Spanningsklem Fluorometrie in

Het algemene doel van deze procedure is om een fluorescerend onnatuurlijk aminozuur in een membraaneiwit te introduceren dat tot expressie is gebracht in Xenopus-oocyten en om de functie en structurele reorganisatie van het eiwit gelijktijdig te bepalen met behulp van voltage-clamp fluorometrie. Deze techniek zal helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van structuur-functie-relaties van membraaneiwitten. Met voltage-clamp fluorometrie kunnen we structurele reorganisaties direct correleren met de eiwitfunctie.

De toevoeging van fluorescentie-markering met onnatuurlijke aminozuren helpt om eerdere beperkingen bij de markering te overwinnen. Dit betrof enerzijds de toegankelijkheid van de markeringsplaatsen en anderzijds achtergrondmarkering door endogene bindingsplaatsen. De implicatie van deze techniek reikt tot een beter biofysisch begrip van membraaneiwitten, omdat het nu mogelijk is om domeinen te onderzoeken die voorheen ontoegankelijk waren met traditionele voltage-clamp fluorometrie.

Was de oocyten na chirurgische verwijdering uit de Xenopus drie keer met SOS-oplossing. Selecteer individueel grote en gezonde oocyten en incubeer deze voor injectie ten minste vier uur bij 18 degrees Celsius in Barth's-oplossing, aangevuld met antibiotica en 5% paardenserum. Bereid voor nucleaire injectie van DNA een lange en dunne injectiepunt voor om de nucleus te bereiken zonder de oocyten te beschadigen.

Vul vervolgens de injectiepunt met olie en monteer de injectiepunt op het nanoinjectieapparaat. Installeer daarna de nanoinjector onder een stereomicroscoop en breek het uiteinde van de punt af met een pincet. Druk vervolgens de olie uit totdat er geen luchtbel meer in het uiteinde van de punt zit.

Plaats daarna onder het stereomicroscoop één µL pAnap (0,1 µg/µL in nucleasevrij water) op een stuk Parafilm en vul de injectiespuit met DNA. Verplaats vervolgens de oocyten naar een injectieschaaltje met gaas dat Barth-oplossing bevat, aangevuld met antibiotica. Aangezien de oocytenkern zich in de dierpool bevindt, richt u de injectiespuit op het centrum van de dierpool en prikt u deze zodanig door dat de punt bijna het centrum van de dierlijke hemisfeer bereikt.

Inject vervolgens 9,2 nanoliter van de pAnap-oplossing in de kern van elke oocyten. Incubeer de oocyten daarna in twee milliliter Barth's oplossing, aangevuld met antibiotica en 5% paardenserum, bij 18 °C gedurende zes tot 24 uur om een robuuste expressie van Anap-specifieke tRNA's en tRNA-synthetasen mogelijk te maken. Bereid nu de nanoinjector opnieuw voor, maar deze keer hoeft de injectiepunt niet zo dun te zijn als die voor de DNA-injectie.

Werk vanaf dit punt uitsluitend onder rood licht om fotobleken van Anap te voorkomen. Meng één microliter één-millimolair Anap met één microliter één tot twee microgram per microliter mRNA direct op een stuk Parafilm, en vul de injectiepunt met de mengoplossing. Steek de punt in de vegetatieve pool net onder het membraan en injecteer 46 nanoliter van de mengoplossing in elke pAnap-geïnjecteerde oocyt.

Bescherm vervolgens de oocyten tegen licht door ze in een lichtdichte doos te plaatsen of door de kolf in aluminiumfolie te wikkelen. Incubeer ze gedurende twee tot drie dagen in Barth-oplossing aangevuld met antibiotica en 5% paarden serum bij 18 °C. Vervang de oplossing dagelijks door verse Barth-oplossing en verwijder de dode oocyten om contaminatie te voorkomen.

In deze opstelling is de opengeknipte voltage-clampapparatuur geïntegreerd in een fluorescentiemicroscopie-opstelling. De registratiekamer is gemonteerd op een schuifmechanisme waardoor deze kan worden verplaatst tussen het standaard stereoomscoop voor het plaatsen van de oocyte en de microscoop voor het uitvoeren van fluorescentiemetingen. Een fotodiodedetectiesysteem is verbonden met de C-mount uitgangspoort van de fluorescentiemicroscoop, en de uitlezing van de fotostroom is verbonden met een tweede ingangskanaal in de digitale signaalprocessor.

Een halogeenlamp van 100 watt en 12 volt wordt gebruikt als lichtbron voor de fluorescentie-excitatie. De excitatie wordt geregeld door een mechanisch sluiter tussen de excitatie-lichtbron en de microscoop. De activering wordt getriggerd via een TTL-puls vanuit de digitale signaalprocessor, die in de opnamesoftware zo is getimed dat de sluiter ongeveer 100 milliseconden voor het begin van de opname opent, waarbij een passend filterblok in de filterblokhouder vereist is.

Voor twee-kleurige VCF worden de voorbereide oocyten vlak voor de opname 15 minuten geïncubeerd in 5 µM TMR-maleïmide in labeloplossing. Was de oocyten vervolgens drie keer met de labeloplossing om overtollige kleurstof te verwijderen voordat de opname begint. Op dit punt is het eiwit specifiek gelabeld met twee verschillende fluoroforen.

Na het monteren van de eicel, met de animalpool naar boven gericht en gepermeabiliseerd, schuift u de kamer naar de microscoop en stelt u de eicel scherp met een 4X objectief. Penetreer vervolgens de eicel met een spanningsgevoelige V1-elektrode. Schakel daarna over naar het 40X waterimmersie-objectief.

Focus op de dierpool, die naar boven is gericht. Zet daarna het rode licht uit. Selecteer de Anap-filterkubus door de filterkubus-turret en de optische uitgangspoort die verbonden is met de fotodiode te draaien.

Schakel daarna de halogeenlamp in op de hoogste intensiteit en open het sluiter voor twee tot vijf seconden om de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de oocyten te meten. Zet vervolgens de klem aan, schakel de bath/guard-schakelaar naar actief en stel de membraanpotentiaal in op de commandopotentiaal door aan de knop op de headstage te draaien. Selecteer daarna het rustpotentiaal, het stapprotocol, het aantal en de lengte van de pulsen in de registratiesoftware.

Registreer vervolgens de spanningsafhankelijke stromen en de Anap-fluorescentie-intensiteiten. Selecteer voor twee-kleuren VCF de TMR-filterkubus door aan de kubustorentje te draaien. Meet de achtergrondfluorescentie voor TMR, zoals beschreven voor Anap, en registreer simultaan de spanningsafhankelijke stromen en de TMR-fluorescentie-intensiteit.

Deze figuur toont Anap- en TMR-fluorescentiesignalen met behulp van stapprotocollen verkregen uit dezelfde oöcyt die een Shaker-mutant tot expressie brengt. Door een cysteine, toegankelijk vanuit de externe oplossing, toe te voegen aan de L382 stop W434F-achtergrond en deze te labelen met TMR-maleïmide, is het mogelijk om gelijktijdig real-time bewegingen in verschillende regio's van hetzelfde eiwit te onderzoeken. De relatie tussen fluorescentie en voltage wordt verkregen door de steady-state fluorescentie-intensiteit uit te zetten tegen het voltage.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u fluorescerende onnatuurlijke aminozuren tot expressie brengt in Xenopus-oocyten en hoe u één-kleurige of twee-kleurige voltage-clamp fluorometrie uitvoert. Zodra u de techniek beheerst, zou het ongeveer dezelfde tijd in beslag moeten nemen als traditionele elektrofysiologische experimenten; u heeft alleen de extra stap van het injecteren van DNA in de nucleus van de oocyt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u moet controleren op lekexpressie in afwezigheid van het onnatuurlijke aminozuur.

Dit moet voor elke mutatie worden gedaan, aangezien de hoeveelheid lekexpressie afhangt van de locatie van het stopcodon binnen het eiwit. Deze techniek stelt onderzoekers nu in staat om conformationele veranderingen aan de cytosolische zijde van het eiwit te bestuderen, waar veel van de regulatiemechanismen plaatsvinden.