Video Tracking Protocol voor Screen Deterrent Chemistries voor Honingbijen

Het algemene doel van deze procedure is het evalueren van chemische afschrikkingsmiddelen voor honingbijen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de entomologie, zoals welke chemicaliën het gedrag van honingbijen beïnvloeden om weg te blijven van een voedselbron. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een eenvoudige aanpak biedt om chemische afschrikkingsmiddelen voor honingbijen op een relatief snelle en gemakkelijke manier te screenen.

Om een suiker-agarosekubus voor de controlebehandeling voor te bereiden, giet u een half afgekoelde suiker-agarose-oplossing in een weegbakjesmal. Voor de repellentbehandeling voegt u de gewenste hoeveelheid verbinding toe aan de half afgekoelde agarose-oplossing. In deze demonstratie wordt een eindconcentratie van 1% DEET gebruikt.

Wals de kolf om de verbinding te mengen en giet de oplossing vervolgens in een weegbakjesvorm. Nadat de suiker-agaroseblokjes zijn afgekoeld, worden de gestolde blokjes uit de weegbakjesvormen verwijderd en in een plastic bak met een vochtige papieren handdoek geplaatst. Plaats de bakken in een koelkast voor bewaring.

Navigeer in de trackingsoftware naar de experimentinstellingen in de experimentverkenningsbalk, die zich aan de linkerkant van het scherm bevindt. Controleer of de juiste camera is geselecteerd en of de video-opname is gecentreerd op de Petri-schaal arena's. Als de video-opname gecentreerd moet worden, ga dan naar de camera-instellingen onder de bedieningselementen voor het interessegebied (area of interest) en selecteer de opties Center X en Center Y.

Wijzig onder experimentinstellingen het aantal arena's naar 16. Selecteer onder gevolgde kenmerken de detectie van het middelpunt. Selecteer vervolgens arena-instellingen om de gewenste arena voor de assay in te stellen.

Plaats de 16 Petrischalen in een patroon van vier bij vier bovenop een lichtbak die onder de camera is gepositioneerd. Gebruik in de arena-instellingen de knop 'grab background' in het gereedschappenpaneel aan de rechterkant om een foto van de 16 Petrischalen te maken. Deze wordt gebruikt als sjabloon voor het instellen van de arena.

Selecteer 'create ellipse' uit de werkbalk bovenaan het scherm met arena-instellingen en maak een cirkel die overeenkomt met de diameter van een van de Petrischalen in de vastgelegde afbeelding. Plaats marker één van de arena in de cirkel. Selecteer vervolgens zonegroep één, die zich onder arena één in het gereedschapspanel aan de rechterkant bevindt.

Selecteer 'rechthoek maken' in de werkbalk bovenaan het scherm. Maak met dit hulpmiddel een vierkant van 30 bij 30 pixels. Plaats dit vervolgens in het midden van de cirkel die in de vorige stap is gemaakt.

Selecteer 'add zone' uit de bovenste werkbalk en klik vervolgens in het midden van het vierkant. Verplaats de zone één markering zodat deze in het vierkant staat. Selecteer vervolgens 'arena one' in het gereedschapspaneel aan de rechterkant en klik op 'duplicate complete arena'.

Select in het vervolgkeuzemenu alle andere arena's en klik vervolgens op OK. Verplaats de gedupliceerde arena-instellingen naar de overige Petrischalen in de vastgelegde afbeelding. Selecteer vervolgens arena één en klik op 'calibrate scale' in de bovenste werkbalk. Trek de kalibratielijn over de diameter van de Petrischaal van arena één.

Wijzig de diametermeting naar negen centimeter. Selecteer 'validate arena settings' in het gereedschapspaneel aan de rechterkant. Selecteer vervolgens 'detection settings' in de controlebalk aan de linkerzijde.

Selecteer detectie-instellingen één en selecteer vervolgens grijswaarden in het vervolgkeuzemenu in de gereedschapskist aan de rechterkant. Stel onder detectie het bereik in op nul tot 83. Klik met de rechtermuisknop op detectie-instellingen en maak een nieuwe instelling aan met de naam Detectie-instellingen twee.

Zorg ervoor dat grijswaarden nog steeds zijn geselecteerd, maar wijzig de andere parameters niet. Selecteer de proeflijst in de experimentele explorer en klik op 'variabele toevoegen' in de bovenste werkbalk. Noem de gebruikersgedefinieerde variabele Treatment.

Selecteer de vervolgkeuzelijst voor vooraf gedefinieerde waarden in de kolom voor door de gebruiker gedefinieerde behandeling en voeg 'controle' en 'behandeling' toe als vooraf gedefinieerde waarden. Klik op de knop 'proeven toevoegen' in de bovenste werkbalk en voeg twee proeven toe. Selecteer vervolgens voor elke arena of het een controle-arena of een behandelingsarena is.

Select vervolgens data profiel in het experiment explorer-paneel. Selecteer in de linkerkolom treatment, te vinden onder de kop user defined independent variables. Hierdoor wordt er een filtervak toegevoegd aan het gebied met het stroomdiagram.

Selecteer C in het pop-upvenster en plaats het nieuw aangemaakte filter vervolgens tussen het startvak en het resultaatvak. De pijlen in het stroomdiagram moeten zich zo aanpassen dat ze van het startvak naar het filter en tenslotte naar het resultaatvak wijzen. Herhaal deze stap, maar selecteer dit keer T voor het filter en selecteer vervolgens resultaat onder de sectie met gemeenschappelijke elementen.

Verplaats de nieuw aangemaakte kaders naar het stroomdiagramgebied, verbind de kaders met pijlen en sla het bestand op. Start het programma voor visuele tracking op en open het opgeslagen experimentele bestand dat voor deze assay is aangemaakt. Selecteer detectie-instellingen twee.

Plaats vervolgens controle-suiker-agarosekubussen in het midden van acht van de 16 Petrischalen. Herhaal dit proces met de suiker-agarose-verbindingkubussen in de overige acht schalen. Gebruik een pincet om één honingbij uit de plastic doos te halen en deze in een van de controleschalen te plaatsen.

Herhaal deze stap voor de resterende 15 Petrischalen. Plaats alle schalen op de lichtbak. Verlicht de lichtbak van onderaf met een reeks LED-lampen ingesteld op het rode spectrum en positioneer deze zodanig dat de arena-detectiegebieden passen in de arena's van elke Petrischaal.

Omring de gehele box en camera met een zwart plastic zeil om extern licht te elimineren en schaduwen binnen de arena's te verminderen. Nadat de Petrischalen zijn geplaatst, dient u te controleren of detectie-instelling één is geselecteerd. Op dit punt zou de visuele trackingsoftware alleen de honingbijen binnen de Petrischaal-arena's moeten detecteren.

Select vervolgens acquisitie in de experiment explorer. Druk op de groene knop 'start trial' in het pop-upvenster voor acquisitiebesturing aan de rechterkant om te beginnen met opnemen. Voer de assay 10 minuten lang uit en klik vervolgens op de rode knop 'stop trial' in het pop-upvenster voor acquisitiebesturing om de opname te stoppen.

Hier worden representatieve resultaten getoond van het effect van DEET op het voedingsgedrag van individuele honingbijen. De individuen die werden blootgesteld aan de controlekubussen brachten gemiddeld 343 seconden door in de voedingszone, vergeleken met 16 seconden voor individuen die werden blootgesteld aan kubussen met DEET. Hier worden representatieve resultaten getoond van de effecten van twee verschillende verbindingen op het voedingsgedrag van individuele honingbijen.

Individuen die werden blootgesteld aan een niet-afschrikkende verbinding brachten gemiddeld 282 seconden door in de voedingszone, vergeleken met de controlegroep, die daar ongeveer 352 seconden doorbracht. Blootstelling aan een afschrikkende verbinding resulteert erin dat individuen een significant kortere tijd, ongeveer 23 seconden, in de voedingszone doorbrengen, vergeleken met de controles die gemiddeld 493 seconden in de zone doorbrachten.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 20 minuten worden uitgevoerd mits dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden alles vooraf voor te bereiden en de honingbijen gedurende een adequate periode te laten vasten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de effecten van een verbinding die in een voedingsbron is geïnfuseerd op individuele honingbijen kunt bepalen met behulp van videotracking-software.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals near-field en field-assays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over het effect van een verbinding op kolonieniveau. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de entomologie om nieuwe chemische stoffen en hun effecten op het voedingsgedrag van honingbijen te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met verbindingen extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, bij het uitvoeren van deze procedure.