Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart
19 mei 2017
Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.
Het algemene doel van deze procedure is om levensvatbare cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten gelijktijdig uit het rattenhart te isoleren voor hun individuele in vitro-analyses. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cardiovasculaire ziekten over de signaalmechanismen die betrokken zijn bij cardiale hypertrofie, ischemie-reperfusie-letsel, endotheelfunctie en cardiale fibrose. Het grote voordeel van deze techniek is dat alle belangrijke hartcellen gelijktijdig kunnen worden geïsoleerd, wat mogelijk de bijbehorende onderzoekskosten en het aantal experimentele dieren kan verminderen.
Na een spoeling met gedestilleerd water en een 50 milliliter Powell-medium, vervang het medium door 80 milliliter vers Powell-medium en gebruik een glazen Pasteur-pipet uit de glazen cilinder om het medium continu te perfunderen met carbogen. Gebruik vervolgens twee paar dunne gebogen forceps om een vers geoogst rattenhart via de aorta op het Langendorff-perfusiesysteem te monteren en plaats het uiteinde van de perfusiesysteemcanule tussen de eerste aortatak en de aortaklep. Bevestig de aorta met een krokodilklem.
Open de klep van de canule en bevestig het hart vervolgens met een chirurgische hechting. Laat 35 milliliter van het perfusiemedium druppelsgewijs door het hart lopen en verwijder eventueel restbloed. Plaats de opvangtrechter onder het hart en start de peristaltische pomp om het perfusiemedium van de opvangtrechter naar het reservoir te hercirculeren.
Voeg collagenase-oplossing toe aan het perfusiemedium en perfundeer het hart met de gerecirculeerde collagenase-oplossing gedurende 30 minuten. Aan het einde van de spijsvertering verwijdert u het hart met een schaar uit het Langendorff-systeem en plaatst u het in een glazen petrischaal. Verwijder nu beide atria en eventueel overgebleven vetweefsel uit het hart.
Om contaminatie met epitheelcellen te voorkomen, gebruikt u twee forceps om voorzichtig het pericard te verwijderen. Snijd het hart doormidden en plaats de helften in de weefselsenker. Hak het hart twee tot drie keer fijn en breng de weefselstukken over in een conische buis van 15 milliliter met 12 milliliter spijsverteringsbuffer van de Langendorff-perfusie.
Verteer de weefselfragmenten gedurende vijf tot 10 minuten in een waterbad, af en toe mixend met een wegwerpbare plastic pipet van vijf milliliter. Filter vervolgens de celsuspensie door een 100 micrometer zeef in een conische buis van 50 milliliter. Spoel het perfusiesysteem met minimaal één liter gedestilleerd water gevolgd door 100 milliliter 0,1 normaal natriumhydroxide gedurende 30 minuten, spoel het systeem vervolgens met nog eens twee tot drie liter gedestilleerd water en droog het apparaat af met gespoelde lucht.
Verzamel de gefilterde cellen door centrifugatie en gebruik een wegwerpbare pipet om voorzichtig de endotheelcel- en fibroblast-bevattende supernatant in een nieuwe buis van 50 milliliter over te brengen. Breng het pellet opnieuw op in zes milliliter calciumoplossing een. Na een minuut verzamelt u de cellen met een tweede centrifugatie en brengt u het pellet opnieuw op in zes milliliter calciumoplossing twee.
Na een minuut verdunt u de celsuspensie door de toevoeging van 12 milliliter calciumoplossing drie en mengt u goed door voorzichtig te kantelen. Na een andere centrifugatie brengt u het pellet opnieuw op in 20 milliliter voorverwarmd CCT-medium. Verdeel vervolgens één milliliter cellen over elk van de 20 steriele 35 millimeter celcultuurschotels die vooraf zijn bedekt met laminine en plaats de cellen in een koolstofdioxidevrije celcultuurincubator, waarbij het medium na twee uur wordt vervangen door twee milliliter vers CCT-medium om eventueel dode cellen te verwijderen.
Centrifugeer nu de endotheelcel- en fibroblast-bevattende supernatant en breng het pellet opnieuw op in 1,5 milliliter endotheelcelisolatiebuffer. Breng de cellen over in een buisje van twee milliliter en voeg muis anti-ratten CD31-antilichaam toe aan de cellen voor een 30 minuten durende incubatie bij vier graden Celsius met eind-tot-eind rotatie. Aan het einde van de incubatie, voegt u Pan anti-muis IGG-kralen toe voor een 20-minuten durende incubatie bij vier graden Celsius, met eind-tot-eind rotatie.
Aan het einde van de kralenincubatie, plaatst u de cellen gedurende twee minuten in een magnetisch rek en gebruikt u een pipet van één milliliter om voorzichtig het voornamelijk fibroblast-bevattende supernatant te verwijderen. Zie de fibroblasten op een 10 centimeter groeischijf met 10 milliliter fibroblastcelcultuurmedium en plaats de cellen in een celcultuurincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende één uur. Voeg vervolgens één milliliter wasbuffer toe aan de buis met endotheelcellen en sluit de buis.
Schud de cellen voorzichtig vier tot vijf keer om de kralen op te roepen. Breng vervolgens de buis terug naar de magneet en verwijder de wasbuffer na één minuut. Na de laatste wassing, vervang de wasbuffer door één milliliter MV2 endotheelcelcultuurmedium en zaai de endotheelcellen in een enkele put van een 12-putsplaat, voor hun overnachtelijke cultuur in de celcultuurincubator.
Aan het einde van de fibroblastincubatie, was de aangehechte cellen twee tot drie keer met een geschikt volume voorverwarmde PBS. Voeg vervolgens voorverwarmd vers fibroblastcelcultuurmedium toe aan de cellen en breng de fibroblasten terug naar de celcultuurincubator. De volgende ochtend vervangt u het supernatant op de endotheelcelcultuur door vers endotheelcelcultuurmedium en brengt u de cellen terug in de incubator, waarbij het medium om de twee tot drie dagen wordt vervangen, tot semi-confluency.
Vervolgens wast u de cultuur van aangehechte fibroblastcellen met vers voorverwarmde PBS zoals zojuist gedemonstreerd en voert u de cellen met vers voorverwarmd medium. De cardiomyocytisolatieprocedure levert een 70 tot 80% pure, levensvatbare, staafvormige, gestreepte hartcelpopulatie op. Intracellulaire calciumoscillatie-analyse van geïsoleerde cardiomyocyten geladen met fura AM, in reactie op ischemie-reperfusie bij cardiomyocyten kan dan worden uitgevoerd, evenals analyse van de veranderingen in calciumsignalering in magnetische kraal geïsoleerde endotheelcellen en fibroblasten,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd protocol voor de gelijktijdige isolatie van levensvatbare cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten uit rattenharten. Deze methode verhoogt de efficiëntie van de isolatie van hartcellen, wat potentieel de onderzoekskosten verlaagt.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Cardiovasculair onderzoek
- Celbiologie
- Technieken voor de isolatie van hartcellen
Achtergrond
- De isolatie van cardiale celtypen is essentieel voor in vitro analyses.
- Het begrijpen van signaleringsmechanismen bij cardiale aandoeningen is van vitaal belang.
- Huidige methoden vereisen vaak meerdere preparaties.
- Dit protocol is erop gericht het proces te stroomlijnen.
Doel van de studie
- Om de belangrijkste cardiale celtypen te isoleren uit één enkele rattenhartpreparatie.
- Om individuele analyses van cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten te faciliteren.
- Om experimentele kosten en het gebruik van dieren te verminderen.
Gebruikte methoden
- Perfusie van het rattenhart met gebruik van Powell-medium.
- Gebruik van een Langendorff-perfusiesysteem.
- Continue perfusie van het medium met carbogeen.
- Isolatie van cellen door geoptimaliseerde spoeltechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gelijktijdige isolatie van de belangrijkste cardiale celtypen.
- Hoge levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen voor verdere analyse.
- Vermindering van het aantal dieren dat nodig is voor onderzoek.
- Potentieel voor aanzienlijke kostenbesparingen bij experimentele procedures.
Conclusies
- Dit protocol biedt een efficiënte methode voor de isolatie van hartcellen.
- Het ondersteunt onderzoek naar cardiale hypertrofie en aanverwante aandoeningen.
- Toekomstige studies kunnen deze methode inzetten voor diverse cardiovasculaire onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol maakt de gelijktijdige isolatie van drie belangrijke cardiale celtypen uit één rattenhart mogelijk, waardoor de efficiëntie van middelen in workflows voor cardiovasculair onderzoek wordt verbeterd. Door het aantal gebruikte dieren en de voorbereidingstijd te verminderen, ondersteunt het kosteneffectieve targetvalidatie en mechanistische studies in modellen voor hypertrofie, fibrose en ischemie-reperfusieschade. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen door fysiologisch relevante primaire cellen te leveren voor het minimaliseren van risico's in signaalpaden.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar celtype-specifieke signaleringsmechanismen in pathways van cardiale hypertrofie en fibrose.
- Operationele waarde: Levert gezuiverde primaire cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten voor functionele target de-risking.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistisch inzicht in door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteit en therapeutische respons over verschillende celtypes heen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert levensvatige, staafvormige cardiomyocyten met het vermogen tot intracellulaire calciumoscillatie voor functionele assay-uitlezingen.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde preparatie van endotheelcellen en fibroblasten mogelijk voor co-cultuur of parallelle screeningsplatforms.
- Schaalbaarheidswaarde: Levert voldoende cellenaantallen uit één hart om meerdere 35mm schalen en 12-well platen te vullen voor reproduceerbare screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Ondersteunt ziekterelateerde analyse van veranderingen in calciumsignalering als reactie op ATP- en ischemie-reperfusiestimuli.
- Preklinische continuïteit: Maakt een directe vergelijking mogelijk van druggeffecten in cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten van hetzelfde dier.
- Risicobeperking: Vermindert biologische variabiliteit door gebruik te maken van gematchte primaire cellen uit één enkele bron voor mechanistische risicoreductie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische mechanistische profilering, waardoor parallelle analyse van belangrijke cardiale celtypen mogelijk wordt. Het ondersteunt hypothesegestuurde screening door gezuiverde cellen te leveren voor calciumflux-, contractiliteits- en angiogenese-assays. De workflow genereert kwantitatieve resultaten, zoals percentages levensvatbaarheid en metingen van calciumtransiënten, die de go/no-go-beslissingen bij lead-optimalisatie informeren.
- Discovery Biology: Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden bij hypertrofie en fibrose door analyse van geïsoleerde primaire cellen.
- Screening: Levert assay-klare cellen met een zuiverheid en levensvatbaarheid van 70-80% voor het screenen van verbindingen in modellen voor hart- en vaatziekten.
- Analytics: Maakt analyse van intracellulaire calciumoscillaties mogelijk via fura AM-loading om functionele reacties op stimuli zoals ATP en reperfusie te beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt op biomarkers afgestemde functionele readouts in endotheelcellen en fibroblasten na ischemische uitdaging.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform voor de validatie van cardiovasculaire targets over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door mechanische risicoreductie mogelijk te maken in drie kritieke cardiale celtypen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de celpreparatie, waardoor variabiliteit wordt verminderd en de reproduceerbaarheid tussen experimenten wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Verlaagt de kosten per experiment en het dierenverbruik, wat bijdraagt aan de optimalisatie van middelen binnen de gehele portfolio.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door geïntegreerde, celtype-specifieke profilering van werkzaamheid en veiligheid.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in Langendorff-perfusie en enzymatische weefseldigestietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot perfusiesystemen, weefselhakker (tissue chopper) en magnetische scheidingsapparatuur.
- Vereist gestandaardiseerde bereiding van reagentia, waaronder collagenase, calciumoplossingen en celtype-specifieke kweekmedia.
- Omvat coördinatie tussen verschillende teams voor chirurgische, isolatie- en kweekworkflows voor een tijdige uitvoering.
- Beperkt door de noodzaak van vers weefsel en onmiddellijke verwerking om de cellevensvatbaarheid en het rendement te behouden.
