstofgas op kamertemperatuur. Blokkeer eventuele niet-specifieke binding door 100 microliter van 1% bovien serumalbumine-oplossing op het oppervlak van de sensorchip aan te brengen. Incubeer gedurende 15 minuten.
Spoel de sensorchips drie keer in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Plaats de chip in de meetcel om het transmissiespectrum op te nemen. Dit is het referentiespectrum.
Breng vervolgens 50 microliter van de cardiac troponine een standaard aan op het oppervlak van de chip. Incubeer de chip 30 minuten in een vochtige omgeving. Na het spoelen van de sensorchips drie keer in PBS-oplossing, plaats het in de meetcel om het transmissiespectrum op te nemen.
Dit is het spectrum na binding. Dompel vervolgens de chips één minuut in 50 millimolar glycine HCL en spoel ze vervolgens drie keer in PBS-oplossing om het oppervlak van de chip te regenereren. Meet het transmissiespectrum in PBS om het succes van de regeneratiestap te verifiëren.
De verandering in transmissiespectrum van de biosensor bij interactie met 30 nanogram per milliliter humaan cardiaal troponine in serum wordt getoond. De blauwe grafiek vertegenwoordigt vóór de interactie, terwijl de rode grafiek staat voor na de interactie. De gestippelde cirkel geeft de band aan die wordt gevolgd.
Hier wordt de golflengteverplaatsing voor band twee bij troponineconcentraties van 2,5 nanogram per milliliter, 7,5 nanogram per milliliter,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit werk beschrijft een methode voor nano-imprintlithografie om hoogwaardige sensorarrays te vervaardigen die werken op basis van het principe van buitengewone optische transmissie. De biosensor is ontworpen voor point-of-care-toepassingen, waardoor de detectie van cardiaal troponine I in serum bij klinisch relevante concentraties mogelijk wordt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biotكنولوجيا
- Biomedische Techniek
Achtergrond
- De behoefte aan betrouwbare detectie van biomarkers in complexe biologische vloeistoffen.
- Uitdagingen die gepaard gaan met traditionele biosensortechnologieën.
- Het principe van buitengewone optische transmissie bij biosensing.
- Het belang van point-of-care-diagnostiek in klinische omgevingen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een goedkope, robuuste biosensor voor de detectie van cardiaal troponine I.
- Het vereenvoudigen van het detectieproces zonder complexe opstellingen.
- Het demonstreren van de haalbaarheid van biosensoren op basis van buitengewone transmissie in klinische toepassingen.
Gebruikte methoden
- Nano-imprintlithografie voor de fabricage van sensoren.
- Testen van de biosensor in serummonsters.
- Animatievoorstelling van het fabricageproces.
- Evaluatie van detectielimieten en prestatiegegevens.
Belangrijkste resultaten
- De biosensor kan cardiaal troponine I detecteren bij concentraties van 10-400 pg/mL.
- De sensor werkt effectief in een point-of-care setting.
- Aantoonbare betrouwbaarheid bij het detecteren van biomarkers in complexe vloeistoffen.
- Elimineert de noodzaak voor uitgebreide optische of elektrische opstellingen.
Conclusies
- Deze methode vormt een belangrijke vooruitgang in de biosensortechnologie.
- Het heeft het potentieel om de point-of-care-diagnostiek voor hartaandoeningen te verbeteren.
- Toekomstig onderzoek kan zich richten op het uitbreiden van het bereik van detecteerbare biomarkers.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit biosensingplatform voldoet aan de kritieke behoefte aan betrouwbare, goedkope detectie van cardiale biomarkers in complexe biologische vloeistoffen zoals menselijk serum, wat direct bijdraagt aan diagnostische workflows bij het behandelpunt (point-of-care). Door reproduceerbare, kwantitatieve metingen van cardiaal troponine I bij klinisch relevante concentraties mogelijk te maken zonder complexe optische of elektrische opstellingen, verlaagt deze methode de technische barrières voor vroege diagnose en risicostratificatie bij cardiovasculaire ziekten. De hoogwaardige fabricage via nano-imprinting zorgt voor minimale variatie tussen chips, wat schaalbare productie en consistente assay-prestaties ondersteunt tijdens zowel de ontdekkings- als de translationele fasen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de dynamiek van de afgifte van cardiaal troponine als mechanistische biomarker voor myocardiale beschadiging in preklinische modellen.
- Operationele waarde: Biedt een labelvrije, optische uitlezing die compatibel is met nano-hole arrays van hoge getrouwheid voor consistente signaaldetectie in serumachtergronden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve outputs van golflengteverschuivingen die correleren met de analytconcentratie, waardoor dosis-respons karakterisering in serummatrices mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Ondersteunt een strategie van één chip per meting met een lage variantie, wat de reproduceerbaarheid voor assay-standaardisatie en reagensscreening verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert het monitoren van de kinetiek van cardiale biomarkers in menselijk serum dat relevant is voor ziektebeelden, waardoor de translationele continuïteit van ontdekking naar validatie wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor microscopie door grote detectiegebieden (1,5 mm x 1,5 mm), wat de integratie met standaard laboratoriumlichtbronnen en spectrometers vereenvoudigt.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot identificatie van lead-verbindingen door een robuuste, kwantitatieve uitlezing te bieden voor biomarkerdetectie in complexe vloeistoffen, wat go/no-go-beslissingen ondersteunt op basis van target-engagement en modulatie van signaalpaden.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk met betrekking tot mechanismen van cardiale beschadiging door betrouwbare detectie van troponine I in fysiologisch relevante serumconcentraties.
- Screening: Levert reproduceerbare verschuivingen in het transmissiespectrum op, waardoor vergelijking van biomarkerniveaus over verschillende experimentele condities mogelijk is zonder complexe instrumentatie.
- Analytics: Biedt metingen van golflengteverschuivingen (bijv. band twee) als kwantitatieve output voor het volgen van biomarkerbinding en regeneratie-efficiëntie.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van menselijk serum als detectiematrix, wat de relevantie voor klinische monsters waarborgt en het risico op soortspecifieke translatie vermindert.
- Enterprise hergebruik: Het op nano-imprinting gebaseerde fabricageproces is herbruikbaar over meerdere chipgeneraties, wat de schaalbaarheid van het platform voor gemultiplexte biomarkerpanels ondersteunt.
Operationele & bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij de detectie van biomarkers door middel van een klinisch relevante LOD (0.55 ng/mL) en minimale variatie tussen chips.
- Operationele waarde: Standaardisatie via nanoimprinting-lithografie en compatibiliteit met gangbare UV-Vis-spectrometers en glasvezelopstellingen.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door vroege, nauwkeurige monitoring van biomarkers in gesimuleerde POC-omgevingen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten gericht op het hart door betrouwbare, serumcompatibele uitlezingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in nanoimprint-lithografie, oppervlaktechemie en optische spectroscopie voor de fabricage en functionalisering van de chip.
- Afhankelijk van toegang tot een cleanroom voor het genereren van de mastermold en UV-uithardingssystemen voor de polymerisatie van de resist.
- Vereist gestandaardiseerde oppervlaktevoorbereiding (bijv. BSA-blocking, EDTA-spoelingen) om aspecifieke binding in serummatrices te minimaliseren.
- Aanpassing aan andere biomarkers vereist validatie van de immobilisatie-efficiëntie van antilichamen en de regeneratiestabiliteit in complexe vloeistoffen.
- Praktische beperking: de regeneratie-efficiëntie moet per cyclus worden geverifieerd om de reproduceerbaarheid van het oppervlak bij seriële metingen te waarborgen.
