Name: Een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Ontdek een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in Drosophila melanogaster. Deze techniek levert gecontroleerde, herhaalde impacten rechtstreeks op het hoofd om neuronale degeneratie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben niets te onthullen.

1. Montage van het Strike Device ( Figuur 1 ) <ol><li> Verwijder de plunjer uit een 1 ml tuberculinespuit. Knip het vat met 1 ml af. </li><li> Verwijder een aerosolbarrière (3 mm hoogte x 4 mm diameter) van een 200 μL pipettip en gebruik deze als een slagbuis. Plaats de schok in de spuitvat. Tap het vat voorzichtig om de slaginrichting naar het uiteinde te verplaatsen, met de vlakke zijde die de mondstukopening bedekt. </li><li> Bevestig het uiteinde van het vat aan de plastic buis die is aangesloten op de kooldioxide (CO 2 ) stromingsregelaar van een Drosophila anesthesie station. </li><li> Houd het vat verticaal vast en knijp het aan op een standaard klemhouder, zodat de schroef aan de onderkant van het vat blijft. </li><li> Wijzig een 200 μL pipettip om de vlieghouder te maken. <ol><li> Knip 4 mm van de punt om een ​​opening van 0,8 mm te maken waardoor alleen de vliegkop blootgesteld kan worden. OPMERKING: De thoRax en alle andere delen van het vlieglichaam blijven binnen in de pipettip. </li></ol></li><li> Wijzig een 1.000 μL pipettip en een 1 ml spuit naaldkap om de connector te maken. <ol><li> Afsnijd 44 mm vanaf de opening van de punt. Neem een ​​6 mm lengte van een 1 ml spuit naaldkap en duw het stevig in het overblijvende segment van de 1000 μL pipettip. </li></ol></li></ol> 2. Bediening van het Strike Device <ol><li> Verdoof een enkele 2-daagse volwassen vrouwelijke vlieg met behulp van CO 2 op een vliegkussen. </li><li> Zet het voorzichtig naar de vlieghouder met een fijne borstel. Tik de houder voorzichtig op, zodat de vliegkop buiten het uiteinde wordt gezien. Als de vliegproblemen buiten het uiteinde wordt blootgesteld, steek het met een stompe 1 ml spuitnaald voorzichtig terug in de punt. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de vliegproblemen in de houder houdt. Anders kan de vlieg van een zuigende proboscisbeschadiging sterven. </li><li> Draai de vlieg hoGa naar de spuitvat met de connector zodat de vliegkop naar beneden gericht is. </li><li> Stel de gasdruk bij 100 kPa in. Stel de stromingssnelheid in volgens het experimentontwerp. </li><li> Draai de schakelaar van de regelregelaar snel in en uit zodat de schakelaar een keer de vliegkop trekt. </li><li> Til de vlieghouder op en beweeg het over een vliegkussen. Draai de vlieghouder omlaag en druk de kant zachtjes om de vlieg uit te laten. Laat de vlieg in een lege injectieflacon achterhalen. </li></ol> 3. Video-assisted Movement Tracking <ol><li> Vul een Petri-schotel met 6 cm diameter met transparant silicium elastomeer om het tracé te maken. Laat een 3 mm ruimte tussen de silicon en het afdekplaatje om de vliegen vrij te laten lopen maar niet te vliegen. </li><li> Verdoof elke keer vier vliegen van de sham of de behandelde groep en plaats ze in de arena. Laat de vliegen gedurende 1 uur bij 22 ° C liggen. </li><li> Plaats een CCD-camera (CCD) boven de arena&#39;s en record gedurende 5 minuten.</li><li> Analyseer de bewegende trajecten met behulp van Ctrax-software (vrij verkrijgbaar bij Caltech) 16 . Voer de opgeslagen gegevens uit in een programmeertaal (bv. Matlab) -compatibel formaat en analyseer de gegevens op basis van de afstand die per frame is gereisd 17 . Bereken de gemiddelde loopafstand voor elke vlieg en combineer het met alle andere opgenomen vliegen / groep om een ​​gemiddelde cumulatieve afstand te verkrijgen die door de populatie van bestanden in dezelfde groep is gereisd. </li></ol>

<ol><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+NINDS%2FNIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).</li>
<li>Martland, H. S. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/260461">Punch drunk.</a> JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).</li>
<li>Millspaugh, J. A. <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-0005984841&origin=inward&txGid=863ABC19BCEDFF53A3AD7536B601EEA3.wsnAw8kcdt7IPYLO0V48gA%3a2">Dementia pugilistica.</a> US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).</li>
<li>Omalu, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+a+national+football+league+player%3A+part+II%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II.</a> Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).</li>
<li>Goldstein, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+blast-exposed+military+veterans+and+a+blast+neurotrauma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model.</a> Sci Transl Med. 4 (134), (2012).</li>
<li>Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy%3A+where+are+we+and+where+are+we+going%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurol+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going?</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).</li>
<li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+disease+in+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy.</a> Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).</li>
<li>Petraglia, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+neurobehavioral+sequelae+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+novel+mouse+model+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy.</a> J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).</li>
<li>Littleton, J. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+synaptic+organization%3A+analysis+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome.</a> Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).</li>
<li>Appel, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Stubble-stubbloid+gene+encodes+an+apparent+transmembrane+serine+protease+required+for+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+hemolymph+sampling+and+analysis+of+individual+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster.</a> Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li>
<li>Barekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+an+integrated+model+to+study+mild+repetitive+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 25252(2016).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Inflict+Closed+Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila.</a> J Vis Exp. (e52905), (2015).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
<li>Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motmot%2C+an+open-source+toolkit+for+realtime+video+acquisition+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis.</a> Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).</li>
<li>Talavage, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally-detected+cognitive+impairment+in+high+school+football+players+without+clinically-diagnosed+concussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion.</a> J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).</li>
<li>Theadom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+impact+of+recurrent+traumatic+brain+injury+in+a+population-based+sample%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample.</a> J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).</li>
<li>Drobysheva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+histological+detection+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster.</a> J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).</li>
</ol>

Dit werk werd ondersteund door het Johns Hopkins University School of Medicine faculty startup fonds aan LC

Diermodellen die trouw model CTE-eigenschappen, met inbegrip van neurofysiologische veranderingen, neuropathologische kenmerken en neurobehaviorale tekorten, zijn essentieel voor het ontdekken van ziekte-mechanismen en voor het ontwikkelen van diagnostische en therapeutische doelen. Het is begrijpelijk dat geen diermodel van een menselijke ziekte perfect is om alle klinisch relevante eindpunten na te bootsen. Wij geloven echter dat een robuust CTE-model aan de volgende drie eisen moet voldoen: (1) de impact moet direct ...

Chronische Traumatische Encefalopathie (CTE) is onlangs herkend als een duidelijke neurodegeneratieve stoornis, los van andere tauopathieën zoals de ziekte van Alzheimer 1 . In tegenstelling tot de ziekte van Alzheimer en andere algemene tauopathieën - waarvan de belangrijkste risicofactoren de leeftijd en de familiegeschiedenis van dementie bevorderen, betekent CTE, zoals aangegeven door haar naam, een nauwe band met een geschiedenis van hersentrauma, die waarschijnlijk wordt gezien bij contactsporters, Zoals boksers en voetballers, evenals in militaire veteranen 2 , 3 , 4 , 5 . Het wordt vermoedelijk geïnitieerd door herhaaldelijke hersenschudding en subconcussieve klachten aan het hoofd. Patiënten kunnen symptomen en tekenen zoals cognitieve tekorten, stemmings- en gedragsveranderingen en bewegingsstoornissen voordoen, die aanzienlijk overlappen met de ziekte van Alzheimer, frontotemporaleDementie, Lewy body dementie en de ziekte van Parkinson 6 . Daarentegen onthullen post mortemonderzoeken van hersenweefsel een duidelijk patroon van hyperfosforyleerde tau-accumulatie rond kleine bloedvaten bij de diepten van de corticale sulci, een pathognomonale functie die niet in de andere degeneratieve aandoeningen is waargenomen 7 . Maar tot nu toe is zeer weinig bekend over de pathogenese die leidt tot ziekte manifestatie. Dit komt voornamelijk toe door het gebrek aan een getrouw diermodel - pas onlangs zijn knaagdiermodellen gegenereerd 5 , 8 . Deze modelorganismen hebben de nadelen van kostenintensieve zorg en een relatief lange levensduur, die niet goed geschikt zijn voor neurodegeneratieve ziekteonderzoeken. In vergelijking met zoogdieren tegenhangers zijn ongewervelde dieren zoals Drosophila een uitstekend alternatief, met hun kosteneffectieve onderhoud,Uitgebreide hulpmiddelen voor het dissecteren van genetische determinanten, en een relatief korte levensduur 9 . Opmerkelijk delen, vliegen en menselijke hersenen evolutionair geconserveerde moleculaire en cellulaire wegen, evenals anatomische overeenkomsten 10 , 11 , 12 . Twee ingenieuze Drosophila modellen om traumatisch hersenletsel te bestuderen zijn eerder gerapporteerd 13 , 14 . Het eerste &#39;High Impact Trauma&#39; (HIT) -apparaat, ontworpen door Katzenberger en collega&#39;s, bevatte vrij bewegende vliegen in een plastic flesje die vastgebonden was aan het vrije uiteinde van een metalen veer 13 , 15 . Toen de plastic flesje rechtop werd gekanteld en losgelaten, raakte het een polyurethaanpaneel en bracht trauma aan de vliegen toe, terwijl ze naar de flesmuur stoot en teruggingen. In tegenstelling tot hebben Barekat en collega&#39;s ons een andere leveringsmethode ontwikkeldIn het Omni Bead Ruptor-24 homogenisatorplatform 14 . Vliegen waren onbekwaam met CO 2 en geplaatst in een 2 ml schroefdopbuis die aan de homogenisator was bevestigd en onderworpen aan vooraf geprogrammeerde schudtoestanden. Een voordeel van het gebruik van het weefselhomogenisatorsysteem is dat de experimentator de intensiteit van de verwonding, de duur van de blessure en het aantal letselschade kan moduleren. Echter, beide regimes hebben hetzelfde nadeel: primaire verwondingen aan het hoofd worden willekeurig toegebracht in termen van de plaats van impact en kracht. Bovendien leidden beide methoden tot aanzienlijke sterfte, veroorzaakt door onvermijdelijk schade aan andere delen van het lichaam en inwendige organen. Hier beschrijven we een nieuwe methode om mTBI in fruitvliegen te veroorzaken. Ons apparaat bestaat uit een gasdreven ballistische impactor. In vergelijking met de bestaande Drosophila modellen 14 , 15 , heeft onze methode het unieke voordeel van het leveren van measHaalbare impact, die alleen gericht is op het vrij bewegende vliegkop, waardoor de nauwkeurige controle van verschillende factoren, zoals de ernst van de impact, het tijdsinterval tussen de impact en het totale aantal effecten die worden opgelopen, kunnen worden gecontroleerd.

<table><tbody><tr><td>Aerosol Barrier</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>Gebaten als een impactor</td></tr><tr><td>200 &#956;L Pipette Tip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td>Gebaten als een vliegkophouder</td></tr><tr><td>1000 &#956;L Pipette Tip</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>Gebaten als een connector</td></tr><tr><td>1 mL Tuberculin Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>Gebaten als een volgarena</td></tr><tr><td>Flow Regulator</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WC</td><td></td></tr><tr><td>Standard Clamp Holder/stand</td><td>EISCO Scientific</td><td>CH0688</td><td></td></tr><tr><td>Fine Brush</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td></td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td>HD-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ctrax Walking Fly Tracker</td><td>Caltech</td><td>Ctrax 0.2.11</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Image Processing Toolbox</td><td>MATLAB</td><td>R2015b</td><td></td></tr></tbody></table>

een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in<em&gt; drosophila</em

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

Chronische Traumatische Encefalopathie (CTE) is een gevestigde neurodegeneratieve ziekte die nauw verband houdt met blootstelling aan herhalende milde traumatische hersenletsel (mTBI). De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor zijn complexe pathologische veranderingen blijven grotendeels ontwijkend, ondanks een recente consensus om de neuropathologische criteria te definiëren. Hier beschrijven we een nieuwe methode om een ​​model van CTE in Drosophila melanogaster ( Drosophila ) te ontwikkelen in een poging om de belangrijkste genen en pathways te identificeren die leiden tot de kenmerkende hyperfosforyleerde tau-accumulatie en neuronale dood in de hersenen. Verstelbare sterkte-effecten om zacht gesloten letsel te veroorzaken worden direct aan de vliegkop afgeleverd, waarbij het hoofd wordt onderworpen aan snelle versnelling en vertraging. Onze methode elimineert de mogelijke problemen die inherent zijn aan andere Drosophila mTBI-modellen ( bijv. De dierlijke dood kan worden veroorzaakt door schade aanAndere delen van het lichaam of aan inwendige organen). De minder arbeids- en kostenintensieve dierenverzorging, korte levensduur en uitgebreide genetische hulpmiddelen maken de vruchtvlieg ideaal om CTE pathogenese te bestuderen en het mogelijk maken grootschalige genoomwijdte genetische en farmacologische schermen te verrichten. We anticiperen dat de voortgaande karakterisering van het model belangrijke mechanistische inzichten zal genereren over ziektepreventie en therapeutische benaderingen.

Om een ​​CTE-model op te stellen met behulp van volwassen Drosophila , hebben we de effectiviteit van ons apparaat bepaald door een enkele schade aan het hoofd te veroorzaken. Om de variaties die verband houden met genotype, geslacht of leeftijd te elimineren, hebben we 2-daagse Canton-S WT-vrouwelijke vliegen gebruikt in het experiment. We kunnen de sterkte van de impactor gemakkelijk regelen door de stromingssnelheid van CO 2 te reguleren bij een constante gasdruk v...

Hier beschrijven we een nieuwe aanpak om traumatisch hersenletsel in Drosophila melanogaster te veroorzaken . Onze methode heeft het voordeel om herhaalde effecten te leveren met instelbare sterkte aan het hoofd alleen. Verdere verkenning van het ongewervelde systeem zal helpen bij het verlichten van de pathogenese van chronische traumatische encefalopathie.

Een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in<em&gt; Drosophila</em

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

Het algemene doel van deze nieuwe procedure is het toebrengen van gesloten traumatisch hersenletsel bij de fruitvlieg, Drosophila, om een nieuw model voor chronische traumatische encefalopathie vast te stellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van chronische traumatische encefalopathie, zoals de wijze waarop repetitief trauma neuronale degeneratie induceert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het repetitieve impacts met instelbare sterkte direct op de kop van de vlieg kan leveren zonder schade aan andere delen van het lichaam van het dier te veroorzaken.Een demonstratie van deze methode in de praktijk is essentieel, aangezien de assemblage van het apparaat en de stappen voor het laden van de vliegen moeilijk aan te leren zijn; de kop van de Drosophila is namelijk erg klein en het is belangrijk dat de impact uitsluitend op de kop wordt uitgeoefend. Om het apparaat te maken waarmee de fruitvliegen worden geschud of geslagen, wordt eerst het slaggedeelte van het apparaat vervaardigd. Verwijder de zuiger uit een polycarbonaat tuberculinespuit van 1 mL en snijd vervolgens de cilinder door bij de markering van 1 mL.Gebruik als impactor de aerosolbarrière van een 200 µL pipetpunt. Deze impactor moet drie mm lang en vier mm in diameter zijn. Plaats de impactor vervolgens in de spuitcilinder met de vlakke zijde richting de tuit.Om kracht uit te oefenen, bevestigt u de spuitcilinder aan een koolstofdioxide-stroomregelaar. De regelaar moet voorzien zijn van een aan/uit-schakelaar en een goede controle over de gasstroomsnelheid. Klem de cilinder vervolgens verticaal vast aan een statief, zodanig dat de impactor naar de bodem van de cilinder zal vallen.Maak vervolgens de vliegenhouder. Begin met een 200 µL pipetpunt. Snijd de punt van de pipet vijf millimeter vanaf het kleine uiteinde af om een opening van 8 millimeter diameter te creëren.Een vliegenkop past door dit gat, maar het thoraxsegment niet. Maak tot slot de vliegenhouder en het impactorapparaat. Knip eerst een pipetteertip van 1 ml op 44 mm van de kleine opening af.Snijd vervolgens een stuk van zes millimeter af van de naaldbescherming van een spuit van één milliliter. Druk daarna de twee delen samen. Anestheseer een enkele, twee dagen oude volwassen vrouwelijke vlieg met koolstofdioxide.Gebruik vanaf het koolstofdioxidekussen een fijn penseel om de vlieg voorzichtig naar de houder over te brengen. Tik vervolgens zachtjes tegen de houder aan tot de kop uit de punt steekt. Indien de proboscis zichtbaar is, gebruik dan een stompgebeerde naald van een een milliliter spuit om deze voorzichtig terug in de punt te duwen.Het is cruciaal om het lichaam van de vlieg, en met name de monddelen, in de houder te houden. Anders kan de vlieg sterven door beschadiging van de interne organen of door het onvermogen om voedsel op te nemen. Stel vervolgens de gasdruk in op 100 kilopascals en pas de doorstroom naar behoefte aan.Zodra de vlieg is geplaatst, zet u de houder met de connector vast aan de spuitcilinder, zodelijk dat de kop van de vlieg naar beneden is gericht. Stuur vervolgens met de schakelaar een gasstoot, waardoor de impactor de vlieg één en slechts één keer raakt. Verwijder nu de vlieghouder en plaats de vlieg terug op het koolstofdioxidekussen.Borstel de vlieg in een leeg vial tot deze zich heeft hersteld. Houd één vlieg per vial. Het herstel duurt slechts enkele minuten.Herhaal het proces om vier vliegen per experimentele groep te testen. Het verwerken van twee groepen, een testgroep en een sham-groep, zou slechts 20 tot 30 minuten in beslag nemen. Behandel de sham-dieren op dezelfde wijze als de testdieren, maar plaats geen aerosolbarrière in de impactorbuis.Om de bewegingen van vliegen in een Petrischaal te volgen, vult u eerst een schaal van zes centimeter met transparant siliconen elastomeer om de trackingarena te maken. Laat een opening van drie millimeter tussen het siliconen en het deksel, zodat vliegen vrij in de opening kunnen lopen, maar niet kunnen opstijgen. Plaats een witte achtergrond onder de trackingarena.Anestheseer vervolgens vier vliegen uit dezelfde behandelingsgroep en plaats deze in de arena. Laat de vliegen een uur acclimatiseren aan de arena, die volledig verlicht moet zijn en een temperatuur van ongeveer 22 °C moet hebben. Niet warmer dan de kamertemperatuur.Gebruik na een uur een charge-coupled device camera die boven de arena is geplaatst om de activiteit van de vlieg gedurende vijf minuten op te nemen. Narcoseer de vliegen in de arena na de opname van vijf minuten en plaats ze terug in een nieuw huisvial. Voer vervolgens de arena af.Analyseer de opnames later met behulp van de gratis beschikbare Ctrax-software. Deze software genereert trackinggegevens, die kunnen worden geëxporteerd in een formaat dat compatibel is met programmeertalen, zoals het MATLAB-formaat. Bereken op basis van de gegevens de afgelegde afstand per frame, de gemiddelde loopafstand voor elke vlieg en de gemiddelde afstand die per vlieg is afgelegd.Voor statistische significantie dient ongeveer 100 vliegen per behandelingsgroep te worden getest. Om een model voor chronische traumatische encefalopathie op te stellen, werd de effectiviteit van een enkele, gesloten hoofdwond veroorzaakt door het impactapparaat bij verschillende snelheden geanalyseerd met behulp van twee dagen oude Canton-S vrouwtjes. De gasdruk werd gehouden op 100 kilopascals.Vliegen die werden blootgesteld aan een enkele slag bij de hoogste geteste stroomsnelheid, vertoonden minimale externe defecten. Ondanks het ontbreken van duidelijk bewijs voor externe schade, waren letsels bij een stroomsnelheid van 15 liter per minuut acuut letaal, wat resulteerde in een overleving van minder dan 10% binnen 24 uur. De overleving nam toe bij lagere stroomsnelheden.Er werd een overleving van honderd procent behaald bij vijf liter per minuut of minder, waardoor vijf liter per minuut werd gekozen als standaard voor het model. Kort na de klap kregen de vliegen geleidelijk hun mobiliteit terug binnen vier minuten. Het herstel bij de sham-groep was ongeveer een minuut sneller.Na de impact werd video-ondersteunde bewegingsregistratie gebruikt om de locomotieve functie te meten. Gedurende de twee dagen na de impact keerde de voortbeweging langzaam terug naar normaal. Dit bewijs voor geleidelijk herstel komt overeen met het herstel van CTE bij mensen.Om de langetermijneffecten te evalueren, werd een repetitief protocol voor traumatisch hersenletsel toegepast, bestaande uit vijf slagen verspreid over vijf dagen. Twintig dagen na de behandeling werd de locomotie van de overlevende leden in elke groep vergeleken, waarbij de behandelde groep duidelijk minder liep. De levensduur van de behandelde groep was ook aanzienlijk verkort, met een mediaan van 26 dagen vergeleken met 37 dagen voor de controles.Na de ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van mild repetitief traumatisch hersenletsel om pathogene mechanismen te onderzoeken in het klassieke diermodel Drosophila melanogaster. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de proboscis, thorax en abdomen te beschermen tegen directe impact door de aerosolbarrière.

a-novel-method-to-model-chronic-traumatic-encephalopathy-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gedrag assays voor het meten van motorische functies, leren en geheugen capaciteiten...

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Deze video beschrijft hoe je vrij lopende vliegen kunt volgen om hun algemene bewegingsvermogen te beoordelen. Het aanbevolen protocol demonstreert de installatie en gegevensanalyse van de test met behulp van videotrackingsoftware.

Vrij lopende vliegen volgen: een methode om voortbeweging in Drosophila te beoordelen

This video demonstrates a procedure to inflict a closed-head traumatic injury in anesthetized Drosophila flies using a strike device with a gas-propelled impactor. The injury affects neuronal function and impairs walking ability.

A Technique to Inflict Closed-Head Traumatic Brain Injury in Drosophila Flies

The video demonstrates the use of a High-Impact Trauma (HIT) device to induce closed-head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. TBI causes mechanical brain trauma affecting neuronal function, which over time leads to neurodegeneration and mortality.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

This video demonstrates the induction of penetrating traumatic brain injury in the drosophila brain. Newly emerged flies are selected, anesthetized, and positioned under a fluorescence-equipped stereo microscope. The GFP-expressing mushroom body is identified, and a Minutien pin is inserted to cause injury. The flies are allowed to recover for further studies.

Inducing Penetrating Traumatic Brain Injury in Adult Drosophila Flies

We beschrijven hier de procedures voor de extractie en zuivering van mRNA en metabolieten...

Zuivering van Afschriften en metabolieten van<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoofden

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren...

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

We presenteren een geoptimaliseerde, goedkope en betrouwbare negatieve geotaxistest in Drosophila melanogaster als model voor neurodegeneratieve aandoeningen. Omdat deze test gevoeliger is voor lichte locomotieve defecten, zal deze helpen bij het screenen op mogelijke genetische interacties en doelwitten voor geneesmiddelen.

Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

Hier wordt een methode beschrijven we gesloten hoofd traumatisch hersenletsel (TBI) toebrengen in Drosophila. Deze methode biedt een toegangspoort tot de cellulaire en moleculaire mechanismen die TBI pathologieën met behulp van de enorme serie van experimentele instrumenten en technieken beschikbaar voor het vliegen ten grondslag liggen te onderzoeken.

Een methode om Closed Head Traumatic Brain Injury Inflict in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.

Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in<em&gt; Drosophila</em

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Ontdek een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in Drosophila melanogaster. Deze techniek levert gecontroleerde, herhaalde impacten rechtstreeks op het hoofd om neuronale degeneratie te bestuderen.

Een nieuwe methode om chronische traumatische encefalopathie te modelleren in

Meer video's verkennen