Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Het algemene doel van deze procedure is het meten van microtubuli-dynamiek in gistcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de microtubuli, zoals de wijze waarop mutaties in tubuli en microtubuli-regulatoren de microtubuli-dynamiek in een levende cel reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat levende gistcellen in het beeld worden gestabiliseerd.

In plaats daarvan wordt een hoge tijdsresolutie voor tien minuten, of een lage tijdsresolutie voor enkele uren gebruikt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Colby Fees en Cassi Estrem, twee promovendi uit mijn laboratorium. De gistcellen die in dit experiment worden gebruikt, zijn zo geconstrueerd dat ze constitutief GFP-gelabelled tubuline tot expressie brengen.

Inoculeer ongeveer 1 µL van de gistcellen van een enkele kolonie op een plaat in 3 mL synthetisch compleet medium. Laat de cellen overnacht groeien bij 30 °C met schudden op 250 RPM. Verdun de verzadigde cultuur de volgende dag in het medium tot een OD600 van minder dan 0,1.

Plaats de verdunde cultuur gedurende drie tot vier uur terug in de schudmachine bij 30 degree Celsius, of totdat de OD600 tussen 0,4 en 0,8 ligt. Begin met de bereiding van de flowchamber-preparaten door een vel paraffinefolie te knippen in een stuk van vier inch breed en zeven inch lang. Plaats een standaard microscoopglas in de lengte op de breedte van vier inch van de paraffinefolie en wikkel de folie drie tot vier keer om het glas, zodat het glas bedekt is met folie van drie tot vier lagen dik.

Druk de lagen op elkaar om een goede afdichting te garanderen, maar voorkom dat u te hard drukt of dat de folie gaat kreukelen. Gebruik een schoon stanleymesje en een ander objectglas om een rechte snijrand te vormen, en snijd de paraffinefolie langs de buitenranden van het objectglas door. Pel de overtollige folie van het objectglas af en gooi deze weg.

Gebruik de tweede objectglas als liniaal om de gestapelde folielaag langs de lange as van het glas in ongeveer 10 stroken te snijden, elk met een breedte van twee tot vier millimeter. Snijd vervolgens de gestapelde paraffinefolielaag loodrecht op de vorige sneden langs de korte as van het glas om stroken te creëren met een breedte van twee tot vier millimeter, een lengte van 23 tot 24 millimeter en een dikte van drie tot vier lagen. Gebruik een scheermesje in een hoek van 45 graden om de gesneden foliestroken los te pellen.

Gebruik vervolgens een pincet om de gesneden strips gelijkmatig te verdelen over een schoon microscoopglisje om het gewenste aantal kamers te creëren. In dit voorbeeld worden vier filmstrips gebruikt om drie kamers te maken. Plaats een enkel dekglas bovenop de filmstrips en schuif dit met een pincet op de juiste positie.

Plaats het voorbereide preparaat, met het dekglas naar boven, op een warmteplaat die is ingesteld op ongeveer 95 degrees celsius, en verhit het preparaat gedurende ongeveer drie minuten totdat de paraffinestrips doorschijnend zijn. Versmelt het preparaat en het dekglas door met een pincet voorzichtig te drukken op de delen van het dekglas die zich direct boven de paraffinestrips bevinden. Gebruik een pincet om het preparaat van de warmteplaat te verwijderen en leg het opzij om af te koelen met de zijde van het dekglas naar boven.

Terwijl het preparaat afkoelt, krijgt de film weer een wit ondoorzichtige kleur. Om met deze procedure te beginnen, ontdooit een bevroren aliquot van 200 microliter Concanavalin A bij kamertemperatuur. Voeg ongeveer 100 microliter ontdooid Concanavalin A toe aan elke kamer van het geprepareerde preparaat door dit via een van de open uiteinden te pipetteren.

Hang het preparaat vervolgens, met het dekglas naar beneden, gedurende vijf minuten tussen twee microcentrifugebuisrekjes om de Concanavalin A aan het dekglas te laten hechten. Plaats het preparaat terug in een positie met het dekglas naar boven en verwijder de Concanavalin A door de kamer te wassen met synthetisch compleet medium. Laat een volume medium dat tweemaal het volume van de kamer bedraagt door de kamer stromen door de hoek van een papieren handdoek te gebruiken om vloeistof uit het ene uiteinde van de kamer te trekken, terwijl er gelijktijdig verse vloeistof in het andere uiteinde van de kamer wordt gepipetteerd.

Laad de cellen door tweemaal het volume van de kamer aan cel-suspensie in te voeren met de directed flow-methode. Laat het objectglas 10 minuten hangen, met de dekglaszijde naar beneden, zodat de cellen aan het dekglas kunnen hechten. Spoel alle niet-hechtende cellen weg door viermal het volume van de kamer aan synthetisch compleet medium door te spoelen.

Droog elk uiteinde van de kamer voorzichtig af met een schoon hoekje van een papieren handdoek, waarbij de meniscus tot aan de rand van het dekglas wordt gebracht. Afdichten van elk uiteinde van de kamer met warm afdichtmiddel. De beeldacquisitie wordt uitgevoerd met een omgekeerde microscoop uitgerust met een 1,45 NA 100X CFI Plan Apo objectief, een piëzo-elektrische tafel, een spinning disc confocale scaneenheid, een illuminatielaser en een EMCCD-camera.

Houd de temperatuur van de tafel op kamertemperatuur tijdens de beeldacquisitie. Stel de cellen scherp en zoek op het preparaat naar cellen die bij elkaar gegroepeerd zijn, om er zeker van te zijn dat het acquisitieveld ten minste vijf tot zes cellen bevat die in hetzelfde brandvlak geclusterd zijn. Programmeer een multidimensionale acquisitie om meerdere zSeries gedurende een bepaalde tijd te verzamelen.

Pas de instellingen binnen de actieve acquisitie-instellingen als volgt aan: een totale Z-diepte van 6 µm om de gehele gistcel te omvatten, een Z-stapgrootte van 300 nm om de lichtcollectie te maximaliseren zonder oversampling, een totale tijdsduur van 10 minuten, tijdsintervallen van 4 seconden tussen de zSeries en een belichtingstijd van 90 ms voor elk Z-vlak. Start de acquisitie door op Run te klikken en laat deze de volledige duur van 10 minuten doorlopen. De gegevens worden opgeslagen als een beeldserie, en een voorbeeldresultaat van time-lapse imaging wordt hier getoond.

Start de beeldanalyse door ImageJ te openen en de verkregen beeldstapel direct naar het controlepaneel te slepen. De Bio-Formats import zal automatisch starten. Selecteer "Okay" om de beeldstapel als een hyperstack te laden.

Gebruik de ZProject-functie om elke zSeries samen te voegen tot een tweedimensionale projectie van maximale intensiteit. Pas een mediaanfilter toe op de beeldstapel om spikkelruis te verminderen door het procesmenu, het filter-submenu en de mediaanfunctie te selecteren. Voer 2,0 pixels in het vak voor de straal in en klik op Ok. Identificeer de pre-NFA-cellen in het gezichtsveld.

Deze worden gekenmerkt door middelgrote knoppen en een korte mitotische spoel van ongeveer 1 tot 1,5 µm lengte. Begin bij het eerste tijdstip van de beeldserie en gebruik de tool voor gesegmenteerde lijnen om een lijn te trekken langs een enkele astrale microtubule, vanaf de junctie tussen de astrale microtubule en de intenser gelabelde spoelmicrotubules naar het pluseinde, dat zich in het cytoplasma bevindt. Dubbelklik op het uiteinde van de microtubule om de gesegmenteerde lijn te voltooien.

Registreer de meting in de resultatentabel met de meetfunctie door op de M-toets op het toetsenbord te drukken. Nadat de metingen voor alle tijdstippen zijn uitgevoerd, kopieert u de gegevens uit de resultatentabel, plakt u deze in een spreadsheet en selecteert u "Opslaan als" om de gegevens te selecteren. Deze afbeelding toont een tijdserie van de dynamiek van astrale microtubuli in een wild-type cel en in een mutante stam waarvan eerder is aangetoond dat deze stabielere microtubuli heeft.

Microtubuli worden gelabeld met GFP-getagde alfa-tubuline om de lengte van de microtubuli te visualiseren. De rode pijlen volgen de totale lengte van een astrale microtubulus, waarbij de pijlpunten de plus-uiteinden aangeven. De lengten van de microtubuli werden op elk tijdstip gedurende acht minuten gemeten, en deze verzamelde lengten zijn weergegeven in levensduurplots.

De groene punten duiden polymerisatie aan en de roze punten duiden depolymerisatie aan. Catastrofe-gebeurtenissen worden aangegeven door pijlpuntjes. Deze grafieken laten zien dat de microtubulus in de mutant langer is en minder catastrofes vertoont dan de microtubulus van het wildtype.

Daarnaast zijn de polymerisatie- en depolymerisatiesnelheden, bepaald op basis van de hellingen van de stijgende en dalende microtubulislengtes, verlaagd in de mutant vergeleken met het wildtype. Metingen van de microtubulidynamiek onthullen bovendien dat de microtubuli in de mutantcel een verminderde dynamiek vertonen vergeleken met het wildtype. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen de preparatie van het objectglas, het laden van de cellen en de beeldacquisitie in 30 minuten worden uitgevoerd, wat betekent dat er op één dag veel verschillende monsters kunnen worden afgebeeld.

De objectglaskamers kunnen vooraf worden gemaakt en bewaard voordat Concanavalin A wordt toegevoegd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gistcellen in eenvoudige objectglaskamers kunnen worden gestabiliseerd, hoe er in vier dimensies kan worden geïmageerd en hoe microtubuli-dynamiek in levende cellen kan worden gemeten. Naast microtubuli kan deze procedure worden aangepast om de dynamiek van andere fluorescentie-gelabelde eiwitten in levende gistcellen te meten over tijdsperioden variërend van seconden tot uren.