Name: Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Leer eiwitbinding aan F-actin meten door co-sedimentatie voor celbiologisch onderzoek. Deze methode bepaalt bindingsaffiniteit met SDS-PAGE-analyse en ultracentrifugatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant HL127711 naar AVK.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De actin co-sedimentatie test is een eenvoudige techniek die snel kan bepalen of een eiwit F-actine bindt. Met enkele wijzigingen kan de techniek ook worden gebruikt om de affiniteit van de interactie te meten. Naast de punten die in het bovenstaande protocol zijn opgeworpen, dienen de volgende problemen in aanmerking te komen bij het ontwerpen, uitvoeren en interpreteren van de test. Proteïne van belang Vers bereid of bevroren eiwit kan in de test worden gebruikt. Als bevroren eiwit wordt gebruikt, wordt het sterk aanbevolen dat de resultaten worden vergeleken met vers (nooit bevroren) eiwitten om ervoor te zorgen dat het bevriezen geen invloed heeft op F-actin binding. G-actin Bron Veel pelleteringsexperimenten gebruiken G-actine geïsoleerd van spier door zijn relatieve overvloed. Er zijn drie belangrijkste actinisotypes in zoogdieren - alfa, bèta en gamma - die opmerkelijk gelijkwaardig zijn (&gt; 90% sequentie identity). Niettemin zijn er functionele verschillen tussen de isotypen 12 , 13 . Indien mogelijk, moet het G-actin isotype dat in de bindingsassay gebruikt wordt, overeenkomen met het in vivo isotype. Bijvoorbeeld, als een eiwit in de skeletspier wordt uitgedrukt, is alpha-actine de beste keuze; Als een eiwit wordt uitgedrukt in fibroblasten, wordt beta-actine aanbevolen. Phalloidin Gebruik Aangezien phalloidin F-actine bindt, kan het de binding van sommige F-actine bindende eiwitten blokkeren of zelfs blokkeren ( bijv. Phalloidin blokken cofiline van binding aan actinfilamenten) 14 . Zo moet phalloidin met voorzichtigheid worden gebruikt en de resultaten vergeleken met monsters die niet met phalloidine behandeld zijn, indien mogelijk. Hoge Achtergrond Het is niet ongewoon dat eiwitten sedimenten in afwezigheid van F-actine ( Figuur 1A , geen F-actine pelletmonsters). Echter, hoge niveaus van achtergrond sedimentatie kunnen true actin co-sedimentatie maskeren en het moeilijk maken, of niet onmogelijk, te bepalen of een eiwit F-actine bindt of de affiniteit van de interactie meet. Het toevoegen van polidicanol aan de reactiebuffer (stap 4.1) kan de achtergrond aanzienlijk verminderen en is een makkelijke oplossing. Als dat de achtergrond niet vermindert, kan het bijstellen van de reactiebuffer, zoutconcentratie en / of incubatietemperatuur helpen. Bindende Curve Om een ​​bindingscurve te genereren, is het nodig om de concentratie van het eiwit van belang of het F-actine over een reeks reacties te variëren. In de praktijk is het gemakkelijker en beter om F-actine bij een vaste concentratie te handhaven en de concentratie van het eiwit van belang te variëren. Het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie ( bijv. 2 μM) in de pelleteringsbepaling beperkt de niet-specifieke inhaling bij hogere concentraties van F-actine en voorkomtDepolymerisatie bij lagere (&lt;0,5 μM) concentraties van F-actine. Depolymerisatie kan voorkomen worden met gebruik van phalloidine, hoewel dit een mogelijke complicerende factor in het systeem introducert (zie stap 3.3 en hoger). Het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie maakt het ook mogelijk om de F-actin pellet over de monsters te vergelijken (en normaliseren) en om mislukte experimenten te identificeren ( dwz waar de F-actin pellet zeer variabel is, waardoor analyses over concentraties voorkomen). Tenslotte, het handhaven van F-actine bij een vaste concentratie maakt het mogelijk om te bepalen of de binding aan het actinfilament coöperatief is ( Figuur 1C ). Verzadigde Binding Zoals bij alle bindende experimenten is het van cruciaal belang dat de binding aan F-actine verzadigd is en dat de concentratie van eiwit plus F-actine plateaus ( Figuur 1C ). Zonder een plateau is het niet mogelijk om een ​​nauwkeurige dissociatie-evenwichtskonstante te berekenen. Zo, hetHet is belangrijk om de verdovingsreeks die moet worden getest, zorgvuldig te plannen en om altijd hogere concentraties eiwitten te bevatten ( dwz ten minste 5- tot 10 keer hoger dan de verwachte K d ). Bindende analyse Om de gemeten dissociatieconstanten concluderend te zijn, moet de test worden uitgevoerd met behulp van een F-actin concentratie die de concentratie van bindingsplaatsen op F-actine toelaat voor het belang van het eiwit veel lager dan de affiniteit. Om te controleren of aan dit criterium is voldaan, schat de concentratie bindingsplaatsen van B max . Bijvoorbeeld, als [F-actin] 2 μM en Bmax = 0,5 was, dan [bindingsplaatsen] ≈ 1 μM. De K d moet ten minste 5- tot 10-voudig groter zijn dan [bindingsplaatsen]. Als de gemeten Kd van dezelfde orde van grootte als [bindingsplaatsen] is, dan is het mogelijk dat de waargenomen bindingscurve een titratie van high affiniteitsbindende si vertegenwoordigtTes dan een echte bindende isotherm. Als dit wordt waargenomen, herhaal de test met een 10-voudige lagere F-actin concentratie om een ​​nauwkeurige affiniteit te meten. Voor interacties met hoge affiniteit kan falloidine stabilisatie (stap 3.3) nodig zijn om een ​​F-actin concentratie te bereiken die laag genoeg is om nauwkeurig affiniteit te meten. Tenslotte zijn er fundamentele beperkingen met de co-sedimentatie-analyse die onderzoekers moeten bewust zijn bij het uitvoeren en evalueren van de test. Het belangrijkste is dat de co-sedimentatie-analyse geen echte evenwichtskonstante produceert. De producten van binding ( dat wil zeggen eiwit plus F-actine) worden gescheiden van de reactanten tijdens centrifugeren, waarna de producten dan kunnen dissociëren om een ​​nieuw evenwicht te creëren. Als gevolg daarvan kan de co-sedimentatie-analyse misverwerkende of onvoldoende detecties voor lage-affiniteit detecteren. Aangezien veel actine-bindende eiwitten een lage ( d.w.z. micromolaire) affiniteit voor F-actine hebben, een negatief resultaat ( <eM&gt; dat wil zeggen geen detecteerbare binding) in de test betekent niet noodzakelijk dat een eiwit niet F-actine bindt. Als alternatief zijn TIRF-microscopie-gebaseerde bindingen met enkelfilamentbindingen gevoeliger en nauwkeuriger voor het bepalen van een dissociatieconstante (voor recensies op deze techniek, zie referenties 15,16 ). Ondanks deze beperkingen is de pelletietest binnen de middelen van de meeste onderzoekers en is een effectief instrument om te bepalen of een eiwit F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet.

Actin is een essentieel cytoskeletaal eiwit dat een cruciale rol speelt bij meerdere cellulaire processen, waaronder motiliteit, samentrekking, adhesie en morfologie 1 . Actin bestaat in twee vormen: monomeer globair actine (G-actine) en gepolymeriseerd filamenteuze actine (F-actine). Binnen de cellen wordt de F-actin organisatie gecontroleerd door een grote verzameling eiwitten die de nucleatie, groei, crosslinking en demontage van actinfilamenten 2 , 3 , 4 regelen. Echter, hoe meerdere actine-bindende eiwitten samenwerken om de actin netwerkorganisatie te regelen is nog steeds grotendeels onduidelijk. De meting van eiwit-eiwit interacties is een belangrijke aanpak om te begrijpen hoe eiwitten hun effect op cellulaire gedrag op het biochemische niveau uitoefenen. Veel verschillende analyses kunnen worden gebruikt om interacties tussen gezuiverde eiwitten te detecteren.Gemeenschappelijke benaderingen voor oplosbare eiwitten omvatten aftrekkingen, fluorescentie polarisatie, isotherme titratie calorimetrie en oppervlakte plasmon resonantie. Het is van belang dat alle van deze analyses eiwitten oplosbaar zijn en dus moeilijk kunnen worden aangepast voor gebruik met een polymeer, filamentvormig eiwit, zoals F-actine. Hier beschrijven we een techniek - de actin co-sedimentatie, of pelletering, analyse - om te bepalen of een eiwit of eiwit domein F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet. De actinpelletingassay is een relatief eenvoudige techniek die geen speciale apparatuur nodig heeft, afgezien van een ultracentrifuge. Alle reagentia kunnen worden gemaakt, met inachtneming van kennis van basis biochemie, of gekocht. Zodra bindend is aan F-actine is vastgesteld, kan de test gebruikt worden om de schijnbare affiniteit te meten ( dwz de dissociatie-evenwichtskonstante) 5 . Ook, zodra een affiniteit is vastgesteld, wordt de pelletietestIs een handig hulpmiddel om te meten hoe veranderingen in het eiwit van belang ( dat wil zeggen posttranslatie modificaties, mutaties of ligandbinding) de interactie met F-actine 6 beïnvloeden. De techniek heeft beperkingen (zie de discussie ) waaraan de onderzoeker zich moet bewust zijn voordat hij de test probeert.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&beta;-aminoethyl ether)-N,N,N'N'-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van eiwitbinding aan f-actine door co-sedimentatie

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamenteuze actine (F-actin) organisatie binnen cellen wordt gereguleerd door een groot aantal actine-bindende eiwitten die actin nucleatie, groei, cross-linking en / of demontage beheersen. Dit protocol beschrijft een techniek - de actin-co-sedimentatie, of pelletering, analyse - om te bepalen of een eiwit- of eiwitdomein F-actine bindt en de affiniteit van de interactie meet ( dwz de dissociatie-evenwichtskonstante). In deze techniek wordt eerst een eiwit van belang geïncubeerd met F-actine in oplossing. Daarna wordt differentiële centrifugatie gebruikt om de actinfilamenten te sedimenteren en het gepelleteerde materiaal wordt geanalyseerd door SDS-PAGE. Als het eiwit van belang F-actine bindt, komt het samen met de actinfilamenten. De producten van de bindingsreactie ( dwz F-actine en het eiwit van belang) kunnen gekwantificeerd worden om de affiniteit van de interactie te bepalen. De actinpelletingassay is een eenvoudige techniek om te bepalenAls een eiwit van belang F-actine bindt en om te beoordelen hoe veranderingen in dat eiwit, zoals ligandbinding, de interactie met F-actine beïnvloeden.

We onderzochten αE-catenin homodimer binding aan F-actine in de co-sedimentatie assay. Sinds vorige experimenten hebben aangetoond dat de affiniteit van aE-catenin homodimeer voor F-actine ongeveer 1 μM en de B max nabij 1 11 is , hebben we de test uitgevoerd met een lage concentratie van F-actine (0,2 μM in plaats van 2 μM; de discussie). Aangezien 0,2 μM onder de kritische concentratie ligt, werd phalloidine toegevoegd om het F-actin te polymeriseren gepolymeriseerd uit konijnskeletspier G-actine (stap 3.3). Toenemende concentraties van aE-catenine homodimeer (0,125-12,0 μM) werden geïncubeerd in aanwezigheid of afwezigheid van 0,2 μM F-actine. De monsters werden gecentrifugeerd en de resulterende pellets werden geanalyseerd ( Figuur 1A ). Zoals verwacht, vergelijkt de aE-catenin-homodimeer die samen met F-actine boven de achtergrond ( Figuur 1A , de F-actine-pelletmonsters aan de geen-F-acTin pellet monsters). BSA werd uitgevoerd als een negatieve controle ( Figuur 1B ). Gebonden eiwit werd gekwantificeerd en geproduceerd over vrij eiwit om de affiniteit van de interactie te berekenen ( Figuur 1C ). De getekende gegevens passen het beste bij een Hill-vergelijking. De berekende K d was 2,9 μM, de B max was 0,2 en de heuvelcoëfficiënt (h) was 4,8. Aldus bindt aE-catenine homodimeer F-actine coöperatief met een lage micromolaire affiniteit, consistent met eerdere werkzaamheden (een Kd van 2,9 μM versus ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figuur 1: Hoge snelheid F-actine co-sedimentatie assay. ( A ) Verhoging van concentraties (0,125-12,0 μM) αE-catenine homodimeer werden geïncubeerd met (linker panelen) of zonder (rechter panelen) 0,2 μM F-actine gestabiliseerd met phalloidin. Ze werden 30 minuten geïncubeerd bij RT en gecentrifugeerd. Het totaal (7,5% van het uitgangsmateriaal) en gepelleteerd materiaal (50% van het gepelleteerde materiaal) werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie-kleurstof. ( B ) 4 μM BSA werd uitgevoerd als een negatieve controle. Totale en pelletsteekproeven, met (+) of zonder (-) F-actine, werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie-kleurstof. ( C ) Verbonden αE-catenine (μM / μM actine) van A werd getekend tegen vrij αE-catenin (μM), en de data past bij een Hill-vergelijking (rode lijn). De K d , B max en Hill coëfficiënt (h) zijn vermeld. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figuur 2: Actin pelleting kwantificatie </sTrong&gt; - flow chart. In dit schema worden de belangrijkste stappen beschreven in sectie 5, met voorbeelden van totaal- en pelletmonsters ( A , CE ) en de standaardcurve ( B ) die wordt gebruikt voor kwantificering. 5.13 stappen: 1 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang in de totale monsters (A). 2 ) Genereer een standaardkromme door de bandintensiteit tegen eiwitmassa (B) te plotten. 3 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang die mede-sedimenteert met F-actine ( C ). 4 ) Meet de hoeveelheid eiwit van belang die in de afwezigheid van F-actine ( D ) pelleteerde. 5 ) Subtract D van C om de hoeveelheid eiwit die gebonden is aan F-actine te bepalen. 6 ) Meet de hoeveelheid F-actine in elke pellet (E), bereken de gemiddelde hoeveelheid F-actine per monster en verdeel elk monster op het gemiddelde (de onderstaande aantallen tonen de verhouding). 7 )Voor elk monster verdeel de hoeveelheid gebonden eiwit (berekend in stap 5) door de F-actin pelletsverhouding (berekend in stap 6) om af te stemmen op verschillen in de pellet. 8 ) Gebruik de standaardkromme ( B ) om de hoeveelheid (massa) van genormaliseerd gebonden eiwit in elk monster te berekenen (stap 7). 9 ) Bepaal de concentratie van vrij eiwit en gebonden proteïne om een ​​bindende bocht te creëren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een methode om het vermogen van een eiwit om te co-sedimenteren met filamenteuze actine (F-actine) te testen en, als de binding wordt waargenomen, de affiniteit van de interactie te meten.

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Het algemene doel van deze techniek is om de eigenschap van een eiwit om samen met filamenteus actine te sedimenteren te testen, en indien binding wordt waargenomen, de affiniteit van de interactie te meten. Deze methode is een eenvoudige techniek om te bepalen of een eiwit aan F-actine bindt. De voordelen van deze techniek zijn dat er, afgezien van een ultracentrifuge, geen gespecialiseerde apparatuur nodig is en dat alle reagentia zelf kunnen worden gemaakt of kunnen worden gekocht.Begin met het voorbereiden van hooggezuiverd eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Bepaal de eiwitconcentratie door de absorptie bij 280 nanometer te meten. Centrifugeer het eiwit vlak voor gebruik kortstondig met hoge snelheid om aggregaten van onoplosbaar eiwit te verwijderen.Als de oplosbaarheid een probleem vormt, meet dan de proteïneconcentratie opnieuw na centrifugatie. Neem vervolgens een aliquot globulair actine of g-actine uit de vriezer van -80 °C en ontdooi deze snel. Voeg 10X polymerisatiebuffer toe aan het G-actine en verdun dit met water tot een uiteindelijke concentratie van 1X.Incubeer het mengsel gedurende één uur bij kamertemperatuur om de actine te laten polymeriseren. Bewaar na polymerisatie het gepolymeriseerde filamenteuze actine, of F-actine, in oplossing bij vier graden celsius, waar het enkele weken stabiel blijft. Voordat het F-actine na opslag wordt gebruikt, moet de buis voorzichtig enkele keren worden omgekeerd of getikt om er zeker van te zijn dat alle actine is opgelost en gelijkmatig is verdeeld in de oplossing.Stel de binding van het eiwit van belang aan F-actine vast zoals beschreven in het tekstprotocol. Zodra de binding aan F-actine is vastgesteld, wordt het eiwit serieel verdund om een concentratiereeks te maken die zeven tot acht monsters bevat op twee keer de uiteindelijke te testen concentratie. Als het te testen bereik bijvoorbeeld 0,1 tot acht micromolair is, bereid dan verdunningen van 16, acht, vier, twee, één, 0,5 en 0,2 micromolair eiwit in 1X reactiebuffer in microcentrifugebuisjes.Verdun het eiwit van belang tot de uiteindelijke concentratie in 1X reactiebuffer in ultracentrifugebuisjes. Voeg F-actine toe aan de betreffende monsters. Incubeer vervolgens alle monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder na 30 minuten een vijfde van elk monster en meng dit met monsterbuffer. Dit zijn de totale monsters. Plaats de ultracentrifugebuisjes in de rotor en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 100,000 ×g en 4 °C.Verwijder na centrifugatie driekwart van het supernatant uit elke buis en meng dit met 4X monsterbuffer in een aparte microcentrifugebuis. Dit zijn de supernatantmonsters. Verwijder het resterende supernatant met een gelladingtip, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet niet wordt verstoord.Voeg vervolgens 1X monsterbuffer toe aan alle buisjes en incubeer gedurende ten minste vijf minuten bij kamertemperatuur. Tritureer na incubatie het monster acht tot tien keer met een p200-pipetpunt, waarbij het pelletgebied van het buisje continu wordt gewassen. Schraap de pipetpunt tijdens het tritureren voorzichtig over het pellet om de resuspensie te vergemakkelijken.Breng het opnieuw gesuspendeerde eiwit over naar een microcentrifugebuisje. Dit zijn de pelletmonsters. Analyseer ten slotte de totale monsters en de pelletmonsters via SDS-PAGE.Beeld de met coomassie gekleurde gels af met een imaging-systeem dat eiwitbandintensiteiten over een breed en lineair bereik meet. Toenemende concentraties van alpha e catenin homodimeer werden geïncubeerd in de aanwezigheid of afwezigheid van 0,2 micromolar F-actin. De monsters werden gecentrifugeerd en de resulterende pellets werden geanalyseerd.Zoals verwacht co-sedimenteerde de alpha e catenin homodimeer met F-actine boven de achtergrondwaarde. BSA werd gebruikt als negatieve controle. Gebonden eiwit werd gekwantificeerd en uitgezet tegenover vrij eiwit om de affiniteit van de interactie te berekenen.Deze techniek kan in vier uur of minder worden uitgevoerd als F-actine al gepolymeriseerd is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het van cruciaal belang dat het supernatant snel na centrifugatie wordt verwijderd en het pellet volledig wordt geresuspendeerd. Zoals bij alle bindingsexperimenten is het essentieel dat de binding aan F-actine verzadigd is en dat de zuiverheid plus F-actine een plateau bereikt; zonder plateau is het niet mogelijk om een nauwkeurige associatie-evenwichtsconstante te berekenen.Er zijn fundamentele beperkingen aan de co-sedimentatie-assay waar onderzoekers zich bewust van moeten zijn; het belangrijkste is dat het geen werkelijke evenwichtsconstante oplevert, waardoor interacties met een lage affiniteit verkeerd berekend kunnen worden of niet gedetecteerd worden. Ondanks deze beperkingen is de co-sedimentatie-assay een toegankelijk en effectief instrument om vast te stellen of een eiwit bindt aan F-actine en om de affiniteit van de interactie te meten.

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Eiwitten binden aan filamenteuze actine (F-actine) door middel van verschillende actine-bindend modules. In deze video laten we zien de procedure van de actine co-sedimentatie, die een in vitro test routinematig gebruikt om eiwitten of specifieke domeinen die binden F-actine te analyseren.

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

We passen label-free eiwit interactie analyse met behulp van Biacore X100 voor structuur-functie analyse van de binding van verschillende cystatine B mutanten te papaïne door kinetische karakterisering. Kalibratie-vrije concentratie analyse (CBVC) meet de concentratie van het eiwit met behoud van bindende activiteit, zonder de noodzaak van een standaard curve. We tonen aan dat de bevestiging van de concentraties met behulp van CFCA verhoogt de betrouwbaarheid van de kinetische analyse en dat...

Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

Polymerisatie van FtsZ is essentieel voor bacteriële celdeling. In dit rapport beschrijven we eenvoudige protocollen om de polymerisatieactiviteit van FtsZ te monitoren en bespreken we de invloed van de buffersamenstelling. De protocollen kunnen worden gebruikt om de interactie van FtsZ met regulerende eiwitten of antibacteriële geneesmiddelen die de polymerisatie van FtsZ beïnvloeden, te bestuderen.

FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen

Dit protocol vergelijkt de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rho-familie GTPases, inclusief Rac1. In vivo, concurreren Rac1-bindende eiwitten voor een enkele bindingsinterface, waarvan de conformatie wordt bepaald door een gebonden nucleotide. Het nucleotide is zowel belangrijk als moeilijk experimenteel te beheersen, vanwege de hoge hydrolysesnelheid.

Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

We presenteren een methode die membraan eiwit zuivering en reconstitutie in peptidiscs combineert in een enkele chromatografische stap. Biotinyated steigers worden gebruikt voor directe oppervlakte bevestiging en meting van eiwit-ligand interacties via biolayer interferometrie.

PeptiQuick, een in één stap incorporatie van membraan eiwitten in Biotinylated Peptidiscs voor gestroomlijnde eiwit binding assays

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Dit protocol beschrijft hoe actinekometen op de oppervlakken van kralen kunnen worden geproduceerd met behulp van in de handel verkrijgbare eiwitingrediënten. Dergelijke systemen bootsen de uitstekende structuren in cellen na en kunnen worden gebruikt om fysiologische mechanismen van krachtproductie op een vereenvoudigde manier te onderzoeken.

Reconstitutie van op actine gebaseerde motiliteit met commercieel verkrijgbare eiwitten

Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Van veel intrinsiek ongeordende eiwitten is aangetoond dat ze deelnemen aan de vorming van zeer dynamische biomoleculaire condensaten, een gedrag dat belangrijk is voor tal van cellulaire processen. Hier presenteren we een op beeldvorming gebaseerde methode met één molecuul voor het kwantificeren van de dynamiek waarmee eiwitten met elkaar interageren in biomoleculaire condensaten in levende cellen.

Meting van de dynamiek van eiwitinteracties in biomoleculaire condensaten

Leer eiwitbinding aan F-actin meten door co-sedimentatie voor celbiologisch onderzoek. Deze methode bepaalt bindingsaffiniteit met SDS-PAGE-analyse en ultracentrifugatie.

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Meer video's verkennen