Precise Cellular Ablation Approach voor het modelleren van acute nierbeschadiging bij het ontwikkelen van zebravis

Het algemene doel van deze procedure is om gerichte ablatie van epitheelcellen in de nieren van zebravissen te induceren om nefronbeschadiging en -herstel te modelleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het vakgebied van orgaanregeneratie, en specifiek nierregeneratie. Zoals: wat zijn de belangrijkste cellulaire processen die betrokken zijn bij regeneratie, wat is de mate van plasticiteit van overlevende weefsels, en nog vele anderen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeurige spatiotemporele controle van de letselschade mogelijk maakt, evenals de mogelijkheid om de mate van letsel aan te passen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van acuut nierfalen, omdat het een nauwkeurige ruimtelijke en temporele beoordeling mogelijk maakt van de cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij nierschade en regeneratie. Begin met het genereren van embryo's door GFP-fluorescerende Zebrafish voor de nieren te kruisen.

Houd de embryo's gedurende 24 uur na de bevruchting in E3-oplossing bij 28,5 °C. Vervang vervolgens het E3-medium door 0,003% PTU in E3. Plaats de embryo's voor zes of meer dagen terug in de incubator, waarna de nieren volgroeid zijn.

Om de Zebrafish te fixeren voor live imaging, bereidt u 1% tot 2% laagsmeltende agarose voor met een trigaine-oplossing van 0,2 milligram per milliliter. Zorg dat de agarose-trigaine-oplossing is afgekoeld voordat u een plastic of glazen pipet gebruikt om een embryo in de oplossing over te brengen. Trek vervolgens met een transferpipet de larve in de agarose op en plaats deze in het midden van een schaal van 35 millimeter.

Spreid de agarose met de Zebrafish snel uit zodat de bodem van de schaal gelijkmatig wordt bedekt. Gebruik vervolgens een glazen probe om de larve te positioneren voor foto-ablatie en beeldvorming, zodanig dat het betreffende niersegment loodrecht op het straalpad staat, terwijl het contralaterale segment zich buiten de laserstraal bevindt. De oriëntatie van de Zebrafish is cruciaal voor de volgende stappen met betrekking tot laserablatie.

Er wordt een goede techniek geadviseerd om ervoor te zorgen dat de larven een loodrechte positie in de agarose behouden. Dek de Petrischaal af om verdamping te minimaliseren en laat de agarose ongeveer 15 minuten uitharden. Nadat de confocale microscoop is ingesteld volgens het tekstprotocol in de rechtopstaande configuratie, plaatst u de Petrischaal met de larve bovenop een objectglas en gebruikt u boetseerklei om deze op zijn plaats te houden.

Plaats vervolgens de schuifbare Petrischaal op de objecttafel van de microscoop. Voeg daarna drie milliliters imaging-oplossing toe. Verhoog onder een waterdompellens langzaam de tafel, waarbij u erop let dat de lens iets schuin staat om te voorkomen dat er luchtbellen in de lichtstraal terechtkomen.

Zodra de lens de oplossing onder een hoek raakt, centreert u deze zodat deze zich in het gezichtsveld bij het embryo bevindt. Zoek nu, met behulp van de fluorescentielichtbron, het segment van belang en focus vervolgens op de oppervlakkige tak om deze te selecteren voor beschadiging. De oppervlakkige takken zijn gekozen om lichtverstrooiing te minimaliseren.

Navigeer in de microscoopsoftware naar view, acquisition control, C2plus compact GUI. Stel de pixelverblijftijd in op 1,9 microseconds, de framegrootte op 512 bij 512 pixels en de pinhole-diameter op 90 microns. Zet de intensiteit van de 405 nanometer laser op nul en de intensiteit van de 488 laser op een lage waarde.

Klik, terwijl u de 488 nanometer laser gebruikt, op 'scan' in de software-interface. Zoek het segment van belang dat loodrecht op het straalpad staat en dat goed gevisualiseerd wordt met een sterke GFP-fluorescentie. Zodra dat gebied is geïdentificeerd, gaat u naar ROI en kiest u 'draw elliptic ROI' om een regio van belang te tekenen.

Ga vervolgens naar 'view', 'acquisition controls', 'C2plus scan area' en kies 'band scan area'; het rechthoekige masker zal in die interface verschijnen. Definieer handmatig met de cursor een rechthoekig scangebied dat het segment bestemd voor laserablatie beslaat. Klik met de rechtermuisknop binnen het maskergebied om de selectie te accepteren.

Gebruik uitsluitend de 488 nanometer laser om GFP te activeren en start de tijdmeting terwijl u het groene kanaal monitort. Zorg ervoor dat de intensiteit van de 488 laser relatief laag is. Meet de gemiddelde intensiteit van het GFP in het gebied van interesse door te selecteren op measure, time measurement.

Gebruik het tabblad grafiek of gegevens om de gemiddelde intensiteitsniveaus binnen de ROI te monitoren. Induceer met de violette laser schade aan de niercellen door de intensiteit naar 100% te verhogen door de regelaar voor laservermogen helemaal naar rechts te schuiven. Observeer in het tabblad grafiek een lijngrafiek of gebruik het tabblad gegevens om de numerieke waarden van de GFP-intensiteit te observeren en wacht tot deze is gedaald naar een gewenst niveau.

Bijvoorbeeld 50% van de basislijn. Zodra de GFP-intensiteit binnen de elliptische ROI is gedaald tot het gewenste niveau, verlaagt u onmiddellijk de intensiteit van de violette laser naar nul in het softwarebedieningspaneel door de schuifregelaar voor laservermogen geheel naar links te bewegen. Bepaal tot slot een nieuwe basislijn van de GFP-fluorescentie.

Zoals in deze figuur te zien is, blijft de GFP-fluorescentie na blootstelling aan laserlicht van 405 nanometer cel voor cel verdwijnen. Totdat na 220 minuten het gehele ablatiesegment 100% van zijn GFP-positiviteit verliest. Dit is het gevolg van celdood en niet van een neerwaartse regulatie van de GFP-expressie, zoals blijkt uit de verschijning van rood fluorescent propidiumjodide-positieve kernen in de cellen die hun GFP-positiviteit verliezen.

Deze afbeeldingen tonen aan dat het door het variëren van de initiële blootstelling mogelijk is om de schade en de respons van het beschadigde epitheel nauwkeurig af te stellen. Bij 10% tot 20% initiële GFP-fotobleking is er vijf uur na de beschadiging vrijwel geen afname van de GFP-positiviteit waarneembaar. 50% en 60% leiden tot een volledige verdwijning van GFP na vijf uur, terwijl 30% en 40% bleking leiden tot tussenliggende resultaten, waarbij een geschatte sterfte van 50% wordt waargenomen bij ongeveer 35% fotobleking.

Dit wordt ondersteund door propidiumjodide-kleuring, waarbij 20% fotobleken resulteert in nagenoeg geen propidiumjodide-kleuring 100 minuten na ablatie. Echter leidt 50% fotobleken tot continue propidiumjodide-positiviteit in het geablateerde epitheel na 60 minuten. Terwijl 30% en 40% fotobleken leiden tot een tussenliggende incorporatie van propidiumjodide.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 30 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Houd er rekening mee dat het werken met lasers en chemische reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het vermijden van direct zicht op de laserstraal en het dragen van handschoenen bij het hanteren van chemicaliën, moeten tijdens deze procedure altijd worden in acht genomen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals time-lapse microscopie, immunofluorescentiekleuring en andere technieken, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden die gericht zijn op het ontleden van nierbeschadiging en -herstel op cellulair en moleculair niveau.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van nierregeneratie. Om de rol van collectieve celmigratie en nierherstel na letsel bij Zebravissen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u confocale microscopie kunt gebruiken om specifieke niersegmenten te beschadigen in GPF-transgene Zebravislarven en -embryo's.